神經肽Y對小神經膠質細胞活化狀態和生成TNF-α的影響及其作用機制

李琦軍，常軍英，吳永波，邢兆國*，周紅艷，賈東昭

(1.河北省石家莊市第三醫院創傷一科，河北 石家莊 050011；

2.河北省石家莊市公安局法醫損傷檢驗鑒定室，河北 石家莊 050011)

·論著·

神經肽Y對小神經膠質細胞活化狀態和生成TNF-α的影響及其作用機制

李琦軍1，常軍英1，吳永波2，邢兆國1*，周紅艷1，賈東昭1

(1.河北省石家莊市第三醫院創傷一科，河北 石家莊 050011；

2.河北省石家莊市公安局法醫損傷檢驗鑒定室，河北 石家莊 050011)

[關鍵詞]神經肽-Y；小神經膠質細胞；腫瘤壞死因子α

doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2015.04.029

小膠質細胞是一種廣泛分布于中樞神經系統的巨噬細胞。正常狀態下，小膠質細胞處于靜息狀態，當內環境發生變化時迅速被激活，激活后的小膠質細胞能夠釋放白細胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)等大量生物活性物質，這些活性物質過度釋放并積聚于中樞神經系統會導致神經元損傷[1-3]。神經肽Y(neuropeptide Y，NPY)是一種多肽類物質，廣泛分布于中樞及周圍神經系統。最近Ferreira等[4]的研究表明，NPY可以抑制脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)所致的小鼠小膠質細胞N9細胞株的激活，降低其吞噬能力，減少IL-1β生成。但NPY對體外培養的大腦皮質小膠質細胞生物活性的調節，以及與其相關的細胞因子生成的關系還未見報道。本研究旨在探討NPY對體外培養的原代大鼠皮層小膠質細胞的生物活性和小膠質細胞來源的TNF-α生成的影響及其作用機制。

1材料與方法

1.1實驗動物24 h內新生雄性SD大鼠30只[清潔級，河北省實驗動物中心提供，動物生產許可證號SCXK(冀)2013-1-03]。

1.2主要試劑小鼠單克隆抗體IBA-1 (美國Sigma公司)；異硫氰酸熒光素(FITC)標記的山羊抗小鼠IgG(美國Proteintech公司)；LPS(美國Sigma公司)；胎牛血清(美國Gibco公司)；DMEMF12培養液(美國Gibco公司)；BIBP3226(美國Tocris Bioscience公司)；NPY(美國ENZO公司)；ELISA試劑盒(中國Bio-Swamp公司)； Trizol(美國Invitrogen公司)；逆轉錄聚合酶鏈反應(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)試劑盒 (美國Promega公司)；RNA酶抑制劑(RNasin) (美國Promega公司)；PCR擴增試劑盒(美國Promega公司)；隨機引物(美國Promega公司)。

1.3小膠質細胞培養堆24 h內新生大鼠無菌環境下開顱取腦，剝除腦膜及血管，取部分大腦皮質，剪碎后用0.125%胰蛋白酶37 ℃消化15 min，終止消化，反復吹打成懸液，1 000 r/min離心5 min后過濾，棄上清，在沉淀物中加入膠質細胞培養液，膠質細胞培養液為含10%胎牛血清，1 U/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素的DMEM/F12培養液，制成細胞懸液，接種于250 mL培養瓶中，37 ℃，5%CO2環境中培養。第2天全量換液1次，以后每3 d更換1/2體積培養液。培養至第14天，細胞充分分層生長后，置于37 ℃恒溫搖床中180 r/min振搖2 h，收集細胞懸液，1 000 r/min離心5 min，去上清，用DMEM/F12全培養基吹打成細胞懸液，將細胞調至約1×105/mL，種植到預先鋪好多聚賴氨酸的6孔板內，每孔3 mL。在恒溫培養箱內靜置30 min后完全換液1次，去除少突膠質細胞，加入 DMEM/F12完全培養基繼續培養3~5 d。

