滅多威脅迫下羅非魚精巢SSH文庫的構建

孟順龍 劉濤 宋超

摘要[目的]應用抑制消減雜交（SSH） 技術，建立滅多威脅迫下羅非魚精巢SSH正反向文庫。[方法]以雄性羅非魚為試驗動物，采用抑制性消減雜交技術構建羅非魚精巢組織在滅多威脅迫下的正反向SSH文庫。試驗共獲得45條EST，成功注釋25條，其中正向文庫13條，反向文庫12條。功能明確基因按功能可分為5類，其中催化活性、細胞相關基因表達上調，細胞過程、結構分子活性相關基因表達下調。整合素β1表達量上調，絲/蘇氨酸蛋白激酶pim-3、Ca2+-ATPase、Na+-K+-ATPase、核糖體蛋白L22表達下調。[結論]研究結果可為揭示滅多威對羅非魚生殖毒性的分子機制奠定基礎。

關鍵詞 滅多威；羅非魚；抑制消減雜交；cDNA文庫；精巢

中圖分類號 S965.125 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2018）22-0074-04

Abstract[Objective]To construct forward and reserve libraries of suppression subtractive hybridization（SSH） in the testis of male tilapia under the stress of methomyl by using SSH technology.[Method]Using male tilapia as test animal，the forward and reserve libraries of SSH in the testis of tilapia under the stress of methomyl were constructed by using SSH technology.[Result]45 expressed sequence tags （ESTs） were obtained，and 25 expressed sequence tags were successfully noted，including 13 forward libraries and 12 reserve libraries.The genes with confirmed functions were classified into 5 types.Related genes with catalytic activity and cell were upregulated，while related genes with structural molecules activity and biological process were downregulated.The expression amount of integrin β1 was upregulated，while serine/threonine protein kinase pim3，Ca2+ATPase，Na+K+ATPase and ribosomal protein L22 were downregulated.[Conclusion]The research results could lay the foundation for revealing the molecular mechanism of methomyls reproductive toxicity to tilapia.

Key words Methomyl； Tilapia； Suppression subtractive hybridization； cDNA library； Testis

滅多威屬于氨基甲酸酯類廣譜殺蟲劑，具有較強的觸殺和胃毒作用，無內吸傳導作用，是目前使用最廣泛的殺蟲劑之一。1997年世界野生動物基金會將滅多威列為雌激素類內分泌干擾物[1]，其對環境的生物毒性表現為破壞動物間的捕食關系，威脅生態系統平衡等[2]。由于滅多威在水中溶解性強、使用量大，加上工農業生產中的不合理排放，導致在一些水體和食品[3]中檢測到滅多威殘留。目前，滅多威由于在環境水體中檢出率高和具有內分泌干擾作用等特點而受到廣泛關注[4-6]。

抑制性消減雜交（SSH）是具有選擇擴增目的基因功能的差減技術[7]。豐度不同的序列能夠通過該技術將其相對含量最終達成一致，然后運用鏈內退火時優先于鏈間的原理，使引物與非目的序列片段兩端無法結合配對，抑制非目標序列片段，從而擴增了目的基因。與其他差異基因獲得方法相比，該技術具有靈敏度高、假陽性低、特異性強等特點，使其用于篩選和克隆差異表達基因。筆者以雄性羅非魚為試驗動物，采用抑制性消減雜交技術構建了羅非魚精巢組織在雌激素類農藥滅多威脅迫下的正反向SSH文庫，鑒定羅非魚精巢組織在雌激素類農藥滅多威脅迫下差異表達基因，旨在為揭示滅多威對羅非魚生殖毒性的分子機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

以雄性尼羅羅非魚（中國水產科學研究院淡水漁業研究中心宜興養殖基地）作為試驗動物，平均體質量為（112.24±9.48） g，平均體長為（17.06±0.91） cm。在容積300 L（實際水體200 L）的水族缸中隨機放入雄性羅非魚30尾，馴養4周。馴養期間，每天08：00投喂飼料1次，投喂量按羅非魚體質量的2%計算。暗光比為12 h∶12 h。用空氣壓縮機進行充氧。

