復方貞術調脂膠囊對糖皮質激素誘導骨質疏松大鼠骨量和骨轉換指標的研究

孫平，蔡妹群，董群偉，王曉東

(廣東藥學院附屬第一醫院骨質疏松基地1、骨科2，廣東廣州510080)

復方貞術調脂膠囊對糖皮質激素誘導骨質疏松大鼠骨量和骨轉換指標的研究

孫平1，蔡妹群2，董群偉2，王曉東1

(廣東藥學院附屬第一醫院骨質疏松基地1、骨科2，廣東廣州510080)

目的觀察復方貞術調脂膠囊(FTZ)對糖皮質激素誘導骨質疏松大鼠骨密度、生物力學特性和血清骨轉換指標的影響。方法SPF級雄性SD大鼠32只，隨機等分為四組：Nrm組為正常對照組，Met組皮下注射甲強龍(Met)5 mg/kg·d，每周5次，FTZL組和FTZH組在Met組基礎上每日分別給予低劑量FTZ(1.5 g/kg)和高劑量FTZ(6 g/kg)灌胃，實驗期為12周。QDR4500A型雙能X線骨密度測定儀測定股骨和腰椎骨密度，MTS-858型生物力學實驗機測定股骨和腰椎生物力學性能。ELISA法測量血清中1型前膠原氨基末端前肽(P1NP)、Ⅰ型膠原羧基端肽(β-CTX)和骨鈣素(OC)含量。結果Met組大鼠股骨和腰椎的骨密度、最大載荷、剛度和血清OC、P1NP均顯著低于Nrm組相應指標(Ρ＜0.01)，血清β-CTX顯著高于Nrm組(Ρ＜0.01)；FTZL組大鼠的最大載荷、剛度和P1NP較Met組有升高趨勢，β-CTX有降低趨勢，但兩組間各指標比較差異均無統計學意義(Ρ＞0.05)；FTZL組大鼠L5的骨密度和血清OC明顯高于Met組(Ρ＜0.05)；FTZH組大鼠股骨和腰椎的骨密度、最大載荷、剛度、血清OC和P1NP顯著高于Met組相應指標(Ρ＜0.01)，β-CTX明顯低于Met組(Ρ＜0.05)；FTZH組大鼠腰椎的最大載荷、L5的骨密度和血清OC均明顯高于FTZL組(Ρ＜0.05)。結論FTZ能夠改善糖皮質激素誘導骨質疏松大鼠股骨和腰椎的骨密度(BMD)及生物力學特性，改善骨轉換指標，效果顯著。

糖皮質激素；復方貞術調脂膠囊；骨密度；骨生物力學；骨轉換指標；骨質疏松

糖皮質激素性骨質疏松癥(Glucocorticoid-induced osteoporosis，GIOP)是糖皮質激素治療炎癥和自身免疫性疾病最嚴重的副作用，其發生率僅次于絕經后骨質疏松癥及老年性骨質疏松癥而位居第3位[1]。有報道指出，糖皮質激素首先是引起脂質代謝紊亂，其次引起骨量減少，如近年來發現他汀類藥物在抗骨質疏松的治療中起到積極作用[2-3]，但對肝臟、腎臟等副作用較明顯?；诖?，本研究選用我校自主創新研發的具有護肝調脂作用的復方貞術調脂膠囊(FTZ)，通過改善脂代謝失衡，以期對GIOP的防治起到積極作用。

1 材料與方法

1.1 動物模型和實驗分組3個月齡SPF級雄性SD大鼠32只，體質量(210±15)g，購于南方醫科大學實驗動物中心。適應性喂養7 d后，隨機平均分為四組：Nrm組為正常對照組，Met組為皮下注射甲強龍(Met)5 mg/(kg·d)，每周5次[4]，低劑量組(FTZL)和高劑量組(FTZH)分別在Met組基礎上每天給予FTZ 1.5 g/kg和FTZ 6 g/kg灌胃，實驗期12周。實驗結束后3.3%濃度的水合氯醛溶液(10 ml/kg)麻醉，左心室放血處死大鼠，留取血標本做骨轉換指標檢測，雙側股骨及L4～5，剔除附著的軟組織，用浸濕生理鹽水的紗布包裹，置于置于-20℃的冰箱內保存備骨生物力學和骨密度測定。

