廣西地區漢族人群PRKCB1基因-546C/G多態性與糖尿病腎病易感性相關性研究

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廣西地區漢族人群PRKCB1基因-546C/G多態性與糖尿病腎病易感性相關性研究

李軼春1,岑文新2,肖玲3

(廣西壯族自治區北海市中醫醫院 1.檢驗科;2.腎內科;3.糖尿病?？?，廣西 北海536000)

糖尿病腎病(Diabetic Nephropathy, DN)是糖尿病(Diabetes mellitus, DM)微血管并發癥之一，在2型糖尿病患者中，其致殘、致死率僅次于大血管并發癥。據統計，病程超過25年以上的糖尿病腎病累積患病率高達25%-40%，也是我國導致終末腎功能衰竭的第2位病因[1]。其病因和發病機制尚未完全明了，可能與環境因素和遺傳因素有關。蛋白激酶Cβ(PKC-β)是細胞內信號傳遞關鍵分子之一，激活后通過改變腎臟血流動力學、增厚腎小球毛細管基底和細胞外基質進行性積聚、加大血管炎癥反應、增加血管通透性等方式參與糖尿病腎病的發生與發展[2][3]，因此蛋白激酶Cβ(PKC-β)基因PRKCB1基因可能是誘發DN的相關基因。本文選擇120例廣西漢族人群為研究對象，對PRKCB1基因啟動子-546C/G基因型、等位基因頻率進行比較分析，旨在探討廣西漢族人群PRKCB1基因-546C/G多態性分布、及與糖尿病病腎病易感性相關性。

1對象與方法

1.1研究對象

選取2012年1月-2013年5月在廣西北海中醫院內分泌科、腎內科2型糖尿病患者，均為漢族人。彼此此無血緣關系。均符合2010年《中國2型糖尿病防治指南》[4]診斷和分型標準，并根據尿微量白蛋白排泄率(UARE)分為糖尿病非腎病組(NDN)42例、糖尿病腎病組(DN)38例。同期選擇健康體檢人群43例。排除血糖控制不穩定、心肺功能不全、腎功能不全、1個月內服用影響尿蛋白排泄藥物者。

1.2方法

1.2.1生物指標檢測所有研究對象均于清晨8：00抽取靜脈血6 ml，分裝于普通試管和乙二胺乙酸EDTA抗凝試管中，一份送特殊化室檢測，另一份于25 cm、3 000 r/min離心15 min，取血細胞部分存于是-70℃冰箱中待檢，同時檢測尿液中尿白蛋白排泄率。

1.2.2基因組DNA提取取出置于-70℃冰箱血細胞，常溫解凍，利用MassARRAY Assay(質譜陣列)高通量檢測平臺進行檢測分析，PCR引物參考基因庫PRKCB1進行設計，由上海生工合成，片段長度150 bp，上游引物：5’-AGGCAAGCAAAGCCAAGA-3’；下游引物：‘’-GCTCCCGCTGTCACTCATT-3’。反應體系：10XPCR Buffer5.0 μl，dNTPmix4.0 μl,DNA模板2.5 μl，上游引物1.0 μl，下游引物1.0 μl，Pfu酶0.4 μl，滅菌三蒸水36.1 μl；反應條件：97℃預變性5 min，97℃變性30 s，59℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個循環，擴增產物5 μl與150 bp DNA Ladder Marker加樣于2%瓊脂糖凝膠上，80V恒壓電泳30 min，在紫外燈下觀察PCR產物和150 bp Marker遷移率相同，則可判定為所需片段(見圖1)，余PCR產物采用DNA Extraction Kit純化。

圖1　PCR擴增PRKCB1-546產物位點電泳圖

1.3數據分析

2結果

2.13組病例臨床、生化指標比較

3組病例性別、年齡比較差異無統計學意義；NDN組與DN組FBG、PBG、TG、HbA1c、Bun明顯高于對照組；DN組PBG、TC、TG、HbA1c、Bun、Cr、LnUAER明顯高于NDN組；HDL-C、LDL-C明顯低于NDN組，見表1。

表1　3組病例臨床、生化指標比較

備注：與正常對照組比較，*P<0.05；ND組與NDN組比較，#P<0.05。FBG：空腹血糖；PBG：餐后2 h血糖；TC：總膽固醇；TG：甘油三脂；HbAlc：糖化血紅蛋白；HDL-C：高密度脂蛋白膽固醇；LDL-C：低密度脂蛋白膽固醇；Bun：尿素氮；Cr：肌酐；LnUAER：尿微量白蛋白排泄量的自然對數。

