松墨天牛肌鈣蛋白T基因全長cDNA克隆及分析

吳華俊，許 雯，林 同

(華南農業大學林學院，廣東廣州510642)

松墨天牛(Monochamus alternatus Hope)又名松褐天牛，松天牛，屬于鞘翅目(Goleoptera)，天?？?Cerambycidae)，是重要的針葉樹害蟲，主要危害馬尾松、油松、黑松等樹干和枝條的韌皮部和木質部，嚴重影響松樹的生長.同時，也是松材線蟲萎蔫病(Bursaphelenchus xylophilus)的主要傳播媒介，此病是松樹的毀滅性病害，已經對我國松樹森林資源造成嚴重危害[1－2].

肌鈣蛋白(Troponin，Tn)是與骨骼肌和心肌收縮有關的調節蛋白，主要調節肌肉的收縮和舒張.肌鈣蛋白是橫紋肌的結構蛋白，存在于肌原纖維的細絲中，由3個結構不同亞基——肌鈣蛋白I(TnI)、肌鈣蛋白T(TnT)和肌鈣蛋白C(TnC)組成[3－4].TnT分子質量為37 ku，可能為不對稱蛋白結構，是原肌球蛋白的結合亞基[5].

由于昆蟲飛行肌以很高的收縮頻率運行，肌鈣蛋白的激發和松弛的調節就發揮尤其重要的作用.TnT轉錄本與收縮性能聯系緊密.Marden et al[6]研究表明，TnT轉錄本混合物與梅利蜻蜓(Libellula pulchella)自由飛行中的翅膀震動頻率有很大的相關性.本研究從已經構建好的松墨天牛cDNA文庫中篩選到TnT基因的部分cDNA序列，通過cDNA末端快速擴增(Rapid amplification of cDNA ends，RACE)得到了該基因的cDNA全長序列，以期為闡明松墨天牛肌肉生理學和運動性能提供依據.

1 材料與方法

1.1 材料

松墨天牛幼蟲由廣東省林科院惠贈(采自廣州市蘿崗區馬尾松次生林).用人工飼料在25℃、相對濕度70% －75%、黑暗條件下飼養至成蟲[7].

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取與cDNA的合成 采用UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒提取松墨天?？俁NA.總RNA經純化后，用瓊脂糖凝膠電泳檢測其質量，并用微量紫外分光光度儀(Nanodrop 2000)檢測其純度并定量，置于－80℃保存備用.反轉錄反應按照PrimeScript?RT reagent Kit With gDNA Eraser說明書進行，獲得第一鏈cDNA，用于3'RACE，置于－20℃保存備用.

1.2.2 引物設計和3'RACE擴增 根據已構建的松墨天牛cDNA文庫[8]，獲得了肌鈣蛋白的5'端序列(GenBank:JZ144485).本研究在此基礎上進行3'RACE擴增，以獲得肌鈣蛋白基因全序列.用DNAStar中的Primer select軟件設計特異性引物(Troponin Outer:AGAGGAGGAGGAAGAAGAGGAGAT;Troponin Inner:CAACGCGCAAAGGAAGAGGAAGAC)，結合試劑盒提供的2個下游引物3'RACE outer Primer(TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT)和 3'RACE inner Primer(CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG)進行巢式PCR.首先用通用引物3'RACE Outer Primer和特異性引物Troponin Outer進行第1次Outer PCR擴增，具體的PCR反應條件為:94℃預變性3 min，94℃解鏈30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，20個循環，72℃延伸10 min.反應完畢后取1 μL反應產物，使用通用引物3'RACE Inner PCR和特異性引物Troponin Inner進行巢式PCR的Inner PCR擴增.反應進行30個循環，其它條件同第1次Outer PCR擴增.PCR產物經由2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收目的DNA片段，與PUCm-T載體連接，將連接產物轉化DH5α感受態細胞，進行AMP抗性藍白斑篩選，挑陽性菌落提取質粒.經PCR鑒定后測序.

1.3 生物信息學分析

1.3.1 基因及蛋白質特性分析 用 NCBI在線工具 ORF finder(http://www.ncbi.nlm.nib.gov/gorf/grof.html)搜索開放閱讀框，TMHMM分析蛋白質跨膜結構域，NetPhos(http://www.cbs.dtu.dk/services/Net-Phos/)預測磷酸化修飾位點，丹麥科技大學(DTU)的CBS服務器上的SignalP 4.0 Server程序(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預測信號肽，NetOGlye軟件分析糖基化修飾，ProtScale程序分析疏水性，COILS Server(http://www.ch.embnet.org/software/COILS_form.html)預測卷曲螺旋，SABLE 軟件(http://sable.cchmc.org/)分析二級結構，由視圖工具POLYVI-EW將預測結果轉化為圖形形式輸出.

