糞產堿菌對阿魏酸厭氧降解的影響

謝 婷，劉 飛，李 敏，藍小桐，李紅丹，陳 雄，王 志

（工業發酵湖北省協同創新中心，發酵工程教育部重點實驗室，湖北工業大學生物工程學院，湖北武漢430068）

糞產堿菌對阿魏酸厭氧降解的影響

謝 婷，劉 飛，李 敏，藍小桐，李紅丹，陳 雄，王 志*

（工業發酵湖北省協同創新中心，發酵工程教育部重點實驗室，湖北工業大學生物工程學院，湖北武漢430068）

糞產堿菌在以阿魏酸為唯一碳源的厭氧發酵中培養7 d，阿魏酸的降解率約為70%；研究秸稈厭氧發酵產氣（以產氣量反應菌群的活性）發現，體系接種5%糞產堿菌后，菌群的活性最強，生物氣增量最大，達130 m L，比接種3%和7%糞產堿菌的體系提高85.71%和116.67%；同時體系的產酸效率和阿魏酸的降解率均顯著提升，分別比接種3%和7%糞產堿菌的體系提高136%和110.71%以及25%和33.33%。傅里葉紅外光譜檢測表明：厭氧發酵體系接種5%糞產堿菌后秸稈中木質素、阿魏酸的特征官能團結構被有效破壞。秸稈厭氧發酵體系接入糞產堿菌可以有效降解阿魏酸等木質素降解衍生物、解除木質素及其降解產物對厭氧菌群的毒性同時提高產氣效率，具有應用價值。

糞產堿菌；厭氧降解；阿魏酸；木質素

秸稈是農業生產中的重要副產物，資源十分豐富，大量秸稈焚燒還田，引起了嚴重的環境污染。生物質秸稈是繼煤炭、石油和天然氣的之后的第四大能源[1]。農作物秸稈能源化技術是緩解我國當前面臨的“能源，糧食，環境”三大危機的有效途徑之一[2]。我國有豐富的秸稈資源，通過厭氧發酵對秸稈進行循環利用不僅能保護環境，還可產生可再生能源—沼氣，厭氧發酵技術作為生物質能主要利用技術已受到廣泛關注[3]。2007年農業部把秸稈沼氣生產技術列為農業和農村“十大節能減排技術”之首。

農作物秸稈的化學物質組成主要是纖維素、半纖維素和木質素，其分別占植物干質量的45%、20%和15%～20%[4]。秸稈的生物降解性取決于纖維素和半纖維素被木質素包裹的程度，這種包裹結構的存在使降解酶難于接觸纖維素與半纖維素，導致秸稈降解緩慢[5]，在秸稈的厭氧生物處理中，要提高秸稈的利用效率，需要提高木質素的降解效率。木質素分子側鏈上有對羥基安息香酸、紫丁香酸、對羥基肉桂酸和阿魏酸等酯型結構存在[6]。此外，木質素經過解聚生成芳環化合物，并隨機伴隨側鏈反應和脫甲基反應，會降解生成醛基和非極性取代基團的木質素衍生物，這些分子對厭氧菌群具有高毒性，如木質素分子單體、愈創木酚等[7]。另外，PAREEK S等[8-9]報道，低分子質量木質素分子單體間的化學鍵β-O-4鍵可在厭氧條件下降解生成芳環物質（如香草酸、阿魏酸等），可見阿魏酸是影響厭氧菌群活性的毒性物質之一。在厭氧發酵過程中，各類微生物協同合作，將木質素降解的小分子物質被吸收利用。雖然秸稈中纖維素和木質素等分子形成的特殊結構和木質素芳環降解物對厭氧菌群的毒性等而使沼氣產量的穩定性降低[10]，但是纖維素、木質素等大分子還是可以被厭氧耦合菌系有效降解[11]。

阿魏酸等木質素降解衍生物的進一步降解是解除木質素及其降解產物對厭氧菌群毒性、提高纖維素和半纖維素利用率的可行方法。本實驗考察了糞產堿菌厭氧降解阿魏酸的效率，并通過秸稈厭氧產生物氣體系研究了添加糞產堿菌對體系的產氣效率（反映厭氧菌群活性）、體系pH值、阿魏酸降解的影響，并檢測了厭氧發酵前后水稻秸稈木質素的傅里葉紅外光譜差異。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

