p300 RNA干擾慢病毒載體的構建及其在CNE-2細胞中的表達

廖志偉，羅鍵雄，喻　芳，余宏偉，莊雅靖，周同沖，劉孟忠

(1.廣州醫科大學附屬腫瘤醫院，廣東 廣州 510095；

2.中山大學腫瘤防治中心放療科，廣東 廣州 510060；3.廣州醫科大學第三臨床學院，廣東 廣州 510180)

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p300 RNA干擾慢病毒載體的構建及其在CNE-2細胞中的表達

廖志偉1,2，羅鍵雄3，喻芳1，余宏偉1，莊雅靖1，周同沖1，劉孟忠2

(1.廣州醫科大學附屬腫瘤醫院，廣東 廣州 510095；

2.中山大學腫瘤防治中心放療科，廣東 廣州 510060；3.廣州醫科大學第三臨床學院，廣東 廣州 510180)

[摘要]目的構建p300基因RNA干擾慢病毒載體獲得穩定感染的人鼻咽癌CNE-2細胞株，以觀察CNE-2細胞中p300的表達及其功能。方法設計p300基因特異性RNA干擾靶序列，與經HpaI和XhoI酶切后的載體連接，產生重組慢病毒質粒pLL-GFP-Puro-shp300，篩選陽性克隆，測序鑒定，與慢病毒包裝載體共轉染293T細胞，包裝產生慢病毒，對病毒滴度和感染效率進行檢測。結果pLL-GFP-Puro-shp300慢病毒RNA干擾載體經酶切和測序鑒定證實準確連接測序正確，且包裝出來的病毒純化后滴度達107TU·mL-1。RT-qPCR、Western blot結果顯示感染后p300 mRNA及蛋白水平顯著下降，證明重組慢病毒對CNE-2細胞p300基因表達有明顯沉默作用。結論成功構建靶向p300基因RNA干擾慢病毒載體，為進一步研究p300在鼻咽癌發生過程中的作用奠定基礎。

[關鍵詞]p300；鼻咽癌；慢病毒載體

p300是人體重要的乙?；D移酶，在食管癌[1]、肝癌[2]、乳腺癌[3]、結直腸癌[4]等惡性腫瘤組織中表達明顯增高，提示p300在腫瘤的形成、增殖、轉移中起重要作用。為進一步明確p300在鼻咽癌轉移中的作用，本研究嘗試構建針對p300的RNA干擾慢病毒載體并檢測其感染效率，為進一步研究p300在鼻咽癌發生過程中的作用奠定基礎，旨在探討其作為靶向治療的可能性。

1材料與方法

1.1主要實驗材料及試劑人鼻咽癌細胞株CNE-2購自中山大學細胞庫，293T細胞購自美國ATCC細胞庫，細胞培養及保存于廣州永諾生物科技有限公司。慢病毒載體及包裝系統pLL3.7-GFP-Puro質粒、pMD2.G(VSVG)質粒、pMDLg/pRRE質粒、pRSV-Rev質粒均購自廣州永諾生物科技有限公司。限制性內切酶HpaI及XhoI購自美國NEB公司。質粒大提試劑盒購自德國QIAGEN公司。高純質粒小量提取試劑盒和Tran5α感受態細胞購自北京全式金生物技術有限公司。Opti-MEM培養基、RPMI1640培養基、胎牛血清及Lipofectamine 2000均購自美國Gibco公司。

1.2方法

1.2.1慢病毒載體構建根據GenBank注冊的p300(NM_001429.3)序列，利用Promega、Dharmaco和Invitrogen公司提供的RNA靶序列分析設計軟件，結合siRNA靶序列設計原則，依據莖環結構的特點，分別合成2對shRNA單鏈，兩端加上HpaI和XhoI限制性內切酶位點。設計好的序列送至上海捷瑞生物工程有限公司合成。合成相應的DNA單鏈，退火形成具有黏性末端的DNA雙鏈，與經過HpaI和XhoI雙酶切的線性化pLL3.7-GFP-Puro載體連接。連接產物轉化至Tran5α感受態細胞中，菌液涂布于含有氨芐青霉素的LB瓊脂平板上，37 ℃培養過夜。選取陽性克隆，質粒小提，用HpaI和XhoI雙酶切電泳鑒定提取的質粒，酶切鑒定正確的質粒送測序。經QIAGEN試劑盒大提測序正確的質粒后低溫保存。針對p300的編碼序列設計的干擾序列如下：Sip300-1：5’-AACTGCACAAATGTCTAGTTCTTTTCAAGAGAAAGAACTAGACATTTGT-GCTTTTTTC-3’；3’-TTGACTCTTCTCCCTCAGATATAAAGTTCTCTTTCTTGATCTGTAAACACGAAAAAAGAG-CT-5’。Sip300-2：5’-AACTCCCCTCCTCTTCAGCACCATT-CAAGAGATGGTGCTGAAGAGGAGGGGTTTTTTC-3’；3’-TTGAGGGGAGGAGAAGTCGTGGTAAGTTCTCTACCACGA-CTTCTCCTCCCCAAAAAAGAGCT-5’。

