咖啡酸修飾篤斯越橘花色苷的實驗分析

朱良玉，張 悅

（黑龍江省科學院自然與生態研究所，黑龍江哈爾濱150040）

咖啡酸修飾篤斯越橘花色苷的實驗分析

朱良玉，張 悅*

（黑龍江省科學院自然與生態研究所，黑龍江哈爾濱150040）

應用超聲波萃取法提取大興安嶺篤斯越橘花青素，通過提純、上柱、濃縮得到純化后的花色苷，以空白花色苷為對照，設計將其與咖啡酸、咖啡酸加酶兩組?；磻?，比較分析花色苷的穩定性。結果表明，50℃持續加熱狀態下96 h后花色苷對照組保存率77.26%、不加酶組81.00%、加酶組84.96%?？Х人嵩诿傅拇呋驴梢悦黠@提高篤斯越橘花青素的穩定性。

篤斯越橘；咖啡酸；?；?；花色苷

篤斯越橘（Vaccinium uliginosum）屬杜鵑花科越橘屬植物，起源于北美，為多年生灌木小漿果果樹。因果實呈藍色，故稱為藍莓。其含有的大量水溶性色素花色苷，具有抗氧化、抗突變、降血糖、軟化血管、清除自由基等作用，有極高的藥用、保健和營養價值，從食品添加劑角度又具有較高的市場和商業價值。近年來，天然食品添加劑越來越受到人們的關注，花色苷的穩定性是食品加工業應用的關鍵，因此提高花色苷穩定性的研究始終是花色素研究的熱點，目前該研究方法主要是分子修飾法，而?；ㄊ欠肿有揎椃ǖ囊环N。

花色苷?；耐緩街饕谢瘜W?；?、酶促?；??；瘜W?；枰鞣N?；w，主要有酸類、酯類以及酸酐等。有研究報道表明，添加一定量篩選出的肉桂酸、咖啡酸和阿魏酸后，剌葡萄皮花色素的吸光度值明顯增加，最大吸收波長紅移，對溫度、光照的耐受性增強[1]。盧鋒波[2]通過實驗發現，咖啡酸對黑莓酒具有輔色作用，表現為可見光范圍內最大吸收值13.51%～19.19%的增加。董楠等[3]研究表明，咖啡酸的添加能明顯提高色素溶液在光（自然和紫外）、熱以及不同金屬離子條件下的穩定性，且隨咖啡酸濃度的增加其穩定效果加強。

酶促?；蛎笇τ诖呋孜锪己玫膶Ｒ恍院瓦x擇性，反應條件溫和，催化作用高效，因而酶促法分子修飾發展非常迅速。有報道表明，以保存率為評價指標，通過時間、比例、溫度和pH的單因素試驗及響應面優化，選擇對羥基苯甲酸作為?；w，進行酶促?；に囇芯靠墒顾{靛果花色苷保存率達93.51%[4]。趙壘[5]研究表明，將花色苷樣品與?；w在非水環境中以Novozyme435酶（固定化脂肪酶435）為催化劑進行?；磻商岣咂疥幟倒寤ɑㄉ辗€定性。

該實驗應用超聲波方法提取大興安嶺篤斯越橘花青苷，上柱純化后對花青苷進行分子修飾，采用咖啡酸作為酸供體，加入Novozyme435酶促進其?；?，有效提高花色苷的穩定性，為篤斯越橘花色苷分子修飾和花色苷穩定性提高的研究和生產，提供相關技術、實驗數據及理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

篤斯越橘：采自大興安嶺；

咖啡酸（分析純）、無水乙醇（分析純）、Novozym435脂肪酶（活力10 000 PLU/g）、X-5樹脂：南京化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

KQ-5200超聲波破碎儀：北京益植康生物科技有限公司；T6紫外可見分光光度計：北京普析通用公司；R-205B旋轉蒸發儀：上海申勝儀器公司；FD-1A-50凍干機：上海申勝儀器公司；NDJ-1電熱恒溫水浴鍋：北京醫療電子儀器廠；FJ-200高速萬能粉碎機：天津泰斯特儀器公司；DHG-9240電熱恒溫鼓風干燥箱：上海一恒科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 花色苷材料的制備