1.2 生物力學測定

1.2.1 三點彎曲試驗取右側股骨，并剔除附著的軟組織，置于生物力學試驗機(MTS-858型，USA)上，支點跨距17 mm，加壓點為中點，加載速度2 mm/min，加載至骨折，計算機記錄載荷-位移曲線，得出其力學參數。

1.2.2 壓縮試驗去除L4椎弓及附件單留椎體，砂紙打磨椎體上下表面，使之相互平行，置于生物力學試驗機(同上)上，下表面緊貼于不銹鋼板上，加載方向與不銹鋼表面垂直，加速度為2 mm/min，計算機記錄載荷-位移曲線，得出其力學參數。

1.3 股骨和L5骨密度測定采用QDR4500A型雙能X線骨密度測定儀，小動物梯級標準分析軟件，掃描速度10 mm/s，掃描間距0.5 mm×0.5 mm。

1.4 血清標本的檢測血清標本用于大鼠骨鈣素(Osteocalcin，OC)、1型前膠原氨基末端前肽(N-terminal propeptide of type 1 procollagen，P1NP)、Ⅰ型膠原羧基端肽(C-terminal cross-linking telopeptide of type I collagen，β-CTX)的檢測，均采用大鼠OC、P1NP和β-CTX ELISA試劑盒(武漢華美生物工程有限公司)。

1.5 統計學方法應用SPSS16.0統計軟件進行數據分析，所有計量數據以均數±標準差(±s)表示，組間采用兩獨立樣本t檢驗及方差分析(One-way ANOVA)，LSD多重檢驗，以Ρ＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 FTZ對大鼠骨生物力學參數的作用實驗期滿后，Met組大鼠股骨和L4的最大載荷和剛度均顯著低于Nrm組相應指標(Ρ＜0.01)；FTZL組大鼠最大載荷和剛度較Met組有升高趨勢，但兩組間各指標比較差異均無統計學意義(Ρ＞0.05)；FTZH組大鼠股骨和L4的最大載荷、剛度均明顯高于Met組(Ρ＜0.05)；股骨的最大載荷和剛度FTZH組和FTZL組間比較差異均無統計學意義(Ρ＞0.05)，但L4的最大載荷FTZH組明顯高于FTZL組，差異有統計學意義(Ρ＜0.05)，見表1和表2。

表1 各組大鼠股骨(右)三點彎曲試驗參數的結果(±s)

表1 各組大鼠股骨(右)三點彎曲試驗參數的結果(±s)

注：與Nrm組比較，aP＜0.01，bP＜0.001；與Met組比較，cP＜0.05。

組別剛度(N/mm)標本數最大載荷(N) Nrm組Met組FTZL組FTZH組F值P值222.92±25.85 168.09±30.01b182.31±21.20a201.53±17.04c7.859 0.000 8888 104.15±9.75 85.18±11.39a88.82±12.43a96.76±8.33c5.109 0.001

表2 各組大鼠L4壓縮試驗參數的結果(±s)

表2 各組大鼠L4壓縮試驗參數的結果(±s)

注：與Nrm組比較，aP＜0.05，bP＜0.01，cP＜0.001；與Met組比較，dP＜0.05，eP＜0.01；與FTZL組比較，fP＜0.05。

組別標本數最大載荷(N)剛度(N/mm) Nrm組Met組FTZL組FTZH組F值P值8888 107.32±9.57 83.03±11.95c87.11±12.03b99.35±11.36ef7.848 0.000 193.78±25.27 159.58±18.43b170.34±15.49a183.77±16.08d4.879 0.001