1.4形態學觀察分離純化好的小膠質細胞分別以1×104個細胞/皿接種于3個預先放置經多聚賴氨酸處理過的蓋玻片的3.5 cm培養皿，培養3 d后換新鮮無血清膠質細胞培養液培養12 h使細胞同步化，然后分別更換為無血清膠質細胞培養液、含LPS(終濃度為100 μg/L)的無血清膠質細胞培養液和先加入NPY(終濃度為1 μmol/L)0.5 h后再加入 LPS (終濃度為100 μg/L)的無血清膠質細胞培養液繼續培養6 h后取出蓋玻片，以IBA-1為一抗，行免疫細胞化學染色，熒光顯微鏡下觀察原代大鼠皮質小膠質細胞的形態。

1.5小膠質細胞分組及處理方法將分離純化好的小膠質細胞以2×104個細胞/孔接種于預鋪多聚賴氨酸的24孔培養板用于TNF-α蛋白檢測，以5×105個細胞/孔接種于6孔培養板用于TNF-α mRNA的檢測。培養3 d后換新鮮無血清膠質細胞培養液培養12 h使細胞同步化，然后將細胞分為Control組、LPS組、NPY+LPS組、NPY組和BIBP3226+NPY+LPS組，每組3個樣本。Control組細胞以無血清膠質細胞培養液孵育6 h，LPS組細胞以含終濃度為100 μg/L LPS的無血清膠質細胞培養液孵育6 h，NPY+LPS組細胞先以含NPY (終濃度為1 μmol/L)的無血清膠質細胞培養液孵育0.5 h，然后加入LPS(終濃度為100 μg/L)繼續孵育6 h。BNPY組細胞以含NPY (終濃度為1 μmol/L) 無血清膠質細胞培養液孵育6 h。BIBP3226+NPY+LPS組細胞先用含NPY Y1受體阻斷劑BIBP3226 (終濃度為1 μmol/L)的無血清膠質細胞培養液孵育0.5 h，再加入終濃度為1 μmol/L的NPY孵育0.5 h，最后加入終濃度100 μg/L的LPS繼續孵育6 h。

1.6NPY和LPS處理后的小膠質細胞培養液中TNF-α蛋白含量的檢測取各組小膠質細胞培養液，離心后采用ELISA法檢測培養液中 TNF-α蛋白含量。

1.7NPY和LPS處理后的小膠質細胞中TNF-α mRNA表達水平的檢測采用實時熒光定量PCR法檢測上述各組小膠質細胞中的TNF-α mRNA表達水平。小膠質細胞加入Trizol(1 mL/孔)，吹打后移至去核酶的離心管中，靜置5 min。每管加入0.2 mL氯仿，振蕩15 s，靜置5 min。12 000 r/min離心15 min，把上層無色液體移到新的離心管中。加入等體積的異丙醇，顛倒混勻。4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，管底可見羽毛狀白色沉淀物，完全棄去上清。加入1 mL 75%乙醇(DEPC水配置)，洗滌沉淀。4℃ 7 500 r/min離心5 min，棄上清。靜置晾干3~5 min，加入20~30 μL DEPC水充分溶解RNA。1%瓊脂糖凝膠電泳證實RNA完整性較好，無污染。紫外分光光度計檢測RNA濃度。上海生工生物公司合成引物。TNF-α引物序列為正義鏈引物:5′-TGCCTCAGCCTCTTCTCATT-3′，反義鏈引物:5′-GCTTGGTGGTTTGCTACGAC-3′，擴增長度 208 bp；GAPDH引物序列正義鏈引物:5′-TGAACGGGAAGCTCACTGG-3′，反義鏈引物:5′-GCTTCACCACCTTCTTGATGTC-3′，擴增長度120 bp。實時PCR反應中反轉錄反應體系為總 RNA 8 μL，隨機引物 1 μL，2×ES 混合物10 μL，RT/RI酶體系 1 μL，總體積20 μL。擴增體系為2×UltraSYBR 混合物(含 ROX)10 μL，上游引物(10 μmol/L)1 μL，下游引物(10 μmol/L)1 μL，cDNA 8 μL，總體積20 μL。RT-PCR反應程序參數：預變性 95 ℃ 10 min；變性 95 ℃ 15 s，退火 58 ℃ 20 s，延伸 72 ℃ 27 s，40個循環。用ABI 7300 Real-Time PCR System(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)檢測并計算目的基因表達量與內參GAPDH比較的相對值(RQ值)。

