益氣解毒方水提物對RAW264.7細胞免疫功能的影響

廖　雪，藺　婷，羅晶婧，田道法，廖端芳，曾　嶸，林麗美，何迎春

(1.湖南中醫藥大學藥學院，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫藥大學中西結合學院，

湖南 長沙 410208；3.湖南中醫藥大學醫學院，湖南 長沙 410208)

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益氣解毒方水提物對RAW264.7細胞免疫功能的影響

廖雪1，藺婷2，羅晶婧1，田道法2，廖端芳1，曾嶸1，林麗美1，何迎春3

(1.湖南中醫藥大學藥學院，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫藥大學中西結合學院，

湖南 長沙 410208；3.湖南中醫藥大學醫學院，湖南 長沙 410208)

[摘要]目的研究益氣解毒方水提物對小鼠巨噬細胞系RAW264.7細胞免疫功能的影響,并探討其可能的作用機制。方法用不同濃度益氣解毒方水提物處理RAW264.7細胞，MTT法檢測細胞增殖活性，ELISA法檢測細胞腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-12(IL-12)、一氧化氮(NO)的分泌水平，Western blot法檢測細胞核轉錄因子NF-κBp65蛋白的表達水平。結果與空白對照組比較，益氣解毒方水提物在10～320 mg·L-1范圍內明顯促進RAW264.7細胞增殖，且10 mg·L-1濃度效果最佳(P<0.05)；與空白對照組比較，益氣解毒方水提物能促進TNF-α、IL-12及NO的分泌(P<0.05)，顯著誘導細胞內NF-κBp65蛋白的表達(P<0.05)。結論益氣解毒方水提物對RAW264.7細胞的免疫功能具有調節作用，其作用可能與激活NF-κBp65蛋白通路相關。

[關鍵詞]益氣解毒方；RAW264.7細胞；免疫功能；鼻咽癌

巨噬細胞是組成機體免疫體系的重要免疫效應細胞之一，具有吞噬、代謝、產生細胞因子及抗腫瘤免疫等多種功能，在宿主防御機制及維持機體內環境等方面有重要作用[1-2]。巨噬細胞參與免疫應答的全過程，依靠內吞、抗原呈遞作用和分泌細胞因子等途徑在腫瘤免疫中發揮重要作用，其中，活化的巨噬細胞分泌的腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor -α，TNF-α)、白介素-12(interleukin-12，IL-12)、一氧化氮(nitric oxide，NO)等細胞因子直接參與巨噬細胞介導的殺傷腫瘤細胞的作用[3-6]。TNF-α能直接殺傷多種腫瘤細胞、提高中性粒細胞的吞噬能力及活化NK細胞發揮細胞毒作用；IL-12能誘導Th0細胞向Th1細胞分化，發揮免疫功能；高濃度的NO為主要的細胞毒效應分子，可殺傷原位腫瘤細胞，是介導巨噬細胞殺傷腫瘤的中心分子[6-8]。益氣解毒方是本課題組研究和應用了20 a的經驗方(經湖南省藥監局批準，通過優良藥房工作標準驗收，由湖南中醫藥大學第一附屬醫院藥劑科生產)，該方對體內外鼻咽癌細胞均有較強的抑制作用，用于臨床鼻咽癌的康復治療、鼻咽癌前病變的治療以及其他腫瘤和瘤樣疾病的治療，效果顯著。益氣解毒方抗鼻咽癌藥理機制的研究，近年來主要集中在誘導腫瘤細胞凋亡、調控腫瘤細胞周期及逆轉腫瘤細胞多藥耐藥性等方面[9-12]，關于益氣解毒方對巨噬細胞免疫功能的影響研究較少。本實驗將以小鼠巨噬細胞系RAW264.7為研究對象，研究益氣解毒方水提物對RAW264.7細胞增殖活性，TNF-α、IL-12及NO的分泌和核轉錄因子NF-κBp65表達水平的影響，旨在闡述益氣解毒方水提物對RAW264.7細胞免疫功能的影響，為研究其抗鼻咽癌的藥理機制提供新的思路。

1材料與方法

1.1細胞培養用含體積分數10%胎牛血清、100 u·mL-1青霉素和100 u·mL-1鏈霉素的DMEM高糖培養基培養RAW264.7細胞(購自中南大學湘雅中心實驗室細胞庫)。將細胞置于37 ℃、體積分數5% CO2細胞培養箱中培養，每天換液，待細胞鋪滿培養瓶底90%后用消化液(含質量分數0.3%胰酶和質量分數0.05%乙二胺四乙酸)消化，12比例傳代。