馬氏甲烷八疊球菌（Methanosarcina mazei）、蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）、施氏假單胞菌（Pseudomonas stutzeri）、糞產堿菌（Alcaligenes faecalis）和謝氏丙酸桿菌（Propionibacterium shermanii）均由實驗室保存。

1.1.2 培養基

0.10 %刃天青：稱取0.10g刃天青溶于5m L無水乙醇中，再用蒸餾水定容至100 m L。

以阿魏酸為唯一碳源的培養基：阿魏酸1.20 g，NH4Cl 2g，MgSO40.50g，KH2PO41g，Na2HPO40.20g，KNO30.15g，0.10%刃天青1m L，蒸餾水1000m L，pH 7.00，121℃、15min滅菌。

微量元素混合液：CoCI2·6H2O 0.12 g/L，NiCl2·6H2O 4.80 g/L，MgSO4·7H2O 3.00 g/L，CaCl2·2H2O 0.10 g/L，H3BO30.01g/L，ZnSO4·7H2O 0.10g/L，Na2MoO40.01g/L，MnSO4·H2O 0.45 g/L，FeSO4·7H2O 0.10g/L，CuSO4·5H2O 0.01g/L。

LB培養基：胰蛋白胨1g，氯化鈉1g，酵母提取物0.50g，蒸餾水1 000 m L，pH 7.00，121℃、15 m in滅菌。

甲烷菌培養基：K2HPO40.40 g，MgCl22 g，KH2PO40.40 g，酵母浸膏1 g，NH4Cl 1 g，乙酸鈉2 g，KCl 0.20 g，NaCl 2 g，微量元素溶液10m L，蒸餾水1000m L，pH 6.50，121℃、15 m in滅菌。

1.2 儀器與設備

DELTA 320 pH計：梅特勒托利多儀器（上海）有限公司；YXQ-LS-50A立式壓力蒸汽滅菌器：上海博迅實業有限公司醫療設備廠；TG18M臺式高速離心機：長沙平凡儀器儀表有限公司；HNY-211B全溫振蕩培養箱：天津歐諾儀器儀表有限公司；Hypersil ODS2型高效液相色譜儀：美國熱電公司；NEXUS智能型傅立葉紅外光譜儀：美國尼高立儀器公司；SHZ-D（Ⅲ）循環水式真空泵：鞏義市予華儀器有限責任公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 高效液相色譜法檢測阿魏酸含量的色譜條件

色譜柱：Hypersil ODS2（4.60 mm×250 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.09%磷酸溶液（12∶88）；波長：316 nm；流速：1 m L/min；柱溫：35℃；進樣體積：20 μL。

1.3.2 糞產堿菌厭氧降解阿魏酸的培養條件

利用Hungate厭氧操作技術，將液體培養基分裝到厭氧瓶中，加熱至沸騰持續10 min，通入無氧氮氣（99.99%的氮氣和氫氣通過高溫除氧銅柱，得無氧氮氣）5 min，進一步將厭氧瓶中的氧氣置換，后加入終質量濃度為0.50 g/L的L-半胱氨酸，此時培養基漸漸變為無色（此時厭氧瓶培養基的氧化還原電位已處于-42 mV以下）。迅速蓋上膠塞，并用長條膠布十字緊固后再用細繩橫向扎住縱向的膠布將瓶口密封[12]，115℃、20 min滅菌備用。

在氮氣的保護下，將生物量為0.74±0.12 g/L的糞產堿菌菌懸液以0.60%的接種量接入以阿魏酸為唯一碳源的厭氧培養基中，37℃培養，周期取樣，測菌體干質量、pH和阿魏酸質量濃度。

1.3.3 水稻秸稈厭氧發酵體系添加的糞產堿菌對阿魏酸的降解菌種培養條件

用甲烷菌培養基在35℃條件下厭氧培養18 d，得馬氏甲烷八疊球菌生物量為（0.84±0.08）g/L。

分別用LB培養基在30℃、220 r/min條件下培養12 h得蘇云金芽孢桿菌生物量為（1.05±0.05）g/L；施氏假單胞菌生物量為（1.63±0.14）g/L；糞產堿菌生物量為（0.74±0.12）g/L。