2.3 藥物對大鼠左側股骨和L5骨密度的作用四組大鼠間左側股骨和L5的骨密度差異均有統計學意義(P＜0.001，P＜0.01，P＜0.05)，Met組顯著低于Nrm組(P＜0.001)；FTZH組股骨和L5骨密度均高于Met組(P＜0.01，P＜0.05)；FTZL組L5骨密度顯著高于Met組(P＜0.05)，FTZH組L5骨密度顯著高于FTZL組(P＜0.05)，見表3。

表3 各組大鼠骨密度結果(g/cm2，±s)

表3 各組大鼠骨密度結果(g/cm2，±s)

注：與Nrm組比較，aP＜0.01，bP＜0.001；與Met組比較，cP＜0.05，dP＜0.01；與FTZL組比較，eP＜0.05。

組別Nrm組Met組FTZL組FTZH組F值P值標本數L50.228±0.007 0.208±0.005b0.214±0.006bc0.220±0.005ade24.45 0.000 8888股骨0.237±0.011 0.210±0.007b0.217±0.008b0.225±0.005ad15.535 0.000

2.4 藥物對大鼠血清骨轉換指標的作用實驗期滿后，Met組OC和P1NP顯著低于Nrm組(P＜0.001)，β-CTX顯著高于Nrm組(P＜0.01)；FTZL組OC較Met組顯著升高(P＜0.05)，P1NP有增加趨勢，但差異無統計學意義(P＞0.05)；β-CTX有降低趨勢，但差異無統計學意義(P＞0.05)；FTZH組OC和P1NP較Met組顯著性升高(P＜0.001，P＜0.05)，β-CTX顯著性降低(P＜0.05)；FTZH組OC較和FTZL組顯著性增加(P＜0.05)；余各指標間差異均無統計學意義(P＞0.05)，見表4。

表4 各組大鼠血清骨轉換指標的變化(±s)

表4 各組大鼠血清骨轉換指標的變化(±s)

注：與Nrm組比較，aP＜0.05，bP＜0.01，cP＜0.001；與Met組比較，dP＜0.05，eP＜0.001；與FTZL組比較，fP＜0.05。

組別標本數OC(μg/L)P1NP(ng/ml)β-CTX(pg/ml) Nrm組Met組FTZL組FTZH組F值P值8888 2.76±0.18 1.56±0.10c1.72±0.11cd1.90±0.13cef129.195 0.000 308.03±71.95 180.91±54.27c242.35±51.36a260.11±62.25d6.037 0.000 21.21±15.17 43.17±13.90b36.05±13.50a29.37±10.08d3.979 0.003

3 討論

長期應用糖皮質激素可抑制骨基質礦化，減少性激素分泌，抑制腸道對鈣的重吸收，增加腎臟對鈣、磷的排泄，增加骨吸收；同時抑制骨髓間充質干細胞向成骨細胞分化，降低成骨細胞增殖和活性，抑制骨保護素(Osteoprotegerin，OPG)、胰島素樣生長因子-1(Insulin-like growth factor-1，IGF-1)等細胞因子的表達，抑制骨形成。GIOP是醫源性骨質疏松的最常見原因。據統計，在接受糖皮質激素治療的慢性疾患者群中，最終有30%～50%發展為骨質疏松，有超過1/3的絕經后婦女長期(＞6個月)口服糖皮質激素治療，椎體至少發生過1次椎體骨折[5]，且絕經后婦女及長期使用糖皮質激素的患者往往同時伴有骨質疏松和脂質代謝紊亂[6-7]，有學者調查發現絕經后婦女的血清低密度脂蛋白水平與股骨頸及全髖BMD呈顯著負相關[8]，膽固醇和低密度脂蛋白水平與股骨頸和腰椎BMD亦呈顯著負相關[9]，而在抗骨質疏松治療的過程中，脂代謝紊亂往往會得以逆轉，因此高脂血癥與骨質疏松癥兩者在發病機制及臨床治療方面的相互關系已引起人們越來越多的關注。