1.2益氣解毒方水提物益氣解毒方由黃芪(20 g)、黨參(5 g)、天花粉(10 g)、黃連(5 g)、白花蛇色草(10 g)、茯苓(10 g)、甘草(3 g)等7味藥組成，組方藥藥材來源為：黃連5 g/袋(產地四川，批號XH14121201，由湖南中醫藥大學第一附屬醫院提供)，茯苓10 g/袋(產地云南，批號JC15020201，由湖南中醫藥大學第一附屬醫院提供)，黨參5 g/袋(產地甘肅，批號1410141042，由毫州市滬潐藥業有限公司提供)，白花蛇色草10 g/袋(產地湖南，批號140701，由湖南南國藥都中藥飲片有限公司提供)，黃芪20 g/袋(產地內蒙古，批號CS15011901，由湖南中醫藥大學第一附屬醫院提供)，天花粉10 g/袋(產地河北，批號1412110362，由毫州市滬潐藥業有限公司提供)，甘草3 g/袋(產地內蒙古，批號NG15012102，由湖南中醫藥大學第一附屬醫院提供)。20副益氣解毒方藥材經過鑒定，挑選、粉碎、過篩后，浸泡過夜，按固定配比加蒸餾水回流提取2次(第1次10倍量，第2次8倍量)，每次提取2 h，合并提取液，離心棄去沉淀后，上清液減壓濃縮至小體積，于冷凍干燥器中干燥得水提物浸膏，浸膏得率為10.83%。益氣解毒方水提物浸膏溶于一定量細胞培養基中，過濾除菌，-20 ℃分裝保存。

1.3MTT法檢測細胞活性MTT法檢測細胞活性取96孔細胞培養板，以1×104/孔的數量加入對數生長期的RAW264.7細胞，次日對照組給予常規DMEM培養基，實驗組加入不同體積的益氣解毒方水提物，補充培養液至200 μL，使益氣解毒方水提物的終濃度分別為10、20、40、80、160、320 mg·L-1，同時設脂多糖組(終濃度為1 mg·L-1)，每組5個復孔。在5% CO2、37 ℃培養箱中培養24 h后，吸去培養基，每孔加入100 μL 0.5 mg·mL-1MTT，上述相同條件下繼續培養4 h，棄培養基，每孔加入150 μL二甲基亞砜，振蕩溶解10 min，酶標儀570 nm波長檢測吸光度(A)值，計算細胞相對增長率。細胞相對增殖率=(實驗組A值-對照組A值)/對照組A值×100%。

1.4ELISA法檢測細胞TNF-α、IL-12及NO分泌水平取96孔細胞培養板，以1×105/孔的數量加入對數生長期的RAW264.7細胞，實驗處理同上，24 h后取上清液進行測定，每個實驗組5個復孔，重復3次。TNF-α、IL-12和NO水平測定按照ELISA試劑盒說明書進行。

1.5Western blot法檢測細胞中NF-κBp65蛋白表達參照何迎春等[10]的方法進行。收集對照組、益氣解毒方水提物24 h處理組(10、20、40、80、160、320 mg·L-1)、及脂多糖24 h處理組(1 mg·L-1)細胞，提取總蛋白并用BCA法檢測蛋白濃度。經SDS-PAGE電泳，濕轉至PVDF膜后封閉，加入抗NF-κBp65(11 000)抗體，4 ℃過夜。加入HRP標記的二抗，室溫孵育2 h，ECL檢測液發光顯影定影，GADPH設為內參，Quantity One軟件分析。

2結果

2.1益氣解毒方水提物對RAW264.7細胞的活性影響各益氣解毒方組RAW264.7細胞的增殖率顯著高于空白對照組(P均<0.05)，說明益氣解毒方水提物可促進RAW264.7細胞增殖，且10 mg·L-1濃度效果最佳。見表1。

表1　益氣解毒方水提物對RAW264.7細胞增殖活性的影響

注：與空白對照組比較，1)P<0.05

2.2益氣解毒方水提物對RAW264.7細胞分泌TNF-α、IL-12及NO的影響各益氣解毒方組TNF-α、IL-12及NO表達水平顯著高于空白對照組(P均<0.05)，說明益氣解毒方水提物能刺激小鼠巨噬細胞分泌TNF-α、IL-12及NO，且濃度為10 mg·L-1即達到最佳效應值。見表2。

2.3益氣解毒方水提物對RAW264.7細胞NF-κBp65蛋白表達的影響不同濃度益氣解毒方水提物處理RAW264.7細胞24 h后，樣品內參GADPH蛋白量表達基本不變的情況下，益氣解毒方水提物能明顯上調NF-κBp65蛋白的表達水平，灰度值與空白對照組比較差異有統計學意義(P均<0.05)。見圖1、2。