用LB培養基在30℃靜置培養48 h得謝氏丙酸桿菌生物量為（1.25±0.11）g/L。

1.3.4 水稻秸稈厭氧體系的裝配

30 g水稻秸稈粉（粉碎后過40目篩所得）裝入250 m L抽濾瓶中，添加蘇云金芽孢桿菌菌懸液45 m L、施氏假單胞菌菌懸液30 m L、謝氏丙酸桿菌菌懸液45 m L、NH4HCO33 g、KNO30.06 g、檸檬酸鹽0.73 g、乙二酸鹽0.23 g、蘋果酸鹽0.26 g，補水至225 m L后，添加微量元素混合液1 m L，立即將瓶口用橡膠塞封閉并用止水夾將出氣橡膠管口密閉。靜置培養24 h后，在無氧氮氣保護下接入45 m L甲烷菌液（生物量為（0.84±0.08）g/L）。出氣橡膠管固定于集氣裝置，室溫培養。

1.3.5 水稻秸稈厭氧發酵體系中添加的糞產堿菌對體系產氣、pH和阿魏酸降解的影響

1.3.4 所述體系產氣結束后，在無氧氮氣保護下添加不同體積的糞產堿菌菌懸液（實驗組）和水（對照組），體積接種量分別為3%、5%和7%，繼續厭氧發酵12 d，每天觀察產氣量，測體系的pH值，用高效液相色譜法檢測厭氧發酵產期結束時以及接入糞產堿菌后繼續發酵12 d體系的阿魏酸質量濃度，得阿魏酸的降解率。

樣品制備：取8 m L發酵液，8 000 r/m in離心10 m in，上清用于高效液相色譜法檢測。

1.3.6 水稻秸稈中木質素的傅里葉紅外光譜分析

分別取已粉碎未經任何處理的水稻秸稈、添加5%水厭氧發酵體系中的水稻秸稈和添加5%糞產堿菌厭氧發酵體系中的水稻秸稈進行傅里葉紅外光譜分析。

1.3.7 數據分析

所得實驗數據均為最少3次平行實驗的平均值。

2 結果與分析

2.1 HPLC測定阿魏酸的標準曲線

精密稱取阿魏酸標準品10.04mg，置50m L棕色量瓶中，加體積分數為70%甲醇溶解并稀釋至刻度，得質量濃度為0.20 g/L的阿魏酸標準母液，精密量取標準溶液0.20 m L、1.00 m L、2.00m L、3.00m L、5.00m L、7.00m L，置于25m L棕色量瓶中，用體積分數70%甲醇稀釋至刻度，得系列標準溶液。按方法1.3.1進行測定，以阿魏酸標準品質量濃度（x）為橫坐標，測得的峰面積（y）為縱坐標，繪制標準曲線如圖1所示。

圖1 阿魏酸標準曲線Fig.1 The standard curve of ferulic acid

由圖1可知，阿魏酸標準曲線的回歸方程為y=63.23x+ 25.977，其質量濃度與峰面積的線性相關系數R2=0.998。結果表明，阿魏酸標準品質量濃度在1.60～56.22 μg/m L與峰面積呈良好的線性關系。

2.2 糞產堿菌厭氧條件下對阿魏酸的降解

圖2 糞產堿菌厭氧發酵過程中生物量、阿魏酸質量濃度和pH曲線Fig.2 Time course of biomass,ferulic acid content and pH of A.faecalis in the anaerobic fermentation

在無氧氮氣的保護下，將糞產堿菌菌懸液以0.60%的接種量接入到以阿魏酸為唯一碳源的厭氧培養基中，37℃培養，周期取樣，測菌體干質量、pH值和阿魏酸質量濃度，實驗結果如圖2所示。

由圖2可知，厭氧發酵1～7 d，阿魏酸的質量濃度快速減少，第7天時，阿魏酸質量濃度僅為0.37 μg/m L，其降解率為69.17%；繼續培養至第9天，阿魏酸質量濃度為0.33 μg/m L，其降解率為72.50%；厭氧條件下，糞產堿菌的干質量隨著培養時間的增加而增加，培養9 d后達到最大值，為2.14g/L；同時體系pH值由7.07上升至7.31，說明糞產堿菌有一定的產堿能力，并且對阿魏酸的降解能力很強。

