LHβ亞基在羅非魚腺中的表達及精巢中細胞定位

吳風瑞 ，蘇咪咪，劉 勇，丁 彪，李文雍,2

(1. 阜陽師范學院 生物與食品工程學院, 安徽 阜陽 236037；2. 胎發育與生殖調節安徽省重點實驗室，安徽 阜陽 236037)

LHβ亞基在羅非魚腺中的表達及精巢中細胞定位

吳風瑞1,2，蘇咪咪1，劉 勇1,2，丁 彪1,2，李文雍1,2

(1. 阜陽師范學院 生物與食品工程學院, 安徽 阜陽 236037；2. 胎發育與生殖調節安徽省重點實驗室，安徽 阜陽 236037)

近年來大量研究表明魚類促性腺激素不僅在垂體中表達和分泌，性腺局部也是產生促性腺激素的場所。為驗證尼羅羅非魚LHβ是否也在性腺中表達，本研究采用RT-PCR方法檢測了LHβ亞基在羅非魚垂體、卵巢和精巢中轉錄水平，同時通過免疫組化的方法觀察了LHβ亞基在羅非魚精巢中表達的細胞類型。結果發現，除垂體外，LHβ亞基在羅非魚卵巢和精巢中均有表達，且表達于精原細胞、精母細胞和精子細胞中。本研究結果將為進一步揭示羅非魚促性腺激素功能提供基礎的理論依據，也對魚類的人工繁育具有重要意義。

LHβ亞基；RT-PCR；免疫組織化學；精巢；羅非魚

脊椎動物垂體分泌的促性腺激素包括促濾泡激素(Follicle-stimulatinghormone，FSH)和促黃體激素(Luteinizinghormone，LH)兩類，由結構亞基α和激素特異型亞基β構成的異質二聚體[1]。長期以來，人們都認為魚類促性腺激素僅在垂體中表達和分泌，受“下丘腦-垂體-性腺”管理功能軸調控。然而越來越多的研究表明，促性腺激素三個亞基不僅在垂體中表達，在魚類不同生長發育時期的性腺局部和其他組織也可檢測到其mRNA表達信號，如南方鲇[2]、 黑鯛[3]、 金頭海鯛[4]、 花鰻鱺[5]和半滑舌鰨[6]等，達到調節配子的發生、成熟和精子和卵子排放的目的。

尼羅羅非魚((Oreochromisniloticus))為熱帶魚類，隸屬鱸形目(Perciformes)、麗魚科(Cichlidae)，其成熟時間短(雄魚大約為半年，雌魚大約為8個月)，產卵周期短，是研究性別決定和性腺發育的好材料[7]。為研究羅非魚LHβ亞基在精巢中的表達及細胞定位，本研究采用RT-PCR結合半定量分析的方法檢測了LHβ亞基在羅非魚垂體和性腺中轉錄水平，利用免疫組織化學的方法對LHβ亞基mRNA在精巢中表達的細胞類型進行分析。本研究結果不僅表明促性腺激素的垂體外分泌是硬骨魚類中廣泛存在的現象，也為進一步研究促性腺激素在羅非魚性腺發育、配子成熟和釋放過程中的功能提供基礎的依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物和試劑

本實驗中所用羅非魚購自本地水產市場，雌雄均性成熟，于室內35×35×50cm3玻璃水族箱內暫養，自然光照。本實驗所用PCR引物由上海立菲生物技術公司合成，RNA提取試劑、Taq酶、DNaseI(RNasefree)購自Takara公司，其余均為國產分析純試劑。

1.2RT-PCR

提取羅非魚成魚垂體、性腺總RNA，經DNaseI(RNasefree)處理后逆轉錄合成第一鏈cDNA，采用RT-PCR的方法研究羅非魚LHβ亞基在垂體、卵巢和精巢中的表達。用LHβ正向引物(5′-GAATGCTCCTTGCTCTGATG-3′)和LHβ反向引物(5′-CCAGGTGGGCAATCGGGAAG-3′)、β-actin正向引物(5′-GGCATCACACCTTCTACAACGA-3′)和β-actin反向引物(5′-ACGCTCTGTCAGGATCTTCA′)擴增LHβ和β-actin開放閱讀框部分片段。反應體系為25μl，反應條件依次為：94 ℃預變性 3min，變性94 ℃ 30s，退火57 ℃ 30s，延伸72 ℃ 30s，PCR產物在1.2%瓊脂糖凝膠上電泳，用Bio-Rad公司凝膠成像系統成像，進行半定量分析，數據用3個平行實驗的平均值±標準誤表示，用GraphPadPrism5 (GraphPadSoftware,SanDiego,CA)進行相關分析，當P<0.05時，認為差異顯著，當P<0.01時，認為差異極顯著。