回顧GIOP的治療，目前仍沒有理想方法，原因是由此引起的骨質疏松機制復雜。中藥尤其是中藥復方具有多環節、多靶點、多效應器官發揮功效的特點，中藥復方也體現了中醫的思想，即針對疾病本身起作用，又對其并發癥有很好的療效，其在防治脂質代謝紊亂及骨質疏松方面，有著較大的開發和應用價值。我校自主研發的具有護肝調脂作用的FTZ以佛手、黃連、杜仲、白術、丹參等為主要成分，具有調脂、降糖、抑斑塊、保護內皮等一系列作用。唐春萍等[10]研究發現，FTZ能有效調節實驗性動脈粥樣硬化家兔的脂代謝異常，顯著降低非酒精性脂肪肝大鼠空腹血糖、胰島素、胰島素抵抗指數，下調大鼠肝組織中LXR-α和SREBP-1c mRNA的表達，對高脂血癥相關的HMG-CoA還原酶(HMGR)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)等均有潛在作用[11-13]，同時發現該藥物能夠顯著增加大鼠皮質骨厚度和骨小梁數目，因此本研究以降脂為基點，分別采用高、低劑量的FTZ以期觀察其對GIOP大鼠的骨量和骨質量具有積極作用。

BMD是診斷骨質疏松癥的“金標準”，可以間接評價骨質健康情況及骨強度，同時可以提示超過60%的骨量變化，能夠較好地預測骨折的發生風險。本研究發現，GIOP大鼠股骨和腰椎的BMD較正常組均顯著下降，說明本實驗采用甲強龍致大鼠骨質疏松模型建立成功，FTZH組能夠顯著增加GIOP大鼠股骨和腰椎的BMD，FTZL組僅能夠顯著增加腰椎BMD，且FTZH組顯著高于FTZL組，提示FTZ能夠增加GIOP大鼠的BMD，特別是松質骨的BMD，有效延緩糖皮質激素誘導的大鼠骨量丟失，且呈劑量依賴性。骨生物力學是全面評價骨質量最可靠的指標，是骨量、骨結構和骨強度的綜合體現，在評價治療骨質疏松藥物對骨質量影響中的作用無法被其他測定方式所取代。其中三點彎曲實驗主要反映皮質骨的力學特性，壓縮實驗主要是松質骨力學特性的體現。我們實驗發現，GIOP大鼠股骨和腰椎的結構力學特性(最大載荷)、材料力學特性(剛度)均較正常組顯著降低，與其BMD的下降相一致，通過給予FTZH可顯著增加大鼠股骨和腰椎的結構力學特性，在股骨三點彎曲實驗中，高、低劑量的FTZ兩組間未見顯著性差異；而在腰椎壓縮實驗中，FTZH組的最大載荷顯著優于FTZL組，表明高劑量的FTZ對提高骨生物力學特性方面有積極作用，且呈劑量依賴性，特別是對松質骨力學特性的改善作用。

骨轉換的過程是成骨細胞形成新骨和破骨細胞吸收舊骨的過程，在此過程中，成骨、破骨標志物進入血清，且濃度發生變化，反映了骨重建的動態變化，檢測具有代表意義的骨轉換標志物，有利于分析藥物對機體骨重建的影響和藥物療效的評價。血清OC、P1NP和β-CTX是目前臨床常用的骨形成及骨吸收的生化標志物，本研究提示，糖皮質激素干預12周后的大鼠血清OC、P1NP較正常對照組顯著降低，β-CTX較對照組顯著升高，提示糖皮質激素干預大鼠的成骨細胞活性降低、破骨細胞活性增強，即骨形成減少，骨吸收增加，與GIOP以骨形成缺陷為主，骨重建功能減退一致。這也與以往報道相一致[14-15]，在使用糖皮質激素后患者血清P1NP濃度較對照組明顯降低，β-CTX濃度則明顯升高，提示骨代謝以骨形成降低，骨吸收增加為主；但亦有研究提示[16]給予糖皮質激素干預后大鼠成骨細胞和破骨細胞活性均增強，與本研究結果不符，可能與藥物劑型、藥物劑量及觀察時間等不同有關。本研究給予FTZH能夠顯著增加大鼠血清OC和P1NP水平，顯著降低β-CTX水平，且FTZH組血清OC水平顯著高于FTZL組，提示FTZ能夠增加GIOP大鼠的骨形成，抑制骨吸收，改善骨重建。