1.2 試驗用水

試驗用水為曝氣7 d的去氯自來水，水溫（25.0±0.5） ℃，溶氧量6.3～7.0 mg/L，pH為（7.0±0.5），試驗用水符合漁業水質標準（GB11607—89）。

1.3 主要試劑和儀器

1.3.1 主要試劑。質量分數大于97%的滅多威原藥，購自上海焦點生物技術有限公司；Oligotex mRNA試劑盒、Maxi Plasmid 試劑盒均購自Qiagen公司；1 kb DNA Ladder、UltraPure Agarose購自Zrbiorise公司；Taq DNA聚合酶、10 mmol/L dNTP 購自TaKaRa公司；TRIzol Reagent提取試劑盒購自Invitrogen公司；RT Enzyme購自ABI公司；PCR-Select cDNA Subtraction 試劑盒購自Clonetech公司。

1.3.2 主要儀器。臺式高速冷凍離心機（Eppendorf，Centrifuge 5810R）；電轉化儀（BTX，ECM630）；PCR儀（Bio-rad，MyCycler）；電泳儀（Tanon，HE-120）；凝膠成像儀（Tanon，2500）。

1.4 試驗設計

根據前期急性試驗結果（滅多威的96 h LC50為430 μg/L）、在自然水體中滅多威殘留量（0～97 μg/L）[8-10]以及美國水質標準規定滅多威最高限量（200 μg/L）[11]，試驗采用5個濃度梯度：0、0.2、2.0、20.0、200.0 μg/L。每個濃度梯度設置3個平行，在300 L水族缸中配制上述各濃度染毒液200 L，每個平行隨機放入健康雄性羅非魚20尾。采用半靜態水接觸染毒法進行試驗，各濃度組水缸每天更換50%的水，并添加藥物至原濃度。試驗期48 d，前30 d為滅多威暴露試驗階段，后18 d為清水恢復試驗階段（無滅多威）。

為測定各試驗組滅多威的實際含量，參照張學健等[12]以及張冰等[13]的方法進行測定，滅多威濃度分別為0、0.2、2.0、20.0、200.0 μg/L的試驗組最初染毒時的滅多威含量分別為0、0.23、2.12、21.50、182.00 μg/L，24 h后各濃度組滅多威含量為0、0.21、1.92、18.52、179.00 μg/L。24 h后各濃度組與染毒時的滅多威濃度相差不大。

1.5 樣品采集

在染毒的第30天對200 μg/L滅多威處理組以及對照組羅非魚進行樣品采集。采樣前24 h，停止喂食。試驗期間，羅非魚活躍、健康。采樣時，用250 mg/L MS-222麻醉羅非魚，對其體長和體重進行測定，迅速將羅非魚處死后采集精巢，置于RNAlater保存液中，最后在-80 ℃超低溫冰箱中貯存備用。

1.6 總 RNA 提取和mRNA的分離

取出超低溫冰箱中保存的樣品，將其研成粉末。采用TRIzol Reagent提取試劑盒提取羅非魚精巢組織總RNA，具體操作按照TRIzol Reagent提取試劑盒說明書進行。用乙醇將總RNA沉淀后，溶于DEPC處理水中，檢測總RNA質量和濃度。樣本mRNA經Oligotex mRNA試劑盒分離并純化，具體操作按試劑盒說明書進行。

