蝦青素緩解Tau蛋白過度磷酸化減輕視神經放射性損傷的分子生物學機制探討

陳利明，任春吾，劉旭陽，楊仕慶

(1.深圳市龍崗區第五人民醫院眼科，廣東深圳518111；2.深圳市眼科醫院青光眼?？瓶剖?，廣東深圳518000)

蝦青素緩解Tau蛋白過度磷酸化減輕視神經放射性損傷的分子生物學機制探討

陳利明1，任春吾1，劉旭陽2，楊仕慶1

(1.深圳市龍崗區第五人民醫院眼科，廣東深圳518111；2.深圳市眼科醫院青光眼?？瓶剖?，廣東深圳518000)

目的分析視神經放射性損傷的分子生物學機制及蝦青素對Tau蛋白過度磷酸化減輕效果。方法選取64例離體培養鼠視網膜神經節細胞株RGC-5培養的神經元，30 Gy γ射線電離輻射，隨機選擇64個細胞培養小室，根據有無蝦青素滴加分為蝦青素標準品組及無蝦青素標準品組各32個，觀察兩組照射后12 h、24 h、48 h、1周后Tau蛋白激酶、GSK-3β蛋白、PP-2A蛋白表達差異。結果同組不同時間比較可見蝦青素標準品組照射后隨時間增長，Tau蛋白激酶、GSK-3β蛋白有所下降，PP-2A蛋白表達有所上升，這種變化在無蝦青素標準品組表現不明顯(P＞0.05)，同時間組間比較照射后不同時間蝦青素標準品組Tau蛋白激酶、GSK-3β蛋白表達低于無蝦青素標準品組，而PP-2A蛋白表達高于無蝦青素標準品組，數據經統計學處理，差異均有統計學意義(P＜0.05)。結論蝦青素能夠有效降低GSK-3β蛋白的表達及提高PP-2A蛋白表達，降低γ射線電離輻射致Tau蛋白過度磷酸化，從而可能對抑制Tau蛋白過度磷酸化而預防電離輻射對視神經的損傷。

視神經；放射性損傷；蝦青素；Tau蛋白；GSK-3β蛋白；PP-2A蛋白

γ刀放射外科治療目前在臨床各類顱腦疾病的治療中應用較為廣泛，其臨床治療效果較為顯著[1]，但是在γ刀放射治療中，放射性視神經病變的發病率不斷提高，引起了臨床的重點關注和研究[2]。目前對于γ射線電離輻射致視神經損傷的發生機制未明確，但神經受照劑量和受照容積對視神經的損傷程度影響已得到廣泛認同[3]。本文觀察了γ射線電離輻射致Tau蛋白過度磷酸化及蝦青素對其緩解的影響，分析了視神經放射性損傷的分子生物學機制，對γ射線電離輻射導致視神經放射性損傷的預防及治療提供思路，現報道如下：

1 材料與方法

1.1 模型建立與分組方法離體培養鼠視網膜神經節細胞株RGC-5培養的神經元由上海斯信生物科技有限公司提供，照射條件為瑞典醫科達公司Leksell C型γ刀，照射劑量為30 Gy，將種植有離體培養的大鼠視網膜神經節細胞小室固定于立體定位框架，培養皿中心點與定位框架中心點(坐標：x=100，y=100，z=100)位置重合，γ角90°，8 mm準直器，按相應治療劑量分組進行照射。隨機選擇64個細胞培養小室，按數字法隨機選取32個細胞培養小室為蝦青素標準品組，給予蝦青素標準品(3 mg/10 μl)滴加入視神經節細胞，余32個細胞培養小室未處置為未蝦青素標準品組。

1.2 免疫組化檢測方法將選取的細胞培養小室利用非生物素兩步法行免疫組化學檢測：常規給予石蠟包埋處理，連續切片5μm，多聚賴氨酸防脫處理后常規給予脫臘后預處理，3%H2O2孵育磷酸緩沖液(PBS)沖洗2 min，連續3次，分別滴加1：400稀釋一抗Tau蛋白激酶抗體、1：400稀釋GSK-3β抗體、1：400稀釋PP-2A抗體，PBS沖洗2 min，連續3次，滴如二抗，室溫孵育30 min后給予PBS溶液沖洗2 min，連續3次，顯微鏡下觀察DBA顯色并控制反應的時間，吸掉多余顯色液后蒸餾水沖洗，復染、脫水、透明、封片。圖像分析采用15×40倍的光鏡視野，Dpx View Pro型顯微彩色圖像處理系統進行圖象采集與分析，Image-Pro Plus 6.0圖像處理軟件統計陽性表達累計光密度值(IOD)，每張切片選3個連續的不同視野，最終結果取平均值。

1.3 觀察指標分別在兩組照射后12 h、24 h、48 h、1周隨機選取每組8個細胞培養小室，對視網膜神經節細胞中Tau蛋白激酶表達陽性糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)、蛋白質磷酸酶-2A(PP-2A)表達情況進行檢測，比較兩組差異。

