高效液相色譜法測定黑莓果汁及黑莓啤酒中的γ-氨基丁酸

胡雪蓮，王宏華，王莉娜

（北京燕京啤酒集團公司技術中心，啤酒釀造技術北京市重點實驗室，北京101300）

高效液相色譜法測定黑莓果汁及黑莓啤酒中的γ-氨基丁酸

胡雪蓮，王宏華，王莉娜

（北京燕京啤酒集團公司技術中心，啤酒釀造技術北京市重點實驗室，北京101300）

建立了一種黑莓果汁及黑莓啤酒中測定γ-氨基丁酸的高效液相色譜法。采用6-氨基喹啉基-N-羥基琥珀酰亞氨基甲酸酯(AQC)為柱前衍生試劑，色譜柱為Waters AccQoTagTM氨基酸分析柱，梯度洗脫，紫外檢測波長248 nm。結果表明γ-氨基丁酸線性方程為y=21 012x+155 852，在1～1 000 mg/L范圍內呈現良好線性關系，相關系數R2=0.999 4，綜合黑莓原汁、濃縮汁及黑莓啤酒樣品的結果，加標回收率為87.9%～114.9%，相對標準偏差為2.7%～12.3%，檢出限為0.7 mg/L。采用此法檢測黑莓果汁及黑莓啤酒中的γ-氨基丁酸方法簡便易行，結果穩定性好。

6-氨基喹啉基-N-羥基琥珀酰亞氨基甲酸酯；柱前衍生；高效液相色譜；γ-氨基丁酸；黑莓果汁；黑莓啤酒

黑莓是新興的漿果類水果[1]，除少部分直接鮮食外，大部分用于加工制成果汁、果醬、速凍干果等食品[2]。黑莓富含維生素、粗蛋白、糖、超氧化物歧化酶及硒等多種有益元素，黑莓中的氨基酸含量較高，并且富含γ-氨基丁酸[3]。γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）又稱氨酪酸，是一種非蛋白質天然氨基酸，為哺乳動物中樞神經系統一種重要的抑制性神經遞質[4]，已有研究表明，GABA具有激活腦內葡萄糖代謝、促進乙酰膽堿合成、降血氨、抗驚厥、降血壓、恢復腦細胞的功能等多種藥理作用[5]。GABA作為一種新型的功能食品因子，已經廣泛的應用于飲料、果醬、糕點、餅干、調味品等制品中[6]。啤酒是一種深受廣大消費者喜愛的低酒精度飲料，如能將黑莓與啤酒的釀造過程有機結合而研制出黑莓啤酒，既能保持啤酒的固有風格，又能突出黑莓的獨特口味而使啤酒具有一定的保健功能，將為黑莓的深加工找到一條新路，也將極大地豐富啤酒的花色品種，滿足各層次消費者的需求。

目前國內外對GABA測定的方法主要有酶法、毛細管電泳法、紙層析法、比色法、氣相色譜法、液相色譜法[7-12]等。隨著色譜技術的發展，高效液相色譜法因其樣品預處理簡單，方法準確度、精密度及靈敏度較高，在測定食品的應用中日益廣泛。目前已有對三七地上部分[13]、南瓜葉[14]和紅茶[15]中γ-氨基丁酸含量測定的相關報道。本研究采用6-氨基喹啉-N-羥基琥珀酰亞氨基甲酸酯（6-aminoquinoline-N-hydroxysuccinimido carbamate，AQC）作衍生試劑，對黑莓果汁及黑莓啤酒中γ-氨基丁酸的含量進行測定。衍生產物中的喹啉基團是提高檢測靈敏度的關鍵，生成在室溫條件下可穩定一周的高穩定性的脲，衍生物經高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）分離后經紫外檢測器檢測，可得到理想的結果。本實驗建立了黑莓果汁及黑莓啤酒中γ-氨基丁酸高效液相色譜分析方法，為黑莓啤酒的進一步研究提供方法參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑莓原汁、黑莓濃縮汁：市售；試驗酒：燕京小試開發黑莓啤酒。

