抗壞血酸對減輕繼發性腦損傷作用機制的研究

張　昊，茆　翔，劉佰運,2

(1.中國人民武裝警察部隊總醫院神經創傷科，北京　100039；

2.首都醫科大學附屬北京天壇醫院神經外科，北京　100050)

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抗壞血酸對減輕繼發性腦損傷作用機制的研究

張昊1，茆翔1，劉佰運1,2

(1.中國人民武裝警察部隊總醫院神經創傷科，北京100039；

2.首都醫科大學附屬北京天壇醫院神經外科，北京100050)

摘要：目的探討抗壞血酸減輕顱腦創傷后繼發性腦損傷加重的機制。方法將實驗大鼠隨機分為假手術+生理鹽水組、假手術+抗壞血酸組、打擊+生理鹽水組及打擊+抗壞血酸組，每組 12 只。建立中度顱腦損傷模型，顱腦創傷后24 h進行神經功能損傷評分；采用酶聯免疫吸附劑測定腦組織超氧化物歧化酶(SOD)活性；采用Western blot法測定顱腦創傷后24 h的損傷側腦組織中細胞色素P450(CYP2E1),基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)和血腦屏障緊密連結蛋白Occludin的表達情況。結果打擊+抗壞血酸組的損傷程度與打擊+生理鹽水組相比明顯減輕，SOD活力增高，CYP2E1表達減少，MMP-9的含量降低，Occludin的含量增高。結論抗壞血酸可以通過降低血腦屏障的破壞程度，減輕繼發性顱腦損傷的進一步加重，其作用可能是依靠抑制CYP2E1的表達而發揮的。

關鍵詞：顱腦創傷；抗壞血酸；CYP2E1；氧化應激

外傷性腦損傷后所發生的各種繼發性腦損傷是導致繼發性神經元障礙和死亡的主要原因。血腦屏障的破壞和開放是外傷性腦損傷后常見的繼發性腦損傷[1]。這種繼發性腦損傷危害嚴重，因此探討如何減輕打擊引起的繼發性腦損傷并探討其可能的機制就顯得十分重要。

抗壞血酸是一種抗氧化劑，能防止自由基對人體的傷害。有研究表明[2]，抗壞血酸可減輕外傷后早期的氧化應激，延緩打擊后的病情進一步發展，因此補充抗壞血酸在臨床上已成為減輕繼發性腦損傷的重要方法。

細胞色素P450(cytochromeP450，CYPs)是一組結構和功能相關的超家族基因編碼的同工酶，是溫和條件下能夠把底物中反應惰性的碳氫鍵氧化的單加氧酶,參與大多數內源性物質的代謝，外源性物質的解毒、前致癌物質的激活[3]。CYP2E1是其中的重要成員，它可以催化許多前致癌物質和前毒物轉化為致癌物和有毒物，危害機體，而有些藥物可以抑制它的表達與活性。

本實驗的目的在于使用抗壞血酸對顱腦創傷后的大鼠進行干預，探究CYP2E1在其中發揮的作用，研究抗壞血酸對顱腦創傷保護作用的可能機制。

1材料與方法

1.1動物及分組成年健康雄性SD大鼠, 體質量(270±15)g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。實驗動物隨機分為四組:假手術+生理鹽水組、假手術+抗壞血酸組、打擊+生理鹽水組及打擊+抗壞血酸組,每組12只。

1.2試劑及藥品抗壞血酸；10%水合氯醛；BCA 蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物公司)；超氧化物歧化酶(SOD)ELISA檢測試劑盒(南京建成)，基質金屬蛋白酶9抗體(MMP-9，ab38899；Abcam公司)；緊密連接蛋白Occludin抗體(ab31721，Abcam公司)； 細胞色素P450抗體(CYP2E1，ab28146，Abcam公司)。