2結果

2.1經LPS和NPY處理后體外培養的大鼠大腦皮質小膠質細胞的形態學變化Control組細胞呈分枝狀外觀，胞體較小，有細長的突起，細胞表達IBA-1。LPS組小膠質細胞處于活化狀態，胞體變為圓形和阿米巴狀，突起回縮，IBA-1染色加深。NPY+LPS組小膠質細胞大部分為非活化狀態，成多角形，有長的突起，IBA-1染色陽性，但比LPS組熒光強度明顯減弱。

2.2不同培養液孵育小膠質細胞后培養液中TNF-α蛋白含量的變化各組小膠質細胞培養6 h后，LPS組與BIBP3226+NPY+LPS組中TNF-α的含量顯著高于Control組(P<0.05)，LPS組與BIBP3226+NPY+LPS組之間差異無統計學意義；LPS+NPY組與LPS組相比，培養液中TNF-α含量顯著降低(P<0.05)；BIBP3226+NPY+LPS組與LPS+NPY組相比，培養液中TNF-α的含量顯著增高(P<0.05)；NPY組與Control組差異無統計學意義。見表1。

2.3不同培養液孵育小膠質細胞后小膠質細胞中TNF-α mRNA、水平的變化各組小膠質細胞6 h后，LPS組和BIBP3226+NPY+LPS組小膠質細胞的TNF-α mRNA表達水平顯著高于Control組(P<0.05)，LPS組與BIBP3226+NPY+LPS組差異無統計學意義；與LPS組相比，LPS+NPY組小膠質細胞中的TNF-α mRNA表達水平明顯降低(P<0.05)；與LPS+NPY組相比，BIBP3226+NPY+LPS組小膠質細胞中的TNF-α mRNA表達水平顯著增高(P<0.05)；NPY組與Control組差異無統計學意義。見表1。

表1　各組小膠質細胞培養液中TNF-α含量及小膠質細胞中TNF-α mRNA表達水平

*P<0.05與Control組比較#P<0.05與LPS組比較△P<0.05與LPS+NPY組比較☆P<0.05與NPY組比較(LSD-t檢驗)

3討論

近年來免疫在神經系統疾病中的作用受到越來越多的關注。小膠質細胞廣泛分布于中樞神經系統，在免疫功能調節方面起著重要作用。很多資料顯示小膠質細胞激活和中樞神經系統很多疾病有關，如阿爾茨海默病、帕金森綜合征、腦缺血等中樞神經系統病變[5-7]。當中樞神經系統發生病理變化時，小膠質細胞能夠迅速作出反應，由靜止狀態變為激活狀態，胞體變大，成阿米巴狀，特異性標志產物增加，吞噬能力增強。小膠質細胞活化后產生大量細胞因子等生物活性物質，如IL-1β、TNF-α、一氧化氮等，這些物質的大量積聚會對神經元產生毒害作用，這可能是小膠質細胞活化后導致神經元損傷的重要途徑之一。TNF-α是最常見的損傷性細胞因子，也是小膠質細胞激活后釋放的前炎癥因子，在中樞神經系統多種生理和病理過程中發揮重要作用。