γ-氨基丁酸標準樣品：美國Sigma公司；乙腈（色譜級）：美國Fisher公司；AccQ·FlourTM衍生試劑盒（1硼酸鹽緩沖液；2B稀釋液；2A衍生試劑粉末）、AccQ·Tag流動相A濃液：美國Waters公司；Milli-Q超純水：德國Merck Millipore公司；85%磷酸（分析純）：北京化學試劑廠。

1.2 儀器與設備

Waters 2489液相色譜儀（真空脫氣器、四元泵、自動進樣器、柱溫箱、紫外檢測器）：美國Waters公司；MVS-1型旋渦混合器：北京金北德工貿有限公司；Eppendorf Centrifuge 5430R離心機：德國Eppendorf艾本德公司；101-3EBS型電熱鼓風干燥箱：北京光明醫療儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 衍生試劑的配制

AccQ·FLourTM試劑盒中的2A瓶，裝有稱量好的的衍生劑粉末，用乙腈配制后即得10 mmol/L的AccQ·FLourTM衍生試劑。配制方法如下：將干燥箱預熱至55℃；吸取1 m L 2B稀釋劑放入2A瓶中，加蓋密封；搖蕩10 s；置干燥箱中加熱，至衍生劑粉末全部溶解。加熱時間一般需要30 m in，若有不溶物，可適當延長加熱時間，備用。

1.3.2 樣品處理

黑莓果汁：將黑莓果汁搖勻，倒入離心管中，于6 000 r/min的條件下離心10m in，取上清液，經0.2μm濾膜過濾后備用。取10 μL濾液至干凈的6 mm×50 mm樣品衍生管底部，吸取70 μL硼酸鹽緩沖液（pH值為8.8）至樣品管中，渦旋混合，再吸取20 μL AQC衍生試劑到樣品管中，立即渦旋混勻10 s，室溫放置1 m in；用石蠟膜封口，置55℃干燥箱內加熱10min，取出轉移至樣品瓶中，10μL進樣，供HPLC分析。

黑莓濃縮汁：需用水稀釋10倍，其他處理同上。

黑莓啤酒：取50 m L樣品用折疊濾紙過濾除氣，再用0.2 μm濾膜過濾備用。其他處理同上。

1.3.3 標準溶液的制備

準確稱取100 mgγ-氨基丁酸標準物質至100 m L容量瓶中，用蒸餾水溶解并定容，配制成1 000 mg/L的貯備液，冷藏備用。標準工作溶液用水把貯備液稀釋成40.0mg/L（現用現配）。取10 μL該工作標準溶液至干凈的6 mm×50 mm樣品衍生管底部，吸取70 μL硼酸鹽緩沖液（pH值8.8）至樣品管中，渦旋混合，再吸取20 μL AQC衍生試劑到樣品管中，立即渦旋混勻10 s，室溫放置1 m in；用石蠟膜封口，置55℃干燥箱內加熱10 min，取出轉移至樣品瓶中，10 μL進樣，供HPLC分析。

1.3.4 色譜條件

色譜柱：Waters AccQ·TagTM氨基酸分析柱（3.9 mm× 150 mm，4 μm）；流動相A：AccQ·Tag A濃液與水1∶10（V/V）稀釋；流動相B：100%乙腈；流動相C：100%水。流速：1 m L/min；梯度洗脫程序如表1所示；檢測波長：248 nm；柱溫：37℃；進樣量：10 μL。

表1 梯度洗脫程序表Table 1 Gradient elution program table

2 結果與分析

2.1 色譜條件的選擇

用HPLC法測定黑莓果汁中的GABA含量時，流動相組成及配比影響被分析物的分離效果。實驗表明，以AccQ·Tag氨基酸分析方法為基礎，采用AccQ·Tag A濃液與水稀釋液1∶10（V/V）、乙腈、水溶液為流動相，參照該方法中的梯度，未能使GABA與其他成分有效分離。為了避免雜質對目標峰的干擾，在雜質出峰時間段（19～26 min）對流動相配比進行調整（表1），γ-氨基丁酸的標準工作溶液和典型樣品的色譜圖見圖1。