正常室溫環境中，將準確稱量的50 g大興安嶺篤斯越橘打碎成汁液，用體積分數為70%乙醇1 000 m L浸提；溫度30℃、超聲波功率80 W條件下超聲萃取20 min，4層紗布過濾后，澄清液旋轉蒸發，用X-5樹脂上柱，用蒸餾水洗脫至無色后，用體積分數為70%乙醇洗脫得到澄清深紅色液體，旋轉蒸發，得到花色苷濃縮液，凍干備用。

1.3.2 實驗設計與操作

咖啡酸修飾花色苷?；瘜嶒灒壕_稱量0.005 g花色苷凍干樣品，花色苷與咖啡酸以質量比1∶5混合，溶于10 m L無水乙醇中，室溫條件下振蕩20 min充分溶解，加入0.1 g Novozyme435酶（固定化脂肪酶435），在45℃條件下水浴6 h進行?；磻?，反應中止后4層紗布過濾脂肪酶，記為咖啡酸加酶組A 1。在以上步驟中去除加酶環節，未加酶記為咖啡酸組A2，以不加咖啡酸為空白組A3。

花色苷老化試驗：將以上3組實驗樣品分別置于10 m L試管內，于50℃水浴鍋內加熱96 h。用紫外-可見分光光度法測定樣品吸光度值，每24 h測定一次。

1.3.3 花色苷穩定性分析

提高花色苷的穩定性是通過減緩花色苷分解速率來實現的，花色苷分解速率越慢說明其穩定性越高，花色苷分解速率可以通過其保存率來體現，設咖啡酸與花色苷?；磻Y束時為測量始期，花色苷保存率計算公式如下：

保存率=（An/A0）×100%

式中：A0為花色苷溶液的初始吸光度值；An為加熱n小時后花色苷溶液的吸光度值。

2 結果與分析

2.1 各實驗組花色苷吸光度值的變化

咖啡酸與花色苷?；磻Y束時為測量始期，同一環境、加溫條件下的咖啡酸加酶組A1、咖啡酸組A2和空白組A3在96 h內，各實驗組花色苷吸光度值的變化結果見圖1。

由圖1可知，在50℃加熱狀態下，各組花色苷的吸光度值隨著加熱時間的增長而減小，48 h后吸光度值下降相對變得平緩，花色苷吸光度值大小與加熱時間成反比，隨時間的延長吸光度值呈逐漸下降趨勢。A 1組花色苷吸光度值較A3組大幅度減小，A2組吸光度值最高。結果表明，咖啡酸對大興安嶺篤斯越橘花色苷具有輔色作用，Novozyme435酶的加入對花色苷的吸光度值有一定抑制作用，可能是產生了其他化學反應。

圖1 各組花色苷96 h內吸光度值變化比較Fig.1 Absorbance values comparison of anthocyanins in 96 h

2.2 各實驗組花色苷保存率的變化

根據50℃加熱狀態下96 h的吸光度值計算3組的保存率，結果見表1。

表1 花色苷保存率結果Tab le1 Results o f anthocyanin preservation rate

由表1可知，同一環境、50℃加熱狀態下，24 h A1組保存率高于A2組低于A3組，之后保存率一直比其他兩組高，96 h達到84.96%，比A3組高7.7%；A2組保存率介于其他兩組中間，96 h后達到81.00%；A 3組24 h保存率最高98.22%，96 h后下降至77.26%。結果表明，咖啡酸的加入提高了大興安嶺篤斯越橘的花色苷的穩定性，加入Novozyme435酶后花色苷的保存率有進一步的提升。

3 結論

本項實驗研究驗證了咖啡酸修飾花色苷時，在酶的催化作用下提高花色苷穩定性效果較為顯著，在50℃加熱狀態下96h后保存率為84.96%，穩定性高于不加酶組和空白組。

50℃加熱狀態下通過時間的增加測試花色苷的吸光度值和保存率主要是考察時間對花色苷的穩定性影響，在加速花色苷分解的同時考察花色苷對50℃溫度的抗性，實驗證明在加入咖啡酸后花色苷穩定性提高，但是酶的加入減少了花色苷的吸光度值。