1.4 統計學方法應用SPSS17.0統計分析軟件包進行數據分析。計量數據以均數±標準差(±s)表示，兩兩比較采用t檢驗，多組數據比較采用LSD或Dunnett's C檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Tau蛋白激酶表達情況比較電離輻射后兩組大鼠神經節RGC-5離體培養神經元Tau蛋白激酶表達比較見表1。由此可見，隨著照射后時間增加，蝦青素標準品組Tau IOD值有所下降(P＜0.05)，而無蝦青素標準品組未見明顯下降(P＞0.05)，同時間兩組Tau IOD值比較蝦青素標準品組低于無蝦青素標準品組，數據經統計學處理，差異均有統計學意義(P＜0.05)。

表1 兩組照射后不同時間Tau蛋白激酶表達Tau IOD值比較(±s)

表1 兩組照射后不同時間Tau蛋白激酶表達Tau IOD值比較(±s)

組別12 h 24 h 48 h 1周蝦青素標準品組無蝦青素標準品組t值P值201.4±11.8 241.7±20.7 4.153＜0.05 183.6±10.6 236.6±18.6 5.681＜0.05 165.8±11.5 228.4±18.9 6.951＜0.05 148.1±7.2 229.5±19.8 9.525＜0.05

2.2 GSK-3β表達情況比較電離輻射后兩組大鼠神經節RGC-5離體培養神經元GSK-3β表達比較見表2。由此可見，隨著照射后時間增加，蝦青素標準品組GSK-3β表達有所下降(P＜0.05)，而無蝦青素標準品組未見明顯下降(P＞0.05)，同時間兩組GSK-3 β表達比較蝦青素標準品組低于無蝦青素標準品組，數據經統計學處理，差異均有統計學意義(P＜0.05)。

組別蝦青素標準品組無蝦青素標準品組t值P值12 h 5.73±0.24 5.95±0.29 4.682＜0.05 24 h 5.44±0.21 5.81±0.24 5.018＜0.05 48 h 5.31±0.18 5.84±0.27 5.618＜0.05 1周5.23±0.15 5.87±0.26 6.652＜0.05

2.3 PP-2A表達情況比較電離輻射后兩組大鼠神經節RGC-5離體培養神經元PP-2A表達比較見表3。由此可見，隨著照射后時間增加，蝦青素標準品組PP-2A表達有所上升(P＜0.05)，而無蝦青素標準品組未見明顯上升(P＞0.05)，同時間兩組PP-2A表達比較蝦青素標準品組高于無蝦青素標準品組，數據經統計學處理，差異均有統計學意義(P＜0.05)。

表3 兩組照射后不同時間PP-2A表達比較(±s)

表3 兩組照射后不同時間PP-2A表達比較(±s)

組別12 h 24 h 48 h 1周蝦青素標準品組無蝦青素標準品組t值P值12.8±1.8 11.4±2.2 3.845＜0.05 15.0±2.1 11.8±2.4 4.158＜0.05 16.1±2.3 11.6±2.1 4.625＜0.05 17.6±2.3 11.9±2.3 5.755＜0.05

3 討論

電離輻射能使機體內的水分子分解產生活性氧自由基(ROS)如超氧陰離子自由基、過氧化氫自由基、羥自由基等[4]，可引發機體氧化應激反應(OS)，這些活性氧能引起細胞、組織和血管的損傷[5]。Tau蛋白屬低分子微管相關蛋白，集中分布在樹突和軸突，呈現一種高度不對稱磷蛋白，在微管組裝的早期，Tau蛋白結合是核心，其能夠促進軸突的微管裝配與穩定，并可保持微管之間距離的穩定，同時對神經細胞的軸突物質運輸有其影響，刺激并提高神經元的生長發育，對脂質的過氧化進行抑制，減少微管蛋白的聚集[6]。這種微管的結合能力依靠絲氨酸與蘇氨酸的磷酸化指導進行調節，為神經元功能調節主要手段，如果出現異常的磷酸化，錯誤折疊與分子聚集可能會導致穩定微管功能的削弱，從而導致遞質運輸、儲存以及釋放功能的障礙[7]。

有研究表明Tau蛋白的過度磷酸化是以氧化應激為前端的[8]，在此之后Tau蛋白會出現錯誤的折疊以及高度磷酸化聚集，而Tau蛋白的異?；材軌驅€粒體功能進行干預，從而加劇氧化應激或產生其他逆行性事件的加劇，由此可見，Tau蛋白的過度磷酸化和氧化應激存在一定程度的相互促進從而導致惡性循環的發生。Tau蛋白的過度磷酸化表達蛋白之中，GSK-3β的作用較為顯著，現代研究表明其為絲氨酸-蘇氨酸的蛋白激酶，在Tau蛋白激酶中影響最大，可多位點磷酸化Tau蛋白，而其中GSK-3β 1H8是其最主要的活性形式[9]；PP-2A為絲氨酸、蘇氨酸的蛋白磷酸酶，現代研究表明它對細胞的增殖、生長、分化、凋亡過程影響較大，是活性最強的p-tau磷酸酯酶，可催化Tau蛋白多個位點去磷酸化，使磷酸化Tau蛋白恢復生物學功能。