1.3動物模型的建立假手術+生理鹽水組、假手術+抗壞血酸組、打擊+生理鹽水組及打擊+抗壞血酸組大鼠按 400 mg·kg-1采用 10% 水合氯醛麻醉，取頭皮正中切口，分離骨膜，暴露顱骨。在右側前囟和人字縫尖中間，開直徑為 5 mm 的骨窗，注意保持硬膜完整。將大鼠固定于立體定位儀上。將撞擊錘(直徑 4 mm) 安置于顱窗內，緊貼硬膜。采用PinPointTM顱腦損傷撞擊器，建立中度損傷的可控性皮質打擊模型，打擊條件: 撞擊速度2 m·s-1，撞擊深度2.5 mm，接觸時間85 ms。術后縫合創口。假手術組大鼠除不進行撞擊外，其余手術操作同損傷組。術中用恒溫手術臺維持實驗大鼠肛溫(37±0.5)℃。

1.4給藥生理鹽水和抗壞血酸均采用腹腔注射的給藥途徑。生理鹽水注射劑量為5 mL·kg-1，抗壞血酸注射劑量為200 mg·kg-1，注射時間均為傷后即刻開始。

1.5神經功能缺損評分在損傷后24 h對各組大鼠進行神經功能缺損評分[4]，采用18分的神經功能量表從感覺試驗，平衡試驗，反射試驗等方面評價實驗大鼠的神經功能缺損程度。分數越高，神經功能缺損程度越重，采用雙盲法對各組進行評分。

1.6SOD活力的測定大鼠斷頭取腦組織(去除小腦、腦干) ,稱量,按1∶10的比例加入生理鹽水,勻漿4 000 r·min-1離心10 min取上清液保存用于ELISA實驗。SOD活性測定采用黃嘌呤氧化酶法,具體操作按試劑盒說明書進行。

1.7Western Blot 檢測裂解的蛋白置于100℃水浴10 min后，上樣于10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳，后將蛋白轉印于硝酸纖維素膜上，將該膜浸于50 g·L-1的1×TBST中室溫輕搖60 min用于封閉非特異性結合位點，1×TBST洗3次，每次5 min。加入兔抗大鼠MMP-9和Occludin抗體，4℃孵育過夜，后移去一抗，1×TBST洗3次，每次5 min。加入二抗(辣根過氧化物酶標記的抗羊和抗兔IgG,1∶5 000),室溫孵育1 h，ECL 光化學法顯色并拍片。

1.8統計學處理對于連續變量采用均值±標準差；對于分級變量采用百分比；對于連續變量，運用Kolmorogov-Smirnov 檢驗方法對數據進行正態性檢驗，而后進行方差齊性的分析。對于兩組正態連續變量，使用t檢驗進行比較。采用 ANOVA 方差分析及posthoc檢驗或秩和檢驗對多組計量資料進行比較。P<0.05為差異有顯著性。

2結果

2.1神經功能損傷評分24 h后進行神經功能損傷評分，假手術+生理鹽水組的評分為(1.0±0.2)分，假手術+抗壞血酸組的評分為(0.9±0.3)分，打擊+生理鹽水組的評分為(10.2±1.8)分，打擊+抗壞血酸組的評分為(7.9±2.1)分。打擊+生理鹽水組的神經功能損傷評分明顯高于假手術組+生理鹽水組，假手術組+抗壞血酸組和打擊+抗壞血酸組(P<0.05)。打擊+抗壞血酸組的評分則低于打擊+生理鹽水組(P<0.05)。見圖1。

2.2SOD的活力假手術+生理鹽水組SOD活力為(91.00±0.93)U·mgprot-1，假手術+抗壞血酸組為(86.50±1.12)U·mgprot-1，打擊+生理鹽水組SOD活力為(72.88±1.70)U·mgprot-1，打擊+抗壞血酸組為(80.38±1.05)U·mgprot-1。打擊+生理鹽水組和打擊+抗壞血酸組的SOD活力明顯低于假手術+生理鹽水組和假手術+抗壞血酸組(P<0.05)，但打擊+抗壞血酸組的SOD活力高于打擊+生理鹽水組(P<0.05)，見圖2。