本研究結果初步表明，具有護肝調脂作用的FTZ能夠改善GIOP大鼠的骨量丟失，增加BMD，維持骨生物力學特性，改善骨質量，降低骨折發生風險，這提示FTZ在減緩骨丟失、改善骨質量、降低骨折的發生方面有一定的積極作用。本研究只是初步觀察了FTZ對糖皮質激素誘導骨質疏松的預防作用的同時給我們提供了新的思路和方法，后續FTZ對骨代謝的影響及其機制方面的探討目前正在進行中。

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Effects of Fufang Zhenzhu Tiaozhi on bone mass and bone turnover markers in rat models withglucocorticoid-induced osteoporosis.

SUN Ping1,CAI Mei-qun2,DONG Qun-wei2,WANG Xiao-dong1.Department of Osteoporosis1,Department of Orthopedics2,the First Affiliated Hospital of Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510080,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo observe the effects of Fufang Zhenzhu Tiaozhi(FZT)Capsule on bone mineral density(BMD),biomechanics of femur and lumbar vertebra,and bone turnover markers in rat models with glucocorticoid-induced osteoporosis.MethodsThirty two male SD rats of SPF grade were randomized into four groups: normal control group(Nrm group),methylprednisolone group(Met group,hypodermic injection of methylprednisolone 5 mg·kg-1·d-1for 5 days per week),FTZL group(hypodermic injection of methylprednisolone 5 mg·kg-1·d-1for 5 days per week plus gavage administration of FTZ 1.5 g/kg per day),FTZH group(hypodermic injection of methylprednisolone 5 mg·kg-1·d-1for 5 days per week plus gavage administration of FTZ 6 g/kg per day).The study period was 12 weeks.BMD of femur and lumbar vertebra was detected by dual energy X-ray absorptiometry(DXA,QDR4500A),and biomechanics of femur and lumbar vertebra were tested by MTS 858 MiniBionixⅡtesting system.The serum levels of N-terminal propeptide of type 1 procollagen(P1NP),C-terminal cross-linking telopeptide of type I collagen(β-CTX) and osteocalcin(OC)were determined by ELISA.ResultsMet group was significantly lower than Nrm group in BMD,maximum load,rigidity of femur and lumbar vertebra,as well as serum OC,P1NP levels(Ρ＜0.01),while Met group had significantly higher β-CTX(Ρ＜0.01).Maximum load,rigidity,P1NP and β-CTX were slightly higher in FTZL group than Met group,but β-CTX was slightly lower,with no statistically significant difference between the two groups(Ρ＞0.05).In FTZL group,BMD of fifth lumbar vertebrae(L5)and serum OC were significantly higher than those in Met group(Ρ＜0.05).In FTZH group,BMD,maximum load,rigidity,OC and P1NP were significantly higher than those in Met group(Ρ＜0.01),while β-CTX was significantly lower(Ρ＜0.05).FTZH had significantly higher maximum load,L5 BMD and OC than FTZL group(Ρ＜0.05).ConclusionFTZ has active effect on the BMD,biomechanics of femur and lumbar vertebra and bone turnover markers in rat models with glucocorticoid-induced osteoporosis.

Glucocorticoid;Fufang Zhenzhu Tiaozhi(FTZ);Bone mineral density(BMD);Biomechanics; Bone turnover markers;Osteoporosis

R-332

A

1003—6350（2016）01—0003—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.01.002?

2015-08-06)

王曉東。E-mail：wangxiaodong@163.com