2.23組病例基因型與基因頻率比較

3組間PRKCB1基因-546均存在CC、CG、GG 3種基因型和C、G兩種等位基因，均符合Hardy-Weinberg平衡，提示樣本具有群體代表性。NDN組與正常對照組基因型和等位基因頻率比較差異無統計學意義；DN組CC基因型、C等位基因頻率明顯低于正常對照組、NDN組(χ2=6.125、5.642，P<0.05)；DN組GG基因型、G等位基因頻率顯著高于正常對照組、NDN組(χ2=9.364、11.684，P<0.01)，見表2。

表2　3組病例基因型與等位基因頻率比較[n(%)]

2.3糖尿病腎病風險因素回歸分析

以DN患者與否為因變量，以性別、FBG、PBG、TC、TG、HbA1c、Bun、Cr、LnUAER、HDL-C、LDL-C、PRKCB1為自變量進行多因素回歸分析，結果表明，PRKCB1-546GG基因型患者發生DN風險為CC基因型患者3.568倍，CG基因型發生DN風險為CC基因型1.882倍，TC、HbA1c也共同影響DN的發生發展，見表3。

表3　糖尿病腎病風險因素Logistic回歸分析

3討論

蛋白激酶C(PKC-β)分子量為67-83KD，屬于絲氨酸激酶家庭中的一員，均為單鏈多肽，PRKCB1基因編碼PKC-βⅠ、PKC-βⅡ定位于16p11.2，全長375 kb，目前已知有9個單核苷酸多態性(SNP)，-546C/G 單核苷酸多態性是6個位于啟動子之一[5]。美國學者[6]研究報道，對于病程<24年的糖尿病患者，PRKCB1基因啟動子-546C/G攜帶G等位基因誘發糖尿病腎病的危險性更大(95%CI：1.37-4.38)；日本學者[7]通過長達6年的前瞻性研究報道，在正常蛋白尿及微量白蛋白尿2型糖尿病患者中，PRKCB1基因啟動子-546C/G攜帶G等位基因患者eGFR下降速度更加明顯(-2.96±0.62 VS -1.63±0.15)ml/min，且更易進展到終末期腎病，因此提出PRKCB1基因多態性作為日本2型糖尿病腎病患者進展的預測指標。從現有文獻資料分析，我國目前鮮見，PRKCB1基因啟動子-546基因多態性與糖尿病腎病的相關性研究，這也是本課題研究的出發點。

本文研究中，3組間PRKCB1基因-546均存在CC、CG、GG 3種基因型和C、G兩種等位基因，其分布均符合Hardy-Weinberg平衡，提示樣本具有群體代表性。DN組CC基因分布明顯低于正常對照組、NDN組，G等位基因頻率顯著高于正常對照組、NDN組，且正常對照組與糖尿病非腎病組之間沒有統計學意義，提示PRKCB1基因多態性與糖尿病無關，而與糖尿病腎病相關，也提示G等位基因是糖尿病腎病的危險因素，C等位基因是糖尿病腎病的保護因素。國外學者分析-546C/G SNP可能影響到PRKCB1的轉錄，轉錄因素在糖尿病狀態下參與了糖尿病腎病并發平的發生[8,9]。通過以性別、FBG、PBG、TC、TG、HbA1c、Bun、Cr、LnUAER、HDL-C、LDL-C、PRKCB1為自變量進行多因素回歸分析研究表明，PRKCB1-546GG、CG基因型患者發生DN風險為CC基因型患者3.568、1.882倍，進一步證實了PRKCB1-546GG、CG基因是2型糖尿病腎病的危險因素。研究同時表明，TC、HbA1c也共同影響DN的發生發展。國內外學者不同的研究結果也均表明控制血糖能夠降低糖尿病微血管并發癥的發生[10,11]。

綜上所述，廣西漢族人群PRKCB1基因啟動子-546位存在CC、CG、GG基因型和C、G等位基因，CG型基因、G等位基因為糖尿病腎病的危險因素，CC型基因、C等位基因為糖尿病腎病的保護因素。

參考文獻：

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(收稿日期：2015-01-09)

文章編號：1007-4287(2016)01-0094-03 1007-4287(2016)01-0097-02

基金項目：編號：201206003;北海市科技局