1.7 SSH文庫的構建

SSH文庫的構建采用PCR-Select cDNA Subtraction 試劑盒，將純化的mRNA反轉錄成cDNA，加入反轉錄酶到cDNA第一鏈合成中，用E.coli的DNA聚合酶I進行第二鏈的合成。 以滅多威處理組精巢組織雙鏈 cDNA和對照組雙鏈cDNA互為驅動方或實驗方，分別構建SSH正反向文庫。將試驗方雙鏈cDNA 分成2份，分別與Adaptor 1和 Adaptor 2R相連接。成功連接后，將實驗方cDNA同驅動方cDNA一起進行2次分子雜交，雜交產物再進行2次特異PCR。PCR產物進行T/A克隆，取文庫菌液50 μL，涂于具有相應抗性的平板上，37 ℃下培育過夜，通過菌落PCR篩選陽性克隆，保存菌種。鑒定菌落以M13 F 和 M13 R 為引物，采用PCR 法鑒定陽性克隆。PCR反應程序如下：94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，30個循環；72 ℃延伸 5 min，反應體系為20 μL，4 ℃下保存PCR產物。隨機挑選64個陽性克隆進行測序。

1.8 序列比對

去除EST有效序列載體以及接頭序列后，與GenBank數據庫進行相似性比對，分析對比序列所具有的功能。

2 結果與分析

2.1 總 RNA 提取 使用TRIzol Reagent試劑盒，提取滅多威處理組和對照組的羅非魚精巢組織總RNA，并進行2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。從圖1可以看出，18S和28S兩條清晰條帶均位于1 000 bp以上，無基因組污染，即提取的RNA質量較好。

2.2 雙鏈 cDNA 的合成與酶切

電泳檢測羅非魚雙鏈cDNA（圖2），并且將Rsa I酶切前后的雙鏈 cDNA條帶進行對比，發現Rsa I酶切后的片段明顯變小，條帶下移，酶切效果好，能夠滿足后續用于構建文庫的試驗要求。

2.3 差異片段陽性克隆的篩選

將消減雜交后的片段連接到pMD18T載體上，構建了滅多威脅迫下羅非魚精巢組織正反向消減cDNA文庫。隨機挑取36個陽性克隆進行PCR篩選鑒定，對PCR產物進行電泳，結果如圖3所示。由圖3可知，重組率大于95%，載體中的片段長度為100～500 bp。

2.4 陽性克隆測序及分析

隨機挑選64個陽性克隆進行測序，得到45條EST，將測序成功的序列除去載體和接頭序列，最后進行GenBank數據庫同源性比對，對相同序列進行對比和拼接后成功注釋得到25條基因序列，其中正向文庫13條，反向文庫12條。功能確定基因序列結果如表1所示。

3 討論

在該試驗雌激素類農藥滅多威脅迫下羅非魚精巢組織SSH正向文庫中，低密度脂蛋白受體、17α-羥化酶/17，20-裂解酶表達量上調。低密度脂蛋白受體（LDLR）是細胞表面糖蛋白，它參與了卵巢、睪丸等甾源性組織的脂蛋白代謝過程。低密度脂蛋白經受體LDLR途徑，攝取膽固醇在細胞內用于類固醇激素合成、細胞增殖等。17α-羥化酶/17，20-裂解酶是體細胞色素P450c17酶，在膽固醇合成途徑中控制性類固醇激素的合成[14]。對魚類而言，P450c17酶在精巢中表達較多，而在卵巢中表達較少[15]。魚類性類固醇激素睪酮、11-酮基睪酮等則是體內膽固醇的衍生物，它們通過影響生精細胞和支持細胞活性，在精子發生過程中起著重要的調節作用[16]。滅多威有環境雌激素內分泌干擾作用[1]，可能對羅非魚類固醇激素的分泌有影響。孟順龍[17]研究發現，在高濃度滅多威脅迫下羅非魚血清睪酮和11-酮基睪酮含量顯著降低。在環境雌激素滅多威脅迫下，精巢組織中低密度脂蛋白受體蛋白、17α-羥化酶/17，20-裂解酶表達量上調，可能是因羅非魚精巢組織脂蛋白代謝或類固醇激素分泌受滅多威的干擾，從而引起機體的反饋機制，使得低密度脂蛋白受體、17α-羥化酶/17，20-裂解酶表達量上調。