1.3.2 構建系統發育樹 通過 NCBI(http://www.Ncbi.nlm.Nih.gov/)GenBank數據庫檢索昆蟲肌鈣蛋白氨基酸序列，用DNAMAN軟件對松墨天牛肌鈣蛋白及其他昆蟲肌鈣蛋白進行同源性比對;用Clustal X軟件和MEGA 4.0軟件構建系統發育樹(NJ法).

1.4 RT-qPCR 檢測

以肌鈣蛋白基因在成蟲的表達量為標準參量，以微管蛋白(β-actin)基因為內參基因，無菌超純水為陰性對照，采用RT-qPCR(SYBR Green)檢測肌鈣蛋白基因在幼蟲、蛹、成蟲各部位的表達量.所用引物為:上游:CGATGAGGAAAGGAAGATGG;下游:AAGTTGGGGCCTTTGTTCTT.RT-qPCR反應程序:95℃預變性5 min;95℃解鏈10 s，60℃延伸20 s，進行40個循環.反應在LightCycler 480熒光定量PCR儀上進行，設cDNA樣品3次重復，反應結束后采集目標基因的Ct值和2個內參基因的Ct平均值，利用2－ΔΔCT相對定量法計算相對表達量.

2 結果與分析

2.1 基因克隆

將3'RACE測序結果去除載體序列部分，并與已知序列拼接獲得松墨天牛肌鈣蛋白基因的cDNA，命名為MaTnT(GenBank:KJ756400)，全長為1531 bp，開放閱讀框(ORF)為1020 bp，編碼339個氨基酸(圖1)，推測的編碼蛋白等電點為9.26，分子質量為37.29 ku.

圖1 MaTnT基因全長及推導的氨基酸序列Fig.1 Nucleotide and deduced amino acid sequences of MaTnT

2.2 同源性比對及進化樹構建

用DNAMAN軟件做出MaTnT與嗜鳳梨果蠅(Drosophila ananassae)、果蠅(Drosophila grimshawi)、黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)、印田鱉蝽(Lethocerus indicus)、華尺蠖(Biston betularia)、家蠶(Bombyx mori)、家白蟻(Coptotermes formosanus)、褐飛虱(Nilaparvata lugens)、柑橘鳳蝶(Papilio xuthus)、野桑蠶(Bombyx mandarina)、大紅班蝶(Danaus plexippus)和點蜂緣蝽(Riptortus pedestris)等12種昆蟲的Tn氨基酸序列同源性比對(圖2).MaTnT與圖2中12種昆蟲Tn同源性為87% －88%，其中與褐飛虱、黑腹果蠅、野桑蠶等10種昆蟲的同源性為88%;與家白蟻、大紅斑蝶的同源性為87%.

由MEGA 4.0軟件構建的基于這12種昆蟲Tn的系統發育樹表明:松墨天牛是一個獨立的分支，與家蠶(Bombyx mori)、果蠅(Drosophila grimshawi)等8種昆蟲遺傳距離相對較近;而與家白蟻、褐飛虱、印田鱉蝽(Lethocerus indicus)、華尺蠖等(Biston betularia)4種昆蟲遺傳距離相對較遠(圖3).由于松墨天牛是鞘翅目昆蟲，其他昆蟲都不屬于鞘翅目，這一結果與這些昆蟲的傳統分類地位是一致的.

2.3 跨膜結構域及翻譯后修飾分析

通過MaTnT的磷酸化修飾位點預測發現，Tn分值＞0.5的磷酸化位點有:絲氨酸(Ser)磷酸化位點8個，蘇氨酸(Thr)磷酸化位點9個，酪氨酸(Tyr)磷酸化位點3個，共計20個磷酸化位點，這些位點相對均勻地分布在整個多肽鏈中(圖1).NetOGlye預測表明，MaTnT在150、161、170氨基酸位點存在N-糖基化修飾.

圖2 MaTnT與其他12種昆蟲Tn氨基酸序列比對Fig.2 Amino acid sequence alignment of MaTnT and Tns from other insects

2.4 MaTnT的二級結構、卷曲螺旋與疏水性分析

MaTnT二級結構為混合型，N末端和C末端區域都包含了螺旋和不規則卷曲兩種形式，其中 α-螺旋占 80.53%，卷曲占 19.47%，它們構成了MaTnT蛋白的結構元件，無β-轉角存在.卷曲螺旋是由2股或以上的α-螺旋相互纏繞形成的超二級結構，是控制蛋白質寡聚化的元件，也是一種簡單的三級結構.MaTnT一共有14個卷曲螺旋.

在MaTnT 175－200氨基酸位存在一個明顯的疏水性區域，但整個多肽鏈中大多數氨基酸的分值較低，親水性氨基酸多于疏水性氨基酸，故MaTnT屬于親水性氨基酸.