2.3 水稻秸稈厭氧體系添加糞產堿菌對阿魏酸降解的影響

2.3.1 水稻秸稈厭氧體系添加的糞產堿菌對體系產氣和pH的影響

按照1.3.5中的方法添加糞產堿菌液（體積接種量為3%、5%和7%）和水（3%、5%和7%），繼續厭氧發酵12 d后，體系產氣量、pH值的變化如圖3和圖4所示。

圖3 添加糞產堿菌對水稻秸稈厭氧發酵體系產氣量的影響Fig.3 Effect of A.faecalis addition on biogas production in the anaerobic fermentation system of rice straw

圖4 添加糞產堿菌對水稻秸稈厭氧發酵體系pH變化值的影響Fig.4 Effect of A.faecali addition on pH change in the anaerobic fermentation system of rice straw

體系中添加3%、5%、7%的糞產堿菌，產氣量分別平均增加了70 m L、130 m L、60 m L，此時對照組（加3%、5%、7%的水）的生物氣量分別平均增加了55 m L、25 m L、5 m L，糞產堿菌的加入對生物氣量增加有顯著地促進作用。添加5%糞產堿菌體系增量最大，比加3%和7%糞產堿菌分別提高了85.71%和116.67%。另外，添加水和添加糞產堿菌的pH值均明顯下降，添加5%糞產堿菌體系最終pH僅為5.95，ΔpH（添加糞產堿菌前體系pH-添加糞產堿菌培養12 d后體系pH）為0.59，比添加3%和7%糞產堿菌體系的ΔpH（分別為0.25和0.28）分別提高了136%和110.71%。未添加水或糞產堿菌時，pH值大多數維持在6.10～6.55，可見添加糞產堿菌對厭氧體系的pH值影響很大。

由圖2可知，糞產堿菌純種厭氧培養有提高體系pH值的作用，然而秸稈厭氧體系加入糞產堿菌后，由于促進了阿魏酸等木質素降解衍生物的進一步降解，有效緩解或降低了這些物質對厭氧菌群的毒性，使厭氧菌群的活性和代謝能力增強，促進了發酵產物——乙酸、乙醇等物質的合成[13]，而這些分子經代謝成為甲烷合成的前體。因此，雖然添加糞產堿菌使厭氧體系的pH降低，但仍然在菌群適應范圍內，最終增強了生物氣的合成效率?？梢妼嶒灄l件下產酸引起的pH值降低不是抑制厭氧菌群生物活性（生物氣合成效率）的限制因素，木質素降解衍生物（如阿魏酸等）對厭氧菌群的致毒性是影響菌群活性、阻礙秸稈厭氧體系持續高效產氣的關鍵因素。

2.3.2 水稻秸稈厭氧發酵體系中添加的糞產堿菌對阿魏酸的降解

根據1.3.5的方法，添加不同體積的糞產堿菌菌懸液和水，使其在體系中的體積分數分別為3%、5%和7%，繼續厭氧發酵12 d后，用高效液相色譜法檢測厭氧發酵12 d前、后體系的阿魏酸質量濃度，得到阿魏酸的降解率如表1所示。

表1 水稻秸稈厭氧發酵體系中添加的糞產堿菌對阿魏酸降解的影響Table 1 Effect of A.faecalis addition on the degradation of ferulic acid in the anaerobic rice straw fermentation system

添加3%、5%和7%的糞產堿菌后，體系阿魏酸的降解率分別為32%、40%和30%，此時對照組（添加3%、5%和7%的水）分別為24%、25%和21%，糞產堿菌的加入對阿魏酸的降解有促進作用。其中添加5%的糞產堿菌時體系阿魏酸的降解率最高，達到40%，比添加3%和7%糞產堿菌的體系中阿魏酸的降解率分別提高了25%和33.33%。

2.3.3 水稻秸稈中木質素的傅里葉紅外光譜分析

由于阿魏酸是木質素的組成成分，在紅外光譜圖（見圖5）上有明確的特征峰，主要有1 610～1 600 cm-1和1 520～1 500 cm-1，屬于芳香環骨架振動區域[14]，在1 270 cm-1附近為芳香醚鍵伸縮振動區域[15]和1 030 cm-1附近為芳香族面內C-H彎曲振動區域[16]，這些波數范圍內很少有其他譜帶，通過傅里葉紅外光譜分析水稻秸稈木質素結構特征峰的變化情況，可判斷糞產堿菌對木質素、阿魏酸的特征官能團的降解情況。傅里葉紅外光譜分析主要是針對木質素的結構變化進行的，木質素單體主要通過醚鍵和碳碳鍵連接成復雜的木質素結構，其中主要連接鍵為β-O-4，難降解的鍵為5-5′和β-5鍵[17]。在木質素的側鏈上有對羥基安息香酸、香草酸、紫丁香酸、對羥基肉桂酸和阿魏酸等酯型結構存在，糞產堿菌對阿魏酸的降解，可促進木質素結構的崩解。