圖1 γ-氨基丁酸的標準工作溶液(a)和黑莓原汁(b)、黑莓濃縮汁(c)、啤酒樣品(d)的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of γ-aminobutyric acid standard solution(a),blackberry juice(b),blackberry concentrated juice(c)and blackberry beer(d)

由圖1可知，在上述色譜條件下，標準液和樣品液在AccQ·TagTM色譜柱上得到了很好的洗脫和分離，γ-氨基丁酸標準品在柱上的保留時間是22.591m in。從色譜圖可以看出，其他雜質對測定沒有干擾，該方法能很好的對GABA進行分離。采用以上色譜條件檢測黑莓果汁中的GABA含量，目標峰峰形尖銳，分離度好，保留時間合適，方法專屬性良好。2.2線性關系和靈敏度

圖2 γ-氨基丁酸標準曲線Fig.2 Standard curve of γ-aminobutyric acid

將標準貯備液適當稀釋，配制成系列質量濃度梯度的標準溶液，在1.3.4條件下依次測定，以峰面積（y）為縱坐標，γ-氨基丁酸質量濃度（x）為橫坐標繪制標準曲線，進行線性回歸分析，結果見圖2。其線性回歸方程為y=21 012x+ 155 852，相關系數R2為0.999 4，線性范圍為0～1 000 mg/L，并以3倍信噪比，得出方法檢出限為0.7 mg/L。結果表明，線性關系良好，靈敏度較高。

2.3 準確度和精密度

選取黑莓原汁、黑莓濃縮汁和黑莓啤酒樣品，分別添加不同質量濃度的GABA標準溶液，按本方法進行測定，每個質量濃度做6個平行樣品。同時做空白實驗，均扣除本底值后計算加標回收率和相對標準偏差，試驗結果見表2。由表2可知，GABA在黑莓原汁中的加標回收率為97.7%～106.7%，相對標準偏差為2.7%～9.1%；在黑莓濃縮汁中的加標回收率為87.9%～114.9%，相對標準偏差試驗（relative standard deviation，RSD）為5.7%～10.9%，在黑莓啤酒中的加標回收率為90.5%～112.6%，相對標準偏差為5.1%～12.3%。本方法的準確度及精密度能滿足黑莓果汁及黑莓啤酒中GABA的分析要求。

2.4 樣品的檢測與分析

應用本方法對市售黑莓果汁產品及試驗中黑莓啤酒樣品進行測定（3種黑莓原汁；2種黑莓濃縮汁；5種黑莓啤酒），其γ-氨基丁酸含量檢測結果見表3。

表3 黑莓果汁及黑莓啤酒中的γ-氨基丁酸含量Table 3 γ-aminobutyric acid content in blackberry juice and blackberry beer

從表3結果可以看出，黑莓原汁的GABA含量為224.8～247.3 mg/L，黑莓濃縮汁的含量為2 053.6～2 101.3 mg/L，黑莓啤酒中GABA的含量為65.5～73.1 mg/L。

3 結論

建立了一種測定黑莓果汁及黑莓啤酒中GABA高效液相色譜方法，并對該方法進行了精密度和準確度的驗證實驗，綜合黑莓原汁、濃縮汁及黑莓啤酒樣品的結果，該法的相對標準偏差為2.7%～12.3%；樣品中加標回收率為87.9%～114.9%，可以滿足對黑莓啤酒及果汁中GABA的檢測要求；本方法靈敏度高，專一性強，檢出限為0.7 mg/L?？勺鳛橘|量監督控制的有效方法，為其穩定生產提供高效的技術保障。

[1]王衛東.黑莓清汁的制備[D].無錫：江南大學博士學位論文，2008.

