水楊酸?；瘜﹄僦}卜天竺葵素穩定性和抗氧化活性的影響

梁 姍，劉 歡

長江師范學院現代農業與生物工程學院，重慶 408100

花青素(anthocyanin)是黃酮屬的天然色素，廣泛的存在于具有不同顏色的植物中，如藍莓、黑莓和紫甘薯等，在自然狀態下往往與各種糖苷形成花青苷[1，2]。研究表明，花青素具有清除自由基、保護心血管系統、抗癌、皮膚保健和抗衰老等功能[3-5]。從植物中提取天然花青素的技術較成熟，但花青素容易受到金屬離子、二次色素、溫度、光照、pH值等因素的影響，導致色素降解及活性降低[6-8]。研究發現?；梢愿纳茖ㄇ嗨氐念伾Ｗo，提高青素的穩定性。朱玉良等[9]發現對黑枸杞花青素進行蘋果酸?；男允蛊浒胨テ诤捅Ａ袈示@著上升。趙立儀等[10]發現?；{莓花青素及矢車菊素-3-O-葡萄糖苷對溫度、光照、強氧化劑、食品添加劑的穩定性有顯著提高。胭脂蘿卜(carmine radish)是重慶市涪陵區特有的蔬菜品種，主要用于制備食用紅色素，研究發現其紅色素為花青素類天竺葵素，具有良好的抗氧化、抑菌性，但其穩定性較差，如何進一步提高其穩定性成為該色素開發和利用的關鍵[11-13]。本研究采用水楊酸?；蛛x自胭脂蘿卜的天竺葵素，探討其對光照、溫度、pH、抗氧化性等的穩定性，為該色素的進一步開發和利用提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料

天竺葵素采用液相色譜儀分離自胭脂蘿卜(純度> 95%)，由長江師范學院天然產物研究實驗室分離獲得；無水乙醇、氫氧化鈉、硫酸鎂、雙氧水、硫酸亞鐵、硫酸鋅、硫酸鋁、鹽酸、氯化鈉均為國產分析純，為重慶川東化工(集團)有限公司產品；水楊酸為上海遠帆助劑廠產品；維生素C為上海伊卡生物技術有限公司產品。

ΜLtiMate 3000 XR液相色譜儀，美國 Thermo 公司產品 ；Optima MAX-XP，冷凍超速離心機 德國 Beckman 公司產品； UV 3010紫外-可見分光光度計，日本日立科學儀器有限公司產品；UPT 超純水制造機，中國優普公司產品。

1.2 方法

1.2.1 天竺葵素的?；幚?/p>

稱取1.0 g水楊酸加入2 mL沸水溶解，溶解后的水楊酸溶液與天竺葵素溶液按照濃度比1∶1 (w/w)混合，在28 ℃下反應2 h，將反應液稀釋后用紫外分光光度計在200～600 nm波長范圍內進行快速掃描，結果根據在300～350 nm處吸收峰變化來確定?；痆14]。

1.2.2 ?；祗每乇Ａ袈实臏y定方法

采用天竺葵素標準品(HPLC≥98%， CAS：134-04-3)作標準曲線，測定胭脂蘿卜天竺葵素的含量，并通過含量比計算保留率[15]。

保留率(%)=(保存后天竺葵素含量/初始天竺葵素含量)×100

1.2.3 各因素對?；僦}卜天竺葵素穩定性的影響

1.2.3.1 天竺葵素的光穩定性

各取未?；王；?0 mL天竺葵素裝至白色透光的試劑瓶中，放在自然光照條件的壞境中，隔天定時測定其保留率的變化，共測5天。

1.2.3.2 天竺葵素的熱穩定性

取?；c未?；奶祗每厝芤焊?0 mL置于80、100、120 ℃，于2、4、6、8、10 h后分別測定其含量變化。

1.2.3.3 金屬離子對天竺葵素的影響

各取?；c未?；奶祗每孛糠?0 mL，分別加入濃度為0.01 mol/L的硫酸亞鐵、硫酸鎂、硫酸鋁、硫酸鋅溶液，于2、4、6、8、10 h后分別測定其含量變化。

1.2.3.4 pH對天竺葵素的影響

將?；c未?；奶祗每胤謩e用鹽酸和氫氧化鈉溶液調節酸堿度，分別測定pH為2、4、6、8、10、12含量的變化。

1.2.3.5 H2O2對天竺葵素的影響

各取未?；王；?0 mL天竺葵素，分別加入濃度為1%、2%、3% VC溶液和1%、5%、10%過氧化氫溶液，于2、4、6、8、10 h后分別測定其含量變化。

1.2.4 胭脂蘿卜天竺葵素抗氧化活性評價

1.2.4.1 羥基自由基(·OH)的清除

取2 mL 6 mmol/ L硫酸亞鐵溶液、2 mL 6 mmol/ L水楊酸溶液及、2 mL不同濃度的天竺葵素溶液，最后加入2 mL H2O2，混合均勻后37 ℃恒溫水浴中反應30 min，4 000 rpm冷凍離心5 min，取上清液在510 nm下測吸光度作為試驗組，記為Ai；用蒸餾水代替樣品作為空白組，記為A0；以蒸餾水代替H2O2作為對照組，記為Ai0；用VC作為陽性對照，按下式計算對自由基的清除率[16]：