1.2.2慢病毒包裝轉染前以無抗生素的培養基培養293T細胞，待細胞融合度達到70%~80%時，將pLL3.7-GFP-Puro-shp300載體，pMDLg/pRRE載體、pRSV-ReV載體、pMD2.G(VSVG)載體包裝混合液與相應體積的Opti-MEM培養基混合，然后加入Lipofectamine 2000，室溫下溫育20 min形成DNA與Lipofectamine 2000的轉染復合物。將轉染復合物加入含293T細胞的培養基中，于37 ℃、體積分數5% CO2細胞培養箱中培養6 h后，更換新鮮培養基10 mL，再繼續培養72 h后收集293T細胞上清液，離心、過濾取病毒濃縮液。分裝后將病毒濃縮液-80 ℃保存于病毒管中。

1.2.3慢病毒滴度測定將293T細胞以4×104個細胞/孔的密度接種于96孔板，慢病毒液按10倍濃度稀釋5個濃度，將梯度稀釋的含病毒培養基加入各孔中，病毒感染的同時加入polybrene以增加感染效率。經逐孔稀釋及熒光共聚焦檢測病毒滴度。病毒滴度(TU·mL-1)=GFP陽性細胞率×細胞總數/(慢病毒液體積×慢病毒稀釋倍數)

1.2.4低表達p300 CNE-2細胞株的建立復蘇CNE-2細胞接種于6孔板，采用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養基，37 ℃的CO2培養箱中培養。按照MOI=10，用慢病毒液轉染CNE-2細胞，感染后第2天，吸去含病毒的培養基，換上新鮮的完全培養基，繼續37 ℃培養，熒光顯微鏡觀察GFP表達情況。感染后，換上含適當濃度的Puromycin的新鮮完全培養基，篩選穩定轉導的細胞株。

1.2.5RT-qPCR收集轉染細胞，采用Trizol法一步提取總RNA。用M-MLV Reverse Transcriptase (美國Promega公司)進行逆轉錄反應。注：反應體積包括：引物、GoTaq?qPCR Master Mix、DNA模板加至總體積20 μL。將反應管置于MiniOpticonTMRT-qPCR反應儀。PCR反應程序參照說明書進行。熒光實時定量PCR法檢測p300的表達。選取GAPDH做內參,采用2-ΔΔCt法計算p300相對表達量。以GAPDH為內參的目的基因引物設計見表1。

表1　以GAPDH為內參的目的基因引物設計情況

1.2.6Western Blot檢測p300蛋白表達收集各組細胞，裂解液裂解細胞后提取總蛋白。Bradford方法定量后進行SDS-PAGE電泳，電泳結束后轉膜。放置質量分數5%脫脂奶粉封閉液中室溫封閉2 h。一抗(p300，美國Santa Cruz公司，sc-584)4 ℃過夜，TBS沖洗。用相應的稀釋好的二抗(HRP標記二抗，廣州永諾生物科技有限公司)37 ℃封閉1 h。ECL法顯色，曝光成像。以GAPDH(cst2118,11 000)作為內參照。通過觀察電泳條帶的深淺強度判斷p300蛋白的表達水平。

2結果

2.1p300慢病毒干擾表達載體的酶切鑒定和測序體外合成的寡核苷酸上游單鏈和下游單鏈在體外退火后形成雙鏈DNA，與pLL3.7載體鏈接。連接產物轉化Tran5α感受態細胞中。 用含氨芐青霉素(100 μg·mL-1)的LB平板篩選陽性克隆質粒，分別挑取4個菌落加入含有相應抗生素的LB培養基中過夜培養，用高純質粒小量提取試劑盒小提質粒。經HpaI和XhoI酶切電泳鑒定所提取質粒。shp300-1質粒酶切電泳結果顯示：泳道1、2、4是連接成功的shp300-1，而泳道3表示連接未成功。shp300-2質粒酶切電泳結果顯示：泳道1、2、3、4是連接成功的shp300-2(圖1)。shp300-1和shp300-2分別挑1個(取1號)送中美泰和公司進一步測序驗證。