[2]杜傳寶.黑莓的營養價值及市場前景概況[N].中國特產報，2007-03-01.

[3]單聯剛.黑莓果醋生產工藝的研究[J].中國釀造，2010，29（9）：158-159.

[4]趙宏飛，宋偉，裴家偉，等.食品中三種γ-氨基丁酸檢測方法比較[J].中國乳品工業，2008，36（11）：51-55.

[5]鄭紅發，黃亞輝，黃懷生，等.茶葉中γ-氨基丁酸提取、分離及薄層掃描測定的研究[J].食品科學，2008，29（4）：347-351.

[6]許建軍，江波，許時嬰，等.γ-氨基丁酸（GABA）——一種新型的功能食品因子[J].食品工業科技，2003，24（1）：109-110.

[7]劉惠文.高效液相色譜法測定南瓜粉中的4-氨基丁酸[J].色譜，2001，19（6）：532-533.

[8]屈樂軼，馬永昆，李祥波.基于GC-MS和嗅聞聯用的不同品種黑莓果酒香氣成分分析[J].中國釀造，2009，28（6）：146-169.

[9]張暉，吳勝芳，姚惠源.OPA柱前自動衍生-紫外檢測米胚芽中的γ-氨基丁酸的HPLC法研究[J].食品與發酵工業，2003，29（10）：50-52.

[10]黃熠，黃蘭芳，郭方道，等.高效液相色譜法測定生物體液中γ-氨基丁酸[J].分析科學學報，2006，21（1）：13-15.

[11]張琳琳，舒小麗，盧懷江，等.富含γ-氨基丁酸降壓功能稻米研究進展[J].核農學報，2006，20（3）：218-221.

[12]KOMATSUZAKI N,TSUKAHARA K,TOYOSHIMA H,et al.Effect of soaking and gaseous treatment on GABA content in geminated brown rice[J].J Food Eng,2007,78(2):556-560.

[13]楊晶晶，劉英，崔秀明，等.高效液相色譜法測定三七地上部分氨基丁酸的含量[J].中國中藥雜志，2014，39（4）：606-609.

[14]黃美娥，彭勝，陳陽波，等.南瓜葉中γ-氨基丁酸的提取及薄層掃描測定[J].天然產物研究與開發，2012（24）：1284-1287.

[15]吳琴燕，馬圣洲，張文文，等.柱前衍生高效液相色譜法檢測紅茶中γ-氨基丁酸[J].江蘇農業學報，2014，30（6）：1534-1536.

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《中國釀造》雜志社

Determination of γ-aminobutyric acid in blackberry juice and blackberry beer by HPLC

HU Xuelian,WANG Honghua,WANG Lina
(Beijing Key Laboratory of Beer Brew ing Technology,Technical Center of Beijing Yanjing Beer Group Corporation,Beijing 101300,China)

The determination method forγ-aminobutyric acid in blackberry juice and blackberry beer was established by HPLC.Using 6-amino quinolyl-N-hydroxy succinimidyl carbamate(AQC)as pre-column derivatization reagent,and Waters AccQoTagTM amino acid column as analysis column,gradient elution was conducted and the detection wavelength was 248 nm.The results showed that the linear equation was y=21 012x+155 852, γ-aminobutyric acid presented good linear relationship in the range of 1-1 000 mg/L,the correlation coefficient R2=0.999 4.The comprehensive recovery rate results of blueberry juice,concentrated juice and blueberry beer was 87.9%-114.9%,the relative standard deviation was 2.7%-12.3%, and the detection lim it was 0.7 mg/L.This method was simple for γ-aminobutyric acid determination in blackberry juice and blackberry beer,and the results showed good stability.

AQC;pre-column derivatization;HPLC;γ-aminobutyric acid;blackberry juice;blackberry beer

O 652.1

A

0254-5071（2015）03-0150-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.03.036

2015-01-12

燕京啤酒集團公司內部課題

胡雪蓮（1985-），女，工程師，本科，研究方向為檢驗分析。