NPY全名神經肽酪氨酸，是一種廣泛存在于中樞神經系統中的神經肽，與癲癇、學習、記憶、攝食和內分泌都有著密切關系。NPY 通過與不同的受體結合在體內發揮不同的作用，NPY 受體都屬于 G 蛋白的偶聯受體，在人體內包括Y1、Y2、Y3、Y4、Y5 5種亞型。其Y1受體與機體免疫功能的調節有密切關系，NPY通過其Y1受體影響細胞遷移、細胞因子釋放、抗體產生等多個方面[8-10]。周江睿[11]的研究顯示，NPY對炎癥因子的調節具有雙面性，一方面，NPY能夠抑制腹腔巨噬細胞釋放炎性因子IL-1β、TNF-α、IL-6 和前列腺素B2，另一方面，NPY能夠促進腹腔巨噬細胞晚期炎癥因子HMGB1 的分泌。最近Ferreira等[12]的研究表明，小鼠小神經膠質細胞株N9細胞表達NPYY1受體，NPY可以抑制LPS所致N9細胞的激活，減少IL-1β、一氧化氮的生成；NPY還能抑制N9細胞的吞噬作用和遷移能力，當阻斷NPY Y1受體后，這種抑制作用消失。但NPY對原代培養的中樞神經系統小膠質細胞的影響還未見報道，如果NPY能夠降低原代培養的中樞神經系統的小膠質細胞的免疫活性，減少TNF-α等炎癥因子的生成，那么它有可能在中樞神經系統內通過神經-免疫途徑起到保護神經元的作用。本研究采用LPS為小膠質細胞的激活劑，LPS處理小膠質細胞 6 h后，小膠質細胞處于明顯的活化狀態，細胞體積增大，突觸回縮，由分支狀變為圓形、梭形或者阿米巴狀，特征性標志物IBA-1免疫染色加深，小膠質細胞的免疫活性也隨之增強，小膠質細胞培養液中TNF-α含量與小膠質細胞細胞中TNF-α mRNA表達水平均明顯增高，與Conreol組差異有統計學意義。加入NPY后能夠明顯抑制LPS對小膠質細胞的激活作用，使大部分小膠質細胞處于非活化狀態，降低了小膠質細胞培養液中TNF-α含量和小膠質細胞細胞內的TNF-α mRNA表達水平，使用BIBP3226阻斷NPY Y1受體后這種抑制作用完全消失，說明NPY有可能通過Y1受體起到降低小膠質細胞的免疫活性、減少小膠質細胞來源的TNF-α產生。NPY處理非活化的小膠質細胞后，培養液中TNF-α含量及小膠質細胞細胞內的TNF-α mRNA水平均未發生明顯變化，說明NPY對靜止期的小膠質細胞影響不大。本研究結果表明，NPY對中樞神經系統內的小膠質細胞的免疫活性有調節作用，NPY能下調中樞神經系統內小膠質細胞的免疫活性，抑制TNF-α的產生，這種作用可能是通過其Y1受體實現的，這為NPY以小膠質細胞為靶點治療與免疫有關的中樞神經系統疾病提供了實驗依據。

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(本文編輯：趙麗潔)

[收稿日期]2014-07-03；[修回日期]2014-08-04

[作者簡介]李琦軍(1972-)，男，河北正定人，河北省石家莊市第三醫院副主任醫師，醫學博士，從事創傷骨科疾病診治研究。

*通訊作者

[中圖分類號]R322.8

[文獻標志碼]B

[文章編號]1007-3205(2015)04-0463-04

[摘要]目的探討神經肽Y(neuropeptide Y，NPY)對原代小神經膠質細胞生物活性及生成腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)的影響及其作用機制。方法培養原代大鼠皮層小膠質細胞，將細胞分為Control組、脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)組、NPY+LPS組、NPY組和BIBP3226+NPY+LPS組，分別用無血清膠質細胞培養液、含LPS的無血清膠質細胞培養液、含NPY和LPS的無血清膠質細胞培養液、含NPY的無血清膠質細胞培養液和含BIBP3226、NPY和LPS無血清膠質細胞培養孵育細胞6 h。經免疫細胞化學熒光染色后，顯微鏡下觀察小膠質細胞的形態學變化。ELISA方法檢測培養液中TNF-α蛋白含量，RT-PCR方法檢測小膠質細胞中TNF-α mRNA表達水平。結果LPS組TNF-α的含量及細胞中TNF-α mRNA表達水平顯著高于Control組(P<0.05)，小膠質細胞處于活化狀態；LPS+NPY組與LPS組相比，TNF-α蛋白和mRNA表達水平明顯降低(P<0.05)，小膠質細胞活化水平降低；BIBP3226+NPY+LPS組與LPS+NPY組相比，TNF-α蛋白和mRNA表達水平顯著增高(P<0.05)；LPS組與BIBP3226+NPY+LPS組差異無統計學意義；NPY組與Control組差異無統計學意義。結論NPY可以降低小神經膠質細胞的生物活性，抑制其生成TNF-α，作用機制可能與NPY Y1受體有關。