圖1　shp300-1和shp300-2酶切鑒定圖

DNA測序結果中顯示shRNA片段已成功插入到pLL3.7-GFP-Puro載體，說明成功構建針對p300基因的RNA干擾重組質粒pLL-GFP-Puro-shp300-1和pLL-GFP-Puro-shp300-2，對陽性克隆進一步擴增菌液提質粒用于病毒包裝。

2.2慢病毒載體感染293T細胞株以及慢病毒的包裝和滴度測定當293T細胞的生長狀態達到產生慢病毒實驗的要求時，將p300干擾質粒、慢病毒包裝輔助質粒共轉染293T細胞。轉染48 h后可見較強亮度的片狀綠色熒光，同時可見部分293T細胞從培養皿壁上脫落下來，漂浮在細胞培養基中，說明有部分293T細胞開始裂解并釋放病毒到細胞培養基中。

本研究采用孔稀釋法檢測慢病毒滴度，第1個管中加入待測定的病毒原液10 μL，記為1E+1 μL；混勻后，取10 μL加入到第2個管中，記為1E+0 μL。重復以上操作直到最后1管。通過熒光顯微鏡觀察GFP熒光表達，1E+1組幾乎所有細胞表達GFP熒光，熒光細胞比例隨病毒稀釋而減少。在最后一個濃度1E-4 μL組的孔中可觀察到4個帶有熒光的細胞，說明該孔至少有4個病毒顆粒感染細胞，經過計算LV-shp300-1生產的病毒液滴度達到4.0×107TU·mL-1，同樣的方法測得LV-shp300-2生產的病毒液滴度達到5.0×107TU·mL-1(圖2)。收集病毒原液備用。進行下一步RT-qPCR和Western Blot驗證干擾效果。

圖2　不同濃度的慢病毒感染

2.3重組慢病毒對CNE-2細胞p300基因表達及蛋白表達的影響利用合成的shp300-1和shp300-2病毒液分別感染CNE-2細胞，感染3 d后可在熒光顯微鏡下觀察到GFP的表達，進一步用Puromycin篩選1周后，鏡下可見NC組和2個shp300組出現密集熒光細胞，提示慢病毒載體系統有效轉導進入CNE-2細胞，并且感染率高于95%。

為了明確CNE-2細胞感染pLL3.7-GFP-shp300后p300蛋白的變化，我們首先利用Western blot研究了pLL3.7-GFP-shP300-1、pLL3.7-GFP-shP300-2對CNE-2中p300蛋白水平抑制作用。各組中GAPDH的表達量基本相同，差異無統計學意義(P>0.05)。pLL3.7-GFP-shP300-1和pLL3.7-GFP-shP300 -2組p300蛋白的表達量都有所降低。見圖3。

圖3　Western Blot檢測p300蛋白的表達情況

由于pLL3.7-GFP-shp300-1組干擾效果較好，所以進一步選用pLL3.7-GFP-shp300-1組進行RT-qPCR檢測p300的mRNA水平。結果發現，與NC組相比，pLL3.7-GFP-shp300 -1慢病毒感染細胞后p300的mRNA明顯下降(1.2±0.2vs0.3±0.1)，差異有統計學意義(P<0.05)。

3討論

組蛋白乙?；且环N重要的表觀遺傳修飾方式，p300是一種能與腺病毒癌蛋白E1A相互作用的有多結構域的大分子蛋白質,其相對分子質量為300 000。p300作為組蛋白乙酰轉移酶，能乙?；?種核心組蛋白，削弱DNA與組蛋白之間以及2個核小體之間的相互作用，從而破壞高度有序的染色質結構，使轉錄因子易于與DNA結合，使RNA聚合酶Ⅱ能順利通過核小體陣列，從而促進轉錄。p300與惡性腫瘤發生有密切關系,在細胞周期調控、細胞分化和細胞凋亡等多種生理過程中發揮著重要作用[5-6]。p300被發現在多種腫瘤中高表達，如黑色素瘤[7]、乳腺癌[3]、肺癌[8]、肝癌[2]和食管癌[1]等。我們前期的研究[9]發現，p300的mRNA及蛋白水平在鼻咽癌組織中較正常鼻咽黏膜組織明顯升高，進一步研究發現p300過表達與鼻咽癌患者的淋巴結轉移、臨床分期密切相關，p300上調患者 5 a 生存率及無進展生存率明顯下調[9]。盡管今年來調強放療技術聯合化療提高了鼻咽癌的腫瘤控制率并改善患者的生存狀況[10]，但局部復發及遠處轉移仍是其治療失敗主要原因。進一步明確p300在鼻咽癌發生、發展中的功能及其分子機制將有助于發展鼻咽癌新的治療措施，從而進一步提高患者生存率。