2.5 MaTnT 基因的表達

圖3 基于昆蟲Tn氨基酸序列的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of insect based on their amino acid sequences of Tn

利用RT-qPCR分析MaTnT基因在松墨天牛不同發育階段和成蟲不同部位的相對表達量，結果表明，MaTnT基因在成蟲的表達量最高，在幼蟲的表達量最低，蛹和幼蟲的表達量分別是成蟲的0.95倍和0.33倍，基因表達在三者之間差異顯著(P＜0.05)(圖4).MaTnT基因在成蟲的頭部、胸部、觸角、腹部、足和觸角中均有表達且有顯著差異(P＜0.05)，在觸角的表達量遠高于其他部位，胸部的表達量最低(圖5).

圖4 松墨天牛不同蟲態MaTnT基因表達量RT-qPCR分析Fig.4 The relative expression level of MaTnT in developmental stages of M.alternatus detected by RT-qPCR

圖5 松墨天牛成蟲不同部位中MaTnT基因表達量RT-qPCR分析Fig.5 The relative expression level of MaTnT in different parts of M.alternatus adults detected by RT-qPCR

3 討論

Tn基因的數量和分布在多細胞生物中是多變的.在哺乳動物中，TnI和TnT分別由3個基因編碼，并且TnT-TnI是成對組裝[9－10]，然而在昆蟲中，TnT基因由單個基因編碼[11－12].目前對昆蟲 TnT基因功能研究的不多，只有梅利蜻蜓(Libellula pulchella)TnT基因研究的報道[6].本研究克隆了松墨天牛肌鈣蛋白基因，在NCBI上的Blast比對結果表明該基因是TnT基因(MaTnT)，開放閱讀框為1020 bp，編碼339個氨基酸，推測的分子質量為37.29 ku.

跨膜結構域是膜中蛋白和膜脂結合的主要部位，它可能定位于膜的錨定蛋白或離子通道蛋白等，也可能作為膜受體起作用.通過跨膜結構域預測可以了解蛋白質的結構、功能及在細胞中的作用部位.利用TMHMM軟件對MaTnT的跨膜結構域分析，結果表明:MaTnT的整條肽鏈都位于膜外，不存在跨膜結構域.SignalP分析表明，MaTnT不含信號肽，說明該蛋白質屬于定位在細胞質基質或細胞器基質中的蛋白質，由于不分泌到胞外，因而不屬于膜蛋白或分泌蛋白，與TMHMM分析結果一致.跨膜結構主要是以α-螺旋為主，由于MaTnT不存在跨膜結構域，所以MaTnT的卷曲螺旋可能是其他功能域.

肌鈣蛋白是Ca2+的受體.RNA選擇性剪切產生TnT轉錄本的變化，從而引發梅利蜻蜓飛行肌在亞細胞和整個肌肉水平上收縮性能的變化[6].TnT的相對豐度與內肌肉纖維Ca2+的敏感性(10倍變化范圍)、力量最大值(3倍變化范圍)、最大功率系數正相關，也與翅膀震動頻率和振幅正相關.TnT的變化可能會對這些參數產生影響，或者說TnT是顯示一整套共同調控分子變化的指標.單個基因的選擇性剪切可能引起更大范圍內在分子、組織和整個機體水平上收縮性能的改變.TnT選擇性剪切比例的變化可能是肌肉收縮性能變化的機理，因為相當少量轉錄本相對豐度的很小變化會引起收縮性能很大的改變[6].現在還不知道MaTnT選擇性剪切是不是導致這些效應的唯一分子因素，或者MaTnT剪切的變化由一套其它分子因素所調節.

肌鈣蛋白主要通過TnT結合于原肌球蛋白上(tropomyosin)[13－14].由于兔子骨骼肌中TnT和原肌球蛋白交互調節表達[15]，因此MaTnT的變化可能伴隨著其它收縮和調節蛋白的改變，這些蛋白與MaTnT一起引發松墨天牛肌肉收縮行為.肌鈣蛋白基因在松墨天牛幼蟲、蛹和成蟲中都有表達，說明肌鈣蛋白基因在松墨天牛的整個發育過程中起重要作用;在成蟲觸角中表達最高，可能與觸角覓食、求偶中發揮的功能有關;在足中表達量也較高，這是與足的運動功能相適應的.

本研究獲得了松墨天牛的1個轉錄本，但梅利蜻蜓的飛行肌中含有由單一TnT基因轉錄而成的6種選擇性剪切轉錄本[6]，由此我們推測松墨天牛肌纖維中也有可能存在多種TnT轉錄本，它們與其它調控因子共同影響肌肉的收縮.但MaTnT有多少轉錄本，MaTnT轉錄的時空表達模式如何，以及MaTnT如何與原肌球蛋白互作等需要進一步研究.

綜上，昆蟲肌鈣蛋白基因的功能研究較少，很多內容具有不確定型，需要深入探討，本文首次克隆了松墨天牛肌鈣蛋白基因，并從生物信息學角度對基因進行了分析，以后的研究可以此為參考，闡明松墨天牛肌肉收縮和行為機理，以豐富昆蟲肌肉生理學內容.

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