圖1　神經功能損傷評分

注：1.假手術+生理鹽水組；2.假手術+抗壞血酸組；3.打擊+生理鹽水組；4.打擊+抗壞血酸組；*：與1、2、4組比較；#：與3組比較。

圖2　SOD的活力

注：1.假手術+生理鹽水組；2.假手術+抗壞血酸組；3.打擊+生理鹽水組；4.打擊+抗壞血酸組；*：與1、2組比較；#：與3組比較。

2.3CYP2E1的含量與假手術+生理鹽水和假手術+抗壞血酸組相比，打擊+生理鹽水組和打擊+抗壞血酸組CYP2E1表達明顯增加(P<0.05)；而與打擊+生理鹽水組比，打擊+抗壞血酸組CYP2E1表達減少(P<0.05)，見圖3。

圖3　CYP2E1的含量

注：1.假手術+生理鹽水組；2.假手術+抗壞血酸組；3.打擊+生理鹽水組；4.打擊+抗壞血酸組 ；*：與1、2組比較；#：與3組比較。

2.4MMP-9的含量 與假手術+生理鹽水和假手術+抗壞血酸組相比，打擊+生理鹽水組和打擊+抗壞血酸組MMP-9表達明顯增加(P<0.05)；而相對于打擊+生理鹽水組比，打擊+抗壞血酸組MMP-9表達減少(P<0.05)，見圖4。

圖4　MMP-9的含量

注：1.假手術+生理鹽水組；2.假手術+抗壞血酸組；3.打擊+生理鹽水組；4.打擊+抗壞血酸組；*：與1、2組比較；#：與3組比較。

2.5Occludin蛋白的含量與假手術+生理鹽水和假手術+抗壞血酸組相比，打擊+生理鹽水組和打擊+抗壞血酸組Occludin蛋白表達明顯減少(P<0.05)；而相對于打擊+生理鹽水組比，打擊+抗壞血酸組Occludin蛋白表達增多(P<0.05)，見圖5。

注：1.假手術+生理鹽水組；2.假手術+抗壞血酸組；3.打擊+生理鹽水組；4.打擊+抗壞血酸組；*：與1，2組比較；#：與3組比較。

圖5　Occludin蛋白的含量

注：1.假手術+生理鹽水組;2.假手術+抗壞血酸組;3.打擊+生理鹽水組;4.打擊+抗壞血酸組。

3討論

顱腦創傷致殘、致死率高,給家庭，社會及醫療保健體系帶來很重的負擔。因此近期的研究主要集中于研究顱腦創傷后的繼發性腦損傷，尤其是缺血缺氧性損傷[5]。本實驗的研究結果表明，打擊+生理鹽水組的神經功能損傷評分，CYP2E1表達量，基質金屬蛋白酶-9的含量明顯高于假手術+生理鹽水組和假手術+抗壞血酸組；SOD活力，血腦屏障緊密連接蛋白含量則明顯降低。而打擊+抗壞血酸組在給予抗壞血酸治療后，神經功能損傷評分，CYP2E1表達量，基質金屬蛋白酶-9的含量均明顯降低；SOD活力，血腦屏障緊密連接蛋白含量則升高。說明抗壞血酸能夠抑制血腦屏障的破壞程度，減緩了神經元的死亡，減輕了顱腦創傷后繼發性腦損傷的進一步發展。

自由基是一類包含未配對電子的化學物質，包括超氧陰離子，羥自由基等，在機體正常狀態下，其產生和消耗處于動態平衡之中[6]。外傷性腦損傷后，在前列腺素等的作用下，自由基含量迅速增加，對細胞結構和功能產生破壞。而超氧化物歧化酶(SOD)是腦內重要的清除自由基物質，其活力與自由基的清除呈正比[7]。從本實驗可以看出，打擊后腦組織中SOD活力迅速降低，反映了自由基增加迅速，加重了繼發性腦損傷。而抗壞血酸可以增加SOD的活力，減少自由基的產生，對顱腦創傷起到了較好的保護作用。