取已粉碎未經任何處理的水稻秸稈、添加5%水的厭氧發酵體系中的水稻秸稈和添加5%糞產堿菌厭氧發酵體系中的水稻秸稈，分別進行傅里葉紅外光譜分析，結果如圖5所示。

圖5 厭氧發酵前后水稻秸稈的紅外光譜圖Fig.5 Infrared spectrogram of rice straw before and after anaerobic fermentation

由圖5可知，水稻秸稈木質素特征吸收的波數有明顯的改變，在1604cm-1、1508 cm-1芳香族骨架振動區域、1270 cm-1芳香醚鍵伸縮振動區域和1 064 cm-1附近芳香族面內C-H彎曲振動區域的透光率均顯著上升，即相應的官能團結構含量有明顯減少。其中，添加5%糞產堿菌厭氧發酵體系上升最為明顯。說明糞產堿菌的降解作用破壞了秸稈木質素、阿魏酸的官能團結構。這與糞產堿菌可有效降解阿魏酸的實驗結論一致。

3 結論

以阿魏酸為唯一碳源，糞產堿菌厭氧培養7 d，阿魏酸的降解率為70%；研究秸稈厭氧發酵產生物氣（以產氣量反應菌群的活性）發現，體系添加5%糞產堿菌，菌群活性最強，生物氣增量最大，達130 m L，而且產酸效率增強，最終pH值為5.95，pH下降0.59，同時阿魏酸降解率為40%。傅里葉紅外光譜檢測表明，厭氧發酵體系接種5%糞產堿菌后秸稈中木質素、阿魏酸的特征官能團結構被有效破壞。秸稈厭氧發酵體系接入糞產堿菌可以有效降解阿魏酸等木質素降解衍生物、解除木質素及其降解產物對厭氧菌群的毒性同時提高產氣效率，具有應用價值。

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《中國釀造》雜志社

Effect of Alcaligenes faecalis on anaerobic degradation of ferulic acid

XIE Ting,LIU Fei,LI Min,LAN Xiaotong,LI Hongdan,CHEN Xiong,WANG Zhi*
(Hubei Collaborative Innovation Center for Industrial Fermentation,Key Laboratory of Fermentation Engineering(Ministry of Education), College of Bioengineering,Hubei University of Technology,Wuhan 430068,China)

The ferulic acid was approximately degradated 70% when Alcaligenes faecalis was cultured 7 d in the anaerobic culture with ferulic acid as the sole carbon source.Anaerobic fermentation systems with straw producing biogas were studied,where the biogas production was used to reflect the bacteria activity.Results showed that biogas production with A.faecalis inoculum 5%was up to 130 m l,which was increased by 85.71%and 116.67%compared with the inoculum of 3%and 7%,respectively.Meanwhile,the acids production,reflected by pH,was enhanced by 136%and 110.71%,and the ferulic acid degradation rate was increased by 25%and 33.33%compared with the inoculum of 3%and 7%,respectively.Fourier infrared spectrum analysis showed that the characteristic structure of lignin and ferulic acid in the anaerobic system with A.faecalis addition 5%was destroyed effectively.The results showed that A.faecalis inoculated in anaerobic fermentation system with straw could efficiently degrade lignin degradation derivatives(such as ferulic acid),remove the toxicity of lignin and its degradation products for the anaerobic bacteria group and enhance biogas production.

Alcaligenes faecalis;anaerobic degradation;ferulic acid;lignin

S216.4

A

0254-5071（2015）03-0066-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.03.015

2015-01-17

湖北省科技廳項目（2010CDB02505）

謝婷（1987-），女，碩士研究生，主要從事生物能源與發酵工程研究工作。

*通訊作者：王志（1971-），男，副教授，博士，主要從事微生物工程研究工作。