目前基因功能的鑒定，通常使用gain-of-function和loss-of-function，即分別在細胞和個體水平,做該基因的超表達和基因敲除,從表型分析該基因的功能。上調或下調p300基因的表達，必須首先獲得p300過表達和p300穩定干擾的細胞表型。RNA干擾技術是基因沉默有力工具，已成為分子生物學研究主要技術手段之一。通過RNA干擾技術導致同源mRNA降解，從而選擇性抑制相關基因的表達。質粒介導RNA干擾有局限性，由于基因抑制表達作用弱、持續時間短，無法保證基因的轉染效率，不適合體內實驗。慢病毒載體是當今基因治療載體的熱點，能夠提供高效的基因轉移，表達穩定，可操控性強[11-12]。本研究采用三質粒包裝系統確保慢病毒載體系統安全性，該系統包括轉移質粒，包裝質粒和包膜質粒。病毒感染目的細胞不會再感染其他細胞，不會利用宿主細胞產生新的病毒顆粒。慢病毒介導RNA干擾能在哺乳動物細胞內穩定表達siRNA，可以長期抑制基因表達。

利用慢病毒載體抑制鼻咽癌CNE-2細胞的p300表達未見報道，本研究針對p300基因設計2個特異性siRNA靶序列，成功構建以GFP為報告基因的p300 shRNA慢病毒載體，經酶切和測序顯示載體構建成功。利用慢病毒載體pLL3.7-GFP-Puro介導shp300感染鼻咽癌CNE-2細胞，結果顯示，慢病毒可高效穩定的轉入鼻咽癌CNE-2細胞，轉導效率高于95%。結果發現shp300-1的干擾效率最高，其明顯下調CNE-2細胞p300 mRNA和蛋白的表達。病毒滴度可以反映病毒感染靶細胞的能力及效率，是評價包裝細胞分泌感染性病毒顆粒的主要指標。本研究包裝的慢病毒滴度達107TU·mL-1，進一步濃縮純化后可以滿足體內外實驗的要求，為下一步動物活體RNA干擾實驗奠定了基礎。

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Construction of a Lentivirus Interfering Vector Carrying p300

Gene with RNA Interfering and Its Expression in the CNE-2 Cells

Liao Zhiwei1,2,Luo Jianxiong3，Yu Fang1，Yu Hongwei1,Zhuang Yajing1，Zhou Tongchong1，Liu Mengzhong2

(1.DepartmentofRadiationOncology,theTumourHospitalAffiliatedtoGuangzhouMedicalUniversity,

Guangzhou510095,China;2.DepartmentofRadiationOncology,CancerCenter,SunYat-senUniversity,

Guangzhou510060,China;3.TheThirdClinicalCollegeofGuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou510180,China)

[Abstract]ObjectiveTo construct a lentiviral vector carrying p300 gene with RNA interfering,and to establish human nasopharyngeal carcinoma cells with stably inhibited p300.MethodsTwo pairs of small hairpin RNA specific for p300 were designed,synthesized and cloned into the pLL3.7-GFP-Puro vector.Then,the lentivirual plasmid was transfected with the other two packaging plasmids into 293T cells to product and amplify lentivirus.After the infection of lentivirus mediated siRNA-p300,the mRNA and protein expression of p300 were observed.ResultsThe lentivirus vector of siRNA-p300 was constructed successfully.The virus titres were above 107TU·mL-1.pLL-GFP-Puro-shp300 was effective to inhibit p300 expression in mRNA and protein levels of CNE-2 cells.ConclusionA lentiviral vector carrying p300 gene with RNA interfering is successfully constructed.This study lays a foundation for further study of mechanisms of p300 in the nasopharyngeal carcinoma.

[Key words]p300; nasopharyngeal carcinoma; lentiviral vector

收稿日期：(2015-03-30)

[中圖分類號]R739.63；R730.23

[文獻標識碼]A

[文章編號]1673-5412(2015)06-0464-05

作者簡介：廖志偉(1981-)，男，碩士，主治醫師，主要從事腫瘤放療研究。E-mail:liaozhiwei1110@163.com

基金項目：廣州醫科大學大學生科技創新項目(編號：2013A002)；廣州市醫藥衛生科技項目(編號：20141A011092)

DOI:10.3969/j.issn.1673-5412.2015.06.002