酶對于花色苷的分子修飾具有選擇性，咖啡酸加酶提高了花色苷的穩定性卻降低了其吸光度值，可能是因為酶與花色苷生成了其他物質，減少或遮蔽了花色苷的某些基團，其抗氧化功能是否也有所變化有待于化學結構、成分分析等方面的深入研究。本實驗加酶修飾后的花色苷穩定性明顯增高，證明了酶促法可以有效的提高花色苷穩定性。

[1]田小燕.刺葡萄花色苷有機酸及黃酮輔色效果研究[D].長沙：湖南農業大學碩士論文，2013.

[2]盧鋒波.黑莓花色苷提取及其輔色研究[D].南京：南京農業大學碩士論文，2010

[3]董楠，宋會歌，劉嘉，等.咖啡酸對胭脂蘿卜紅色素輔色作用及穩定性的影響[J].食品科學，2011，32（7）：61-64.

[4]臧云.藍靛果花色苷酶促衍生物的穩定性及抗氧化研究[D].哈爾濱：東北林業大學碩士論文，2013.

[5]趙壘.平陰玫瑰花花色苷純化工藝優化、分子修飾及應用研究[D].濟南：山東師范大學碩士論文，2011

[6]張智，宋靜，王振宇，等.輔色素對藍靛果花色苷穩定性的影響[J].食品工業科技，2011，32（4）：320-323.

[7]王維茜，鄧潔紅，魏一枝，等.葡萄花色苷的合成及穩定性研究進展[J].中國釀造，2014，33（5）：15-19.

[8]熱合滿·艾拉、迪麗娜爾·買買提.江石榴汁色素穩定性的研究[J].保鮮與加工，2012，12（4）：21-24.

[9]李夢莎.響應面法優化超聲提取黑果腺肋花楸花色苷工藝的研究[J].中國釀造，2014，33（9）：129-133.

[10]周麗萍，朱良玉，張悅.北方主要越橘栽培品種果實品質及抗氧化能力比較[J].中國林副特產，2012，120（5）：4-6.

[11]孫婧超，劉玉田，趙玉平.示差法測定藍莓果酒中的花色苷條件的優化[J].中國釀造，2011，30（11）：171-174.

[12]石映紅.酶催化技術在現代工業中的應用[J].科技資訊，2011，4（10）：96-97.

[13]WANG L,ALBERT N W,ZHANG H B.Temporal and spatial regulation of anthocyanin biosynthesis provide diverse flower colour intensities and patterning in Cymbidium orchid[J].Planta,2014,240(5):983-1002.

[14]DIMITROVSKA M.Anthocyanin composition of Vranec,Cabernet Sauvignon,Merlotand Pinot Noir grapesas indicator of their varietal differentiation[J].Eur Food Res Technol,2011,232(4):591-600.

[15]HOLZWARTH M,KORHUMMEL S.Impact of enzymatic mash maceration and storage on anthocyanin and color retention of pasteurized strawberry purées[J].Eur Food Res Technol,2012,234(2):207-222.

[16]SAKUTA M.Diversity in plant red pigments:anthocyanins and betacyanins[J].Plant Biotechnol Rep,2014,8(1):37-48.

[17]AZUMA A,YAKUSHIJI H,KOSHITA Y,et al.Flavonoid biosynthesis-related genes in grape skin are differentially regulated by temperature and light conditions[J].Planta,2012,236(4):1067-1080.

[18]方忠祥，倪元穎.花青素生理功能研究進展[J].廣州食品工業科技，2001，17（3）：60-62.

[19]李衛業，李群.輻射及活性氧對DNA的損傷以及芥子堿的保護作用[J].植物生理學報，1997，23（4）：319-323.

[20]WANG H,CAO G,PRIOR R L.Oxy radical absorbing capacity of anthocyanins[J].J Agr Food Chem,1997,45(2):304-309.

[21]格日勒，亓偉，劉淑娟.原花青素HPLC測定方法研究進展[J].中國釀造，2014，33（4）：13-16.