1.2.4.2 DPPH自由基的清除

取2 mL不同濃度的天竺葵素溶液，加入2 mL的 DPPH溶液作為試驗組，在黑暗環境下反應30 min后，在波長517 nm下測定其吸光度(Ai)；以2 mL待測溶液加入2 mL的無水乙醇作對照(Ai0)，以2 mL的DPPH溶液加入2 mL蒸餾水中作空白(A0)，用VC作陽性對照，計算對DPPH自由基的清除率[17]：

1.2.4.3 ABTS自由基的清除

取10 mL，7 mmol/L ABTS和176 μL，140 mmol/L過硫酸鉀混合均勻置于黑暗處室溫反應24 h，得到儲備液。再用乙醇稀釋成工作液，在734 nm波長下吸光度在0.68～0.72范圍內。分別移取0.1 mL不同濃度的天竺葵素溶液于25 mL比色管中，再添加5 mL ABTS工作液，混合均勻后在室溫下反應30 min，于734 nm下測其吸光度，作為試驗組記為Ai；用蒸餾水代替天竺葵素溶液作為空白組記為A0；用乙醇代替ABTS工作液作為對照組記為Ai0。按下列公式計算ABTS自由基的清除率[18]：

2 結果

2.1 ?；僦}卜天竺葵素的紫外吸收光譜

測定胭脂蘿卜天竺葵素在200～600 nm的吸收光譜，觀察在300～350 nm 的波峰情況，如有波峰變化則說明發生了?；痆15]。如圖1所見，胭脂蘿卜天竺葵素與水楊酸發生?；磻?，在紫外光譜中317 nm處出現吸收峰，說明胭脂蘿卜天竺葵素已經?；?。

圖1 胭脂蘿卜天竺葵素的紫外吸收光譜Fig.1 Ultraviolet absorption spectrum of pelargonidin注：A:未?；?；B:?；?；↓:?；辗?。Note:A:unacylation;B:acylation;↓:acylation absorption peak.

2.2 ?；祗每貙庹辗€定性的影響啊

由圖2可見，10天內隨光照時間的延長，未?；c?；祗每乇Ａ袈示饾u下降，?；祗每氐姆€定性均顯著高于未?；奶祗每?P<0.05)，光照第10天時，?；祗每氐谋Ａ袈试?1.28%左右，而未?；祗每氐谋Ａ袈室呀档?1.33%左右。?；蟮奶祗每氐墓夥€定性顯著高于未?；祗每?P<0.05)。

圖2 光照對天竺葵素保留率的影響Fig.2 The effect of illumination on the retention rate of pelargonidin

2.3 ?；祗每貙囟确€定性的影響

由圖3可見，隨著溫度的升高和時間的延長，?；昂筇祗每氐谋Ａ袈示陆?。在80 ℃下2 h后，?；祗每乇Ａ袈示@著大于未?；祗每?P<0.05)。在100 ℃下2 ～6 h，?；祗每乇Ａ袈逝c未?；祗每貨]有顯著性差異，在8 ～10 h時差異極顯著(P<0.01)。120 ℃下2 ～4 h，?；c未?；祗每乇Ａ袈蕸]有顯著性差異，在6 ～10 h時差異顯著(P<0.05)。在80、100、120 ℃加熱10 h后?；祗每乇Ａ袈史謩e為81.59%、71.82%、58.03%，未?；祗每貫?1.59%、60.04%、49.27%，?；祗每鼐@著高于未被?；祗每?，說明?；祗每氐臒岱€定性顯著提高。

圖3 溫度對天竺葵素保留率的影響Fig.3 The effects of temperature on the retention rate of pelargonidin注：A:80 ℃；B:100 ℃；C:120 ℃。Note:A:80 ℃；B:100 ℃；C:120 ℃.

2.4 ?；祗每貙饘匐x子穩定性的影響

由圖4可知，隨著反應時間的增長，0.01 mol/L的四種金屬離子對未?；王；祗每氐姆€定性均有顯著影響(P<0.05)。其中Fe2+、 Mg2+、Zn2+對未?；c?；祗每氐谋Ａ袈视绊懖町惒伙@著，而Al3+對已?；臀歹；祗每氐姆€定性影響有顯著性差異(P<0.05)，說明?；蟮奶祗每貙饘匐x子的穩定性和金屬離子的類型有關，對Fe2+、Mg2+和Zn2+穩定性好于Al3+。

圖4 金屬離子對天竺葵素保留率的影響Fig.4 The effect of metal ion the retention rate of pelargonidin注：A:Fe2+；B:Al3+；C:Mg2+；D:Zn2+。Note:A:Fe2+；B:Al3+；C:Mg2+；D:Zn2+.