1.3 免疫組織化學

取羅非魚垂體和精巢組織，用固定液為Bouin氏液(飽和苦味酸75mL+ 甲醛25mL+ 冰醋酸 5mL)。材料常規包埋、連續切片，厚度為5μm。二甲苯脫蠟、梯度酒精脫水，1×PBS洗5次，再用3%H2O2室溫避光處理10分鐘以封閉內源性過氧化物酶，PBS清洗5次，血清封閉15min，滴加石斑魚LHβ抗體(其他實驗室惠贈)37 ℃孵育30min后，同時含有一張以與一抗同一來源的動物血清替代一抗的切片作為陰性對照，以羅非魚芳香化酶cyp19a1a抗體作為陽性對照。清洗后滴加羊抗兔辣根過氧化酶標記的二抗(博士德，中國武漢)室溫孵育30min，DAB(3,3N-DiaminobenzidineTertrahydrochloride，Sigma)顯色，蘇木素復染，返藍，脫水透明封片后，奧林巴斯BX51顯微成像。

2 結果

2.1 羅非魚LHβmRNA在垂體、卵巢和精巢中的表達

PCR結果表明，羅非魚LHβmRNA在垂體、卵巢和精巢中均具有表達水平，其在垂體中表達水平最高，卵巢次之，而在精巢中表達水平最低，結果如圖1所示。

圖1 羅非魚LHβ mRNA在垂體、卵巢和精巢中的表達模式。P，垂體；O，卵巢；T，精巢；+，陽性對照；-，陰性對照；底端為內參β-actin

隨后我們又采用了半定量分析對凝膠電泳圖進行光密度分析，羅非魚LHβmRNA在垂體中的表達水平大約是其在卵巢和精巢中的3-4倍(圖2)，且差異顯著(0.01

圖2 羅非魚LHβ mRNA在垂體、卵巢和精巢中的表達模式。圖中橫坐標示羅非魚垂體、卵巢、精巢組織，縱坐標為LHβ相對內參β-actin表達水平，*P<0.05

2.2 羅非魚LHβ在垂體和精巢中表達的細胞類型

免疫組織化學結果表明，LHβ在羅非魚垂體主要表達于近端部。而在精巢中，表達于精原細胞、精母細胞和精子細胞中。陽性對照cyp19a1a表達與該時期卵巢間質細胞，而陰性對照無顯色，結果如圖3所示。

3 分析與討論

硬骨魚類促黃體激素LH主要是由垂體產生和釋放，并通過血液運送到其靶器官。本研究通過RT-PCR方法發現羅非魚LHβ不僅在垂體中表達，在卵巢和精巢中也檢測到mRNA表達信號。結合我們前期[2]在南方鲇的研究和其他已有相關報道，我們認為這種垂體以外的促性腺激素的表達模式是硬骨魚類中普遍存在的現象。

圖3 羅非魚LHβ在垂體和精巢中表達的細胞類型。PI，中間部；PPD，近端部；RPD，喙部；SG，精原細胞；SC，精母細胞；SPT，精子；OC，卵母細胞；IS，間質細胞；OCV，卵巢腔，圖中40、100、200、400×示放大倍數

序列同源性分析表明，羅非魚LHβ氨基酸序列和石斑魚具有94%相似性[8]，特別是12個半胱氨酸殘基和N末端糖基化位點。Li等采用石斑魚LHβ多克隆抗體發現LHβ主要在石斑魚垂體近端部表達[8]，我們以該抗體為一抗通過免疫組織化學的方法發現羅非魚LHβ也表達于垂體近端部，表明此抗體在羅非魚也具有良好的特異性。進而我們又采用該抗體研究了LHβ在羅非魚精巢中表達的細胞類型，結果發現LHβ在羅非魚精巢生殖細胞如精原細胞、精母細胞和精子細胞中表達，以促進精子發生、成熟，提高精子質量[9]。在金頭海鯛中，通過原位雜交的方法發現LH在I、II和III期卵母細胞中表達，進一步暗示促黃體激素可以直接在性腺局部中產生并直接作用于性腺，促進配子的成熟和釋放。大量研究表明，許多性腺局部的旁分泌因子同促性腺激素一起組成性腺局部的信號網絡協調細胞通訊過程，共同促進性腺生殖細胞的最終成熟[10-12]?；诒狙芯亢推渌Y果，我們推測精巢中促黃體激素LH可作為自分泌或旁分泌分子，增進了精巢體細胞和生殖細胞之間的相互作用，直接或間接地影響性腺發育、配子發生和成熟過程。

[1]GharibSD,WiermanME,ShupnikM,etal.Molecularbiologyofthepituitarygonadotropins[J].EndocrineReviews, 1990, 11(1): 177-199.