黏附連接主要是將相鄰的2個細胞通過黏附分子而連接在一起，其中生精細胞則是通過黏附連接與支持細胞相連接。當黏附分子的數量改變或與胞質內的接頭蛋白的關系發生改變后，將使得細胞之間的黏附發生改變[18]。在該試驗SSH正向文庫中，整合素β1表達量上調。整合素α6和整合素β1是生精上皮中2個重要的黏附分子，它們可以在支持細胞表面構成異源二聚體[19]，與精細胞表面層黏連蛋白相互作用，參與構成生精上皮的頂面ES[20]。因此，精巢組織中整合素β1表達上調，可能是因環境雌激素滅多威對羅非魚精巢組織黏附性造成影響而引起的反饋機制，使得整合素β1表達上調，以維持精巢組織內部結構的穩定。

在羅非魚精巢組織SSH反向文庫中，絲/蘇氨酸蛋白激酶pim-3表達下調。絲/蘇氨酸蛋白激酶pim-3具有磷酸化凋亡蛋白Bad，發送細胞生存信號的生物學作用。線粒體外膜的促凋亡蛋白 Bax 在凋亡蛋白Bad的作用下形成同源二聚體，增加線粒體膜通透性，釋放細胞色素Cytc，并激活Caspase，誘發細胞凋亡[21]。Bad的活性形式是非磷酸化的，Bad磷酸化后失去活性，能夠抑制細胞凋亡[22-23]。因此，絲/蘇氨酸蛋白激酶pim-3表達下調，可能限制凋亡蛋白Bad磷酸化。在該試驗SSH反向文庫中，質膜Ca2+-ATPase、Na+-K+-ATPase表達下調。在正常情況下，細胞質膜中離子濃度呈現一種動態平衡狀態，能夠維持細胞結構、正常生理功能。Ca2+-AT-Pase、Na+-K+-ATPase對細胞內膜結構上Ca2+、Na+、K+離子穩態具有重要的調節作用，它們在主動運輸中具有特定的離子運載功能，以維持組織或器官細胞膜上離子平衡。在滅多威脅迫下，Ca2+-ATPase、Na+-K+-ATPase表達下調，這可能影響其對羅非魚精巢組織細胞膜上離子濃度的調節，導致細胞膜上離子濃度的失衡，影響精巢組織細胞的正常生理功能。

在羅非魚精巢組織SSH反向文庫中，核糖體蛋白L22表達下調。李紅艷[24]發現在果蠅胚胎、幼蟲S2細胞中敲除 L22對細胞周期產生影響。孫凱等[25]發現L22表達沉默時細胞周期蛋白D1顯著降低，相應的細胞增殖受到顯著抑制。這說明核糖體蛋白L22與細胞增殖周期有密切聯系。因此，在滅多威脅迫誘導糖體蛋白L22表達下調，可能對精巢組織細胞增殖周期造成影響。另外，還有磷脂酶A2差異表達基因下調。磷脂酶A2主要水解甘油磷脂，參與磷脂代謝。磷脂酶A2表達下調，可能影響精巢組織的磷脂代謝過程。

4 結論

采用抑制消減雜交（SSH）技術，構建了羅非魚精巢組織在雌激素類農藥滅多威脅迫下的正反向SSH文庫，并獲得8條功能確定基因序列。

對部分重要的差異表達基因的鑒定和分析表明，在環境雌激素滅多威脅迫下，羅非魚精巢組織脂蛋白代謝或類固醇激素分泌受到干擾，引起機體防御機制，誘導低密度脂蛋白受體相關蛋白、17α-羥化酶/17，20-裂解酶表達量上調；誘導整合素β1表達量上調，以維持精巢組織內部結構的穩定；絲/蘇氨酸蛋白激酶pim-3表達下調，可能限制凋亡蛋白Bad磷酸化。Ca2+-ATPase、Na+-K+-ATPase、核糖體蛋白L22表達下調，細胞膜上離子平衡以及精巢組織細胞增殖可能受到影響。

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