2.5 ?；祗每貙H穩定性的影響

天竺葵素受pH影響較大，當pH值小于3時，天竺葵素呈穩定的紅色；當pH值在3～6范圍之間時，紅色變淺；當pH值大于6時，呈不穩定的藍色[19]。由圖5可知，胭脂蘿卜天竺葵素在pH<6時，即酸性條件下較為穩定，在堿性條件下保留率下降顯著(P<0.05)。?；祗每氐谋Ａ袈曙@著高于未?；奶祗每?P<0.05)。

圖5 pH對?；祗每乇Ａ袈实挠绊慒ig.5 The effect of pH on the retention rate of pelargonidin

2.6 ?；祗每貙2O2穩定性的影響

由圖6可知，在反應2～8 h內，添加10%過氧化氫對天竺葵素的保留率無顯著影響(P>0.05)，在8 h后，?；祗每氐谋Ａ袈曙@著高于未?；祗每?P<0.05)，說明在長時間反應后?；祗每貙娧趸瘎┑姆€定性提高，而且短時間內?；祗每氐膬瀯莶⒉伙@著。

圖6 H2O2對天竺葵素保留率的影響Fig.6 The effect of H2O2 on the retention rate of pelargonidin

2.7 ?；祗每乜寡趸钚栽u價

2.7.1 對羥自由基(·OH)的清除效果

由圖7可知，當?；祗每?、未?；祗每嘏cVC濃度在0.5 ～2.5 mg/mL內時，對羥基的清除率均隨濃度的增加而增大。相同濃度的VC對羥自由基的清除率均低于天竺葵素(P<0.05)，?；?/p>

圖7 天竺葵素對羥自由基的清除率Fig.7 Pelargonidin removal rate of hydroxyl radicals

后天竺葵素對羥自由基的清除能力未見顯著差異，說明胭脂蘿卜天竺葵素具有良好的羥自由基清除能力，且水楊酸?；从绊懫淝宄u自由基的能力。

2.7.2 對DPPH自由基的清除效

如圖8所示，當在0.2～0.8 mg/mL間，?；祗每?、未?；祗每睾蚔C對DPPH自由基的清除率均隨著濃度的增加而增加。當濃度達到0.8 mg/mL時，天竺葵素對DPPH清除率達到最高，但低于VC(P<0.05)，?；昂筇祗每貙PPH自由基具有相當的清除效果，說明?；从绊懱祗每貙PHH自由基的清除能力。

圖8 天竺葵素對DPPH自由基的清除率Fig.8 Pelargonidin removal rate of DPPH radicals

2.7.3 對ABTS自由基清除的效果

如圖9所示，?；祗每?、未?；祗每睾蚔C均對ABTS自由基具有明顯清除作用，當濃度在0.2～1.0 mg/mL范圍內時，對ABTS自由基的清除率均隨著濃度的增加而增加，同等濃度下VC對ABTS的清除率高于天竺葵素，當濃度達到0.8 mg/mL后，VC對ABTS自由基清除幾乎達到飽和，1 mg/mL天竺葵素對ABTS自由基清除率達75.2%，?；昂筇祗每貙BTS自由基的清除率無顯著性差異，說明?；⑽从绊懱祗每貙BTS自由基的清除能力。

圖9 天竺葵素對ABTS自由基的清除率Fig.9 Pelargonidin removal rate for ABTS radicals

3 結論

通過對胭脂蘿卜天竺葵素的穩定性進行探究，研究表明天竺葵素的穩定性在一定范圍內與光照、溫度呈反相關，氧化劑、金屬離子、pH對其穩定性也有較大影響。采用水楊酸為?；瘎?，對胭脂蘿卜天竺葵素進行?；?，發現?；祗每卦跍囟雀哂?0 ℃，光照2天、增加Al3+及不同的pH條件下，穩定性均高于未?；祗每?，?；c未?；祗每貙e2+、Mg2+和Zn2+以及H2O2無顯著影響。說明?；沟闷淠透邷?、耐光性能有了較大的改良，對工業生產過程中的溫度及光照有更好的耐受性。

研究還對?；拔歹；祗每剡M行各項抗氧化指標測定，分析水楊酸?；瘜μ祗每氐捏w外抗氧化活性的影響，發現?；祗每貙αu自由基、DPPH自由基和ABTS自由基的清除能力與未?；祗每責o顯著差異，表明水楊酸?；祗每氐姆€定性優于未經修飾的天竺葵素，且對其抗氧化活性無影響影響，有較高的開發應用和研究價值，其機理及應用技術還需進一步研究。