[22]王鋒，鄧潔紅，譚興和.花色苷及其共色作用研究進展[J].食品科學，2008，29（1）：472-476.

醬油背后的秘密

最近十年，雞精、醬油、醋、醬、復合調味料等行業都得到了快速發展，催生醬油行業急速成長的原因總結下來可能主要是以下幾點：

1不以價格為局限，以品質提升、消費者口感為追求

市場啟動前，傳統醬油4～5元/瓶的產品就算高檔產品，市場大量的袋裝、散裝及2～3元左右產品是主流?？墒沁@些醬油企業幾乎都沒有被原有的市場價格所局限，通過分析，發現消費者對醬油功能的關注已經從調色轉移到增加鮮味、提升口感上。而滿足這些要素生產出來的醬油往往在上市初期都是走高檔路線，在得到消費者初步認可后，慢慢走向大眾化，漸漸成為常規性產品。海鮮醬油是當時很多企業積極嘗試的一個新產品，這是酵母抽提物和其他鮮味劑進入醬油的一個起步。

2勇于接受并使用新技術、新設備

傳統醬油生產大多使用缸或池，生產的穩定性、大規模復制性都受到局限。為了穩定品質、便于大規模擴張，大罐發酵成為必然選擇，日式高鹽稀態工藝的大罐精準控制優勢顯現無疑。此外伴隨高鹽稀態工藝進入醬油工廠的是醬油酵母等有益功能微生物的使用。其實醬油酵母在工廠的應用并不陌生，只是一直沒有得到明確的行業內宣傳，存在很多認識上的誤區。

為了結合市場需求和行業發展趨勢，研發出醬油活性干酵母，其開發歷程可以劃為四個階段：

第一階段：2010年初國內首次生產出醬油活性干酵母時，對于菌種的性能都尚未完全了解。伴隨著工廠的應用摸索，對酵母的耐溫、耐鹽等性能有了進一步掌握。

第二階段：由于缺乏可以借鑒的經驗，醬油活性干酵母的添加時間、用量以及酵母之間拮抗反應等問題通過反復的應用，最終摸索出來適宜的應用工藝。

第三階段：大批醬油工廠的發酵驗證，為不同酵母菌種的代謝產物分析做了充分驗證，濃郁風格、淡雅風格等差異化需求日漸凸顯。

第四階段：很多醬油酵母并非常規釀酒酵母屬，是魯氏酵母，該類酵母在制備成為干酵母后，常溫條件下無法進行長時間的存儲，酵母活力下降快，這直接影響了醬油酵母的使用效果。研究人員嘗試使用包埋技術、鮮酵母、半干酵母、冷凍干燥等，都沒有得到理想效果。直到研究人員找到酵母激活因子解決生長問題，用干酵母冷凍儲存才徹底消除了醬油酵母應用通路上的最后一個瓶頸。

摘自安琪酵母股份有限公司信息

Experimental analysis of blueberry anthocyanins modified with caffeic acid

ZHU Liangyu,ZHANG Yue*
(Institute of Nature Resources,Heilongjiang Academy of Sciences,Harbin 150040,China)

The anthocyanin of Vaccinium uliginosum from Greater Khingan was extracted by ultrasonic,and then it was purified by purification, column,and concentration.Using blank anthocyanin as control,the anthocyanin was added with caffeic acid and caffeic acid enzyme respectively to conduct acylation reaction,and the stability of anthocyanins was compared.Results showed that after heating at 50℃for 96 h,the anthocyanin preserving rate of the control group,without enzyme group and enzyme group was 77.26%,81.00%and 84.96%,respectively.Caffeic acid can obviously improve the stability of blueberry anthocyanins catalyzed by enzymes.

blueberry;coffee acid;acylation;anthocyanin

Q946.5

A

0254-5071（2015）03-0130-03

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.03.031

2015-01-13

黑龍江省科學院青年創新基金（ZRS20120531）；黑龍江省財政廳應用技術研究專項（kxy20121220）

朱良玉（1984-），女，助理研究員，碩士，研究方向為植物化學。

*通訊作者：張悅（1962-），男，研究員，本科，研究方向為植物資源。