表2　益氣解毒方水提物對RAW264.7細胞TNF-α、IL-12及NO分泌水平的影響

注：與空白對照組比較，1)P<0.05

圖1　益氣解毒方水提物作用于RAW264.7

3討論

巨噬細胞是重要的分泌細胞之一，能產生100多種生物活性物質，其中TNF-α、IL-12、NO是主要的細胞毒效應分子，直接參與巨噬細胞介導的殺傷腫瘤細胞的作用[13]。NF-κB是一種細胞核轉錄因子，與腫瘤細胞的發生、增殖、分化、凋亡、侵襲和轉移有密切關系，其調控的靶基因包括免疫相關受體、細胞因子(IL-1、IL-2、IL-6、IL-12、TNF-α、NO、GM-CSF)、炎癥因子(IL-8、MCP1)、黏附因子(ICAM、VCAM)、急性期蛋白(SAA)等，其中在哺乳動物細胞中常見的NF-κB家族成員為NF-κBp65蛋白[14]。在靜止細胞中，NF-κB與NF-κBp65蛋白結合，使NF-κB以一種非活化的形式存在于細胞質中。當NF-κB信號通路被諸如藥物、細胞因子、淋巴因子、紫外線、壓力等外來因素激活后，NF-κBp65蛋白轉位進入細胞核，一系列在免疫反應中發揮重要作用的細胞因子的基因表達也相應被激活[15]。

圖2　益氣解毒方水提物對

注：與空白對照組比較，1)P<0.05

本實驗研究發現，益氣解毒方水提物可調控RAW264.7細胞的免疫活性。MTT法實驗結果表明益氣解毒方水提物可顯著促進細胞增殖；通過ELISA法檢測發現益氣解毒方水提物作用后，RAW264.7細胞TNF-α、IL-12及NO的分泌增加，表明益氣解毒方水提物具有促進TNF-α、IL-12及NO分泌的作用；與此同時，益氣解毒方水提物增加NF-κBp65蛋白的表達。研究結果提示，益氣解毒方水提物可能是通過激活NF-κB信號通路，相應激活TNF-α、IL-12、NO等細胞因子的基因表達，從而促進TNF-α、IL-12、NO等細胞因子的分泌，增強巨噬細胞的免疫功能。這可能是益氣解毒方發揮抗鼻咽癌作用的藥理學機制之一。

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Immunomodulating Effects of Yiqijiedu Formula on RAW264.7 Cells

Liao Xue1,Lin Ting2,Luo Jingqian1,Tian Daofa2,Liao Duanfang1,Zeng Rong1,Lin Limei1,He Yingchun3

(1.SchoolofPharmacy,HunanUniversityofChineseMedicine,Changsha410208,China；2.Schoolofthe

IntegratedTraditionalChineseandWesternMedicine,HunanUniversityofChineseMedicine，Changsha410208,

China；3.SchoolofMedicine,HunanUniversityofChineseMedicine,Changsha410208,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the immunomodulating effects of yiqijiedu formula on RAW264.7 cells and its possible mechanisms.MethodsRAW264.7 cells were treated with different concentrations of yiqijiedu formula,cell proliferation was measured by MTT assay; concentration of tumor necrosis factor-α(TNF-α),interleukin-12(IL-12)and nitric oxide(NO)were determined by ELISA method; production of NF-κBp65 protein was detected by Western blot.ResultsYiqijiedu formula(10-320 mg·L-1)possessed the stimulation effect on macrophages proliferation in a dose-dependent manner(P<0.05); the production of TNF-α,IL-12 and NO were increased in a dose-dependent manner when pretreated with yiqijiedu formula(P<0.05); the expression level of NF-κBp65 was significantly increased after yiqijiedu formula treatment(P<0.05).ConclusionYiqijiedu formula could enhance the immune regulation of RAW264.7 cells,which may be related to the activation of NF-κBp65 pathway.

[Key words]yiqijiedu formula; raw264.7 cells; immune function; nasopharyngeal carcinoma

收稿日期：(2015-10-28)

[中圖分類號]R739.63;R73-36

[文獻標識碼]A

[文章編號]1673-5412(2015)06-0473-04

通信作者：何迎春(1972-)，女，博士，博士生導師，主要從事中西醫結合防治腫瘤及其機制研究。E-mail：1305851329@qq.com

作者簡介：廖雪(1990-)，女，碩士，主要從事中藥防治腫瘤及其機制研究。E-mail：243361268@qq.com

基金項目：國家自然科學基金資助項目(編號：81273988、81573721)；中國博士后科學基金資助項目(編號：2011M501277)；湖南省科技廳計劃項目(編號：2014FJ3021)；湖南省十二五中醫五官重點學科資助項目(編號：61078074)

DOI:10.3969/j.issn.1673-5412.2015.06.004