蝦青素隸屬于類胡蘿卜素，現代研究表明其有著脂質過氧化的抑制作用，同時能夠有效的清除體內自由基，有著延緩衰老、抗癌等作用，其動物試驗表明可通過對視神經中Glu濃度的下調，有效的抑制GSK-3β 1H8表達，從而進一步減緩Tau蛋白過磷酸化的程度[10]。有人認為蝦青素抗氧化性具有保護神經的作用，特別是對缺血小鼠的神經具有明顯的保護作用。而有人對H2O2損傷的HepG2細胞的大鼠模型進行蝦青素干預后采用MTT法測定LDH的含量表明，蝦青素能夠有效的提高細胞生存率，對細胞毒性損傷的保護作用良好，同時通過對細胞Ca2+濃度的測定表明蝦青素能夠有效的降低細胞中Ca2+的濃度，從而對神經細胞和線粒體氧化損傷起到顯著保護作用。這些研究都表明蝦青素對細胞及神經氧化損傷方面有著較好的抗氧化活性效果。本文結果顯示，經電離輻射后的各時間段，滴加蝦青素標準品的大鼠神經節RGC-5離體培養神經元Tau蛋白激酶IOD值低于未添加蝦青素組別，且滴加蝦青素后，Tau蛋白激酶IOD值會隨時間而下降，這表明蝦青素對經電離輻射導致的小鼠視神經細胞獨行作用起到了一定的逆轉效果，其影響GSK-3β、PP2A的表達，有效的減緩了Tau蛋白的過磷酸化程度，從而對視神經功能的恢復起到一定的效果。

綜上所述，本文通過γ射線電離輻射致Tau蛋白過度磷酸化及蝦青素對其的緩解情況進行分析，對Tau蛋白過度磷酸化及其調控蛋白的表達分析可見，蝦青素能夠有效的降低GSK-3β蛋白的表達及提高PP-2A蛋白表達，降低γ射線電離輻射致Tau蛋白過度磷酸化情況，從而可能對抑制Tau蛋白過度磷酸化而預防電離輻射對視神經的損傷。

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Molecular biological mechanisms of astaxanthin in alleviating Tau hyperphosphorylation and reducing opticnerve radiation damage.

CHEN Li-ming1,REN Chun-wu1,LIU Xu-yang2,YANG Shi-qing1.1.Department of Ophthalmology,the Fifth People's Hospital of Longgang District of Shenzhen,Shenzhen 518111,Guangdong,CHINA;2. Department of Clinical Laboratory,Shenzhen Ophthalmologic Hospital,Shenzhen 518000,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo analyze the molecular biological mechanisms of optic nerve radiation damage and the effect of astaxanthin in alleviating Tau hyperphosphorylation.MethodsSixty-four cases of cultured neurons from in vitro cultured rat retinal ganglion cell line RGC-5 underwent γ-ray ionizing radiation(30 Gy).Then 64 cell culture chambers were randomly selected and divided into astaxanthin group(n=32)and non-astaxanthin group(n=32)based on the presence or absence of astaxanthin.12 h,24 h,48 h,1 week after irradiation,the expression of Tau protein kinase, GSK-3β protein,PP-2A protein were observed and compared between the two groups.ResultsIn astaxanthin group, the expression of Tau protein kinase,GSK-3β protein showed a decreasing trend 12 h,24 h,48 h,1 week after irradiation,while the expression of PP-2A showed an increasing trend.This change was not significant in non-astaxanthin group(P＞0.05).At the same time point,the expression of Tau protein kinase,GSK-3β protein were significantly lower in astaxanthin group than non-astaxanthin group,while the expression of PP-2Aprotein was significantly higher in astax-anthin group than non-astaxanthin group(P＜0.05).ConclusionAstaxanthin can effectively reduce the expression of GSK-3β protein and increase the expression of PP-2A protein,alleviate Tau hyperphosphorylation induced by γ-ray ionizing radiation,and hence reduce the optic nerve radiation damage by inhibiting the overexpression of Tau protein.

Optic nerve;Radiation damage;Astaxanthin;Tau protein;GSK-3β protein;PP-2Aprotein

R774.6

A

1003—6350（2016）01—0013—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.01.005

2015-09-02)

廣東省深圳市龍崗區2014年度科技計劃資助項目(編號：YLWS20140610105809149)

劉旭陽。E-mail：1148668608@qq.com