MMP-9在腦組織中由神經元或神經膠質細胞產生，它是一種能夠分解緊密連接和細胞基底層等細胞外基膜的蛋白酶體[8]，其過度表達的結果是破壞了血腦屏障的完整性，研究表明[9]，MMP-9的表達與外傷后腦水腫的程度呈正比。本實驗結果進一步說明了抗壞血酸可以抑制MMP-9的表達，減少血腦屏障緊密連接的分解及完整性的破壞，減輕腦水腫。

Occludin蛋白是一種存在于腦內皮細胞的緊密連接跨膜蛋白，它的作用是維持緊密連接復合體結構的穩定和功能的正常發揮，而這種緊密連接復合體也是血腦屏障的核心結構。研究表明[10]，Occludin蛋白的高表達可以降低血腦屏障的通透性，維持其物理屏障功能[11]。本實驗結果顯示與對照組相比，說明了抗壞血酸可以增加Occludin蛋白的表達，減少緊密連接結構和功能的變化，降低血腦屏障通透性，減輕腦水腫。

CYP2E1是細胞色素氧化酶P450的重要成員，催化前致癌物質和前毒物轉化為致癌物和有毒物。經國內外研究發現[12]，CYP2E1對還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸具有較高的氧化活性，可不依賴配體產生自由基，導致細胞膜結構破壞。在創傷性腦外傷的發展中，CYP2E1的存在導致產生更多的氧自由基，進一步加重了繼發性腦損傷。

抗壞血酸是一種抗氧化劑，可以保護其它抗氧化劑，防止自由基對人體的傷害。本試驗結果表明，打擊后大鼠的CYP2E1表達明顯增加，而在給予抗壞血酸藥物后，大鼠的CYP2E1表達減少?；谝陨辖Y果，可以猜測抗壞血酸中可能含有CYP2E1抑制物，使用抗壞血酸后，CYP2E1的表達減少，氧自由基的產生減少，減少了細胞膜結構的破壞，保護血腦屏障，減輕腦水腫，防止神經元膜結構的破壞，減輕顱腦創傷后的繼發性腦損傷。其對外傷性腦損傷保護作用的關鍵靶點可能是CYP2E1。

4結論

本試驗結果說明，抗壞血酸對減輕繼發性顱腦損傷加重的作用機制可能為對CYP2E1產生了抑制作用，導致氧自由基的產生減少，對細胞膜結構的破環降低，減輕了血腦屏障的破壞開放，為抗壞血酸進一步應用于臨床治療提供了重要的實驗依據，為顱腦損傷的臨床治療提供了新思路，但其中具體的機制還有待于進一步研究。

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Mechanisms of ascorbic acid reducing secondary brain injury in rats

ZHANG Hao1, MAO Xiang1, LIU Bai-yun1，2

(1.GeneralHospitalofArmedPoliceForces,Beijing100039,China;

2.DepartmentofNeurosurgery,CapitalMedicalUniversity,Beijing100050，China)

Abstract:Objective To investigate the effect of ascorbic acid on reducing secondary brain injury caused by traumatic brain injury and its possible mechanism.MethodsRats were randomly assigned into sham + saline group, sham + ascorbic acid group, hit + saline group and hit + ascorbic acid group, 12 in each group. Moderate traumatic brain injury model was established,and 24 hours later TBI neurological injury score was graded. The activity of superoxide dismutase in brain tissue was measured by ELISA. Western blot was used to determine the expressions of P450(CYP2E1), MMP-9 and Occludin in the tissue of the damaged brain 24 hours after the traumatic brain injury.ResultsCompared with the hit + saline group, in the blow + ascorbic acid group the trauma was significantly alleviated, the activity of SOD increased, the expression of CYP2E1 decreased, MMP-9 reduced and Occludin increased. ConclusionsAscorbic acid can alleviate the secondary brain injury by reducing the destruction of blood brain barrier, the mechanism of which is to inhibit the expression of CYP2E1.

Key words:traumatic brain injury；ascorbic acid;CYP2E1;oxidative stress

收稿日期：(2015-08-22，修回日期：2015-11-27)

通信作者：劉佰運，男，教授，博士生導師，研究方向：神經創傷，E-mail:liubaiyun1212@163.com

基金項目：國家自然科學基金(No 81471238)

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.01.007