[2]WuFR,ZhangXY,ZhangWL,etal.ExpressionofthreegonadotropinsubunitsinSoutherncatfishgonadandtheirpossiblerolesduringearlygonadaldevelopment[J].ComparativeBiochemistryandPhysiologyA-molecular&IntegrativePhysiology, 2009, 153(1): 44-48.

[3]AnKw,LeeKY,YunSg,etal.Molecularcharacterizationofgonadotropinsubunitsandgonadotropinreceptorsinblackporgy,Acanthopagrusschlegeli:effectsofestradiol-17betaonmRNAexpressionprofiles[J].ComparativeBiochemistryandPhysiology.PartB,Biochemistry&MolecularBiology, 2009, 152(2): 177-188.

[4]WongTT,ZoharY.Novelexpressionofgonadotropinsubunitgenesinoocytesofthegiltheadseabream(Sparusaurata)[J].Endocrinology, 2004, 145(11): 5210-5220.

[5]HuangH,ZhangY,HuangWR,etal.Molecularcharacterizationofmarbledeel(Anguillamarmorata)gonadotropinsubunitsandtheirmRNAexpressionprofilesduringartificiallyinducedgonadaldevelopment[J].GeneralandComparativeEndocrinology, 2009, 162(2): 192-202.

[6] 李曉曉，柳學周，史 寶，等．半滑舌鰨促性腺激素α亞基cDNA的克隆及組織表達特征[J]．漁業科學進展，2013，34(5)：23-30．[7]WuFR,ZhouLY,NagahamaY,etal.Duplicationanddistinctexpressionpatternsoftwothrombospondin-1isoformsinteleostfishes[J].GeneExpressionPatterns, 2009, 9(6): 436-443.

[8]LiCJ,ZhouL,WangY,etalMolecularandexpressioncharacterizationofthreegonadotropinsubunitscommonalpha,FSHbetaandLHbetaingroupers[J].MolCellEndocrinol, 2005, 233(1-2):33-46.

[9] 徐永江，柳學周，王妍妍，等．外源激素誘導對條斑星鰈(Veraspermoseri)精子質量的影響[J]．海洋與湖沼，2012，43(6)：1170-1176．

[10]GeW.Gonadotropinsandtheirparacrinesignalingnetworkinthezebrafishovary[J].FishPhysiologyandBiochemistry, 2005, 31(2/3): 209-214.

[11]MazónMJ,MolésG,RochaA,etal.A,CarrilloM,ZanuyS,GómezA.GonadotropinsinEuropeanseabass:Endocrinerolesandbiotechnologicalapplications[J].GenCompEndocrinol, 2015.

[12]HorieY,KobayashiT.Gonadotrophiccellsandgonadalsexdifferentiationinmedaka:Characterizationofseveralnorthernandsouthernstrains[J].JExpZoolAEcolGenetPhysiol. 2015.

ExpressionofLHβsubunitintilapiagonadandcelllocalizationintestis

WUFeng-rui1,2，SUMi-mi1，LIUYong1,2，DINGBiao1,2，LIWen-yong1,2

(1.SchoolofBiologicalScienceandFoodEngineering,FuyangNormalUniversity,FuyangAnhui236037,China；2.KeyLaboratoryofEmbryoDevelopmentandReproductiveRegulation,FuyangAnhui236037,China)

Ithasbeenreportedthatfishgonadotropinwasexpressedinpituitary,butalsoinlocalgonad.ToconfirmwhethertilapiaLHβsubunitisexpressedingonadornot,RT-PCRwasperformedtodetectthetranscriptionlevelintilapiapituitary,ovaryandtestis.Moreover,thegonadalcelltypewhereLHβexpresswasfurtheranalyzedbyImunohistochemistry.TheresultsshowedthattilapiaLHβwasexpressedbothinovaryandtestisbesidespituitary,andtheexpressionlevelofLHβinpituitarywasas3-4timesthaninovaryandtestis.Meanwhile,LHβwasfoundinspermatocytes,spermatogoniumandspermatidsintestis.Together,theseresultswillprovidebasicdataforfurtherindicatingthefunctionofgonadotropinintilapia,andcouldbebeneficialforartificialinseminationinfish.

LHβsubunit；RT-PCR；Imunohistochemistry；testis；Tilapia.

安徽省自然科學基金青年項目(1408085QC65)，安徽省高等學校省級自然科學研究重點項目(KJ2013A202)；大學生創新創業訓練計劃項目(AH201410371083)資助。

吳風瑞(1981-)，男，博士，副教授，研究方向：胚胎發育的分子機制。

Q952

A

1004-4329(2015)04-066-03

10.14096/j.cnki.cn34-1069/n/1004-4329(2015)04-066-03

投稿日期：2015-6-17