塞來昔布聯合吡咯烷二硫氨基甲酸對人鼻咽癌細胞株CNE-2Z生長的影響

向銀洲，顧昱，彭平，許軍，寧娜

(三峽大學人民醫院宜昌市第一人民醫院耳鼻咽喉科，湖北宜昌443000)

塞來昔布聯合吡咯烷二硫氨基甲酸對人鼻咽癌細胞株CNE-2Z生長的影響

向銀洲，顧昱，彭平，許軍，寧娜

(三峽大學人民醫院宜昌市第一人民醫院耳鼻咽喉科，湖北宜昌443000)

目的探討塞來昔布與吡咯烷二硫氨基甲酸(PDTC)聯合應用對人鼻咽癌CNE-2Z細胞株生長的影響及其可能機制。方法實驗分為對照組(不含任何藥物)、塞來昔布組(含塞來昔布50 μmol/L)、PDTC(含PDTC 50 μmol/L)組和塞來昔布+PDTC(含塞來昔布、PDTC均為25 μmol/L)組。細胞抑制率以四甲基偶氮唑藍實驗方法檢測；CNE-2Z細胞周期以流式細胞儀檢測；用免疫細胞化學染色法檢測核因子(NF)-κB和環氧合酶(COX)-2蛋白的表達；用Western-blot方法檢測含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-3蛋白表達。結果塞來昔布、PDTC單獨作用及塞來昔布+PDTC聯合作用于鼻咽癌CNE-2Z細胞24 h、48 h、72 h細胞的生長均受到抑制(P＜0.05)，二藥聯合組與單獨用藥組比較，細胞的生長抑制率差異有統計學意義(P＜0.05)。塞來昔布+PDTC聯合用藥作用于細胞48 h后G0/G1期細胞比例明顯高于塞來昔布組和PDTC組，抑制效果更顯著(P＜0.05)。免疫細胞化學染色顯示塞來昔布+PDTC組NF-κB、COX-2的表達明顯低于單獨用藥組(P＜0.05)。Western-blot實驗示聯合用藥組Caspase-3蛋白表達高于單獨用藥組(P＜0.05)。結論Cox-2抑制劑塞來昔布聯合PDTC能夠顯著抑制人鼻咽癌細胞株CNE-2Z增殖，其機制可能是通過降低COX-2、NF-κB表達，增強Caspase-3蛋白表達來實現。

塞來昔布；吡咯烷二硫氨基甲酸；人鼻咽癌細胞株；抑制作用

鼻咽癌是華南地區耳鼻咽喉科常見的惡性腫瘤之一，其發病原因與與多種因素相關，如遺傳易感性、病毒感染、化學致癌物等。鼻咽癌早期患者3年生存率約為90%，5年生存率徘徊在78%；晚期患者5年生存率更不樂觀，約40%，多數患者死于腫瘤的復發和遠處轉移[1]。因此從分子水平探索預防、治療鼻咽癌的措施很有必要，本研究探討了環氧合酶抑制劑塞來昔布聯合核因子(NF)-κB抑制劑吡咯烷二硫氨基甲酸(PDTC)對鼻咽癌CNE-2Z細胞生長增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料第三軍醫大學腫瘤研究所惠贈人鼻咽癌細胞株CNE-2Z；吡咯烷二硫氨基甲酸(PDTC)、二甲基亞砜(DMSO)、碘化丙啶(PI，美國Sigma公司)；塞來昔布分析純(美國輝瑞公司)；四甲基偶氮唑藍(MTT，上海生物工程公司)；RPMI-1640(美國Hyclone公司)；乙二胺四乙酸(DAB)染色盒、鼠抗含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-3、鼠抗人COX-2單克隆抗體、SP-9000免疫組化盒(北京中杉金橋生物公司)；新生牛血清、胰酶(杭州四季青公司)；總RNA提取試劑Trizol(武漢谷歌生物科技有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 CNE-2Z細胞培養復蘇人鼻咽癌CNE-2Z細胞，接種于100 ml培養瓶中，加入含10%滅活胎牛血清、100 U/ml鏈霉素和100 U/ml青霉素的RPMI-1640培養液，放置于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養箱中培養。常規更換培養液，進行正常傳代，取對數生長期細胞進行實驗。

1.2.2 四甲基偶氮唑藍(MTT)比色法測定CNE-2Z細胞生長的抑制率取處于對數生長期的CNE-2Z細胞進行實驗，0.25%胰蛋白酶消化細胞，調整細胞懸液濃度為5×104/ml，按每孔200 μl接種于96孔板上。細胞貼壁后分為塞來昔布組(50 μmol/L)、PDTC組(50 μmol/L)、塞來昔布(25 μmol/L)+PDTC組(25 μmol/L)，同時設立空白對照組(只加培養基)。每個濃度5個復孔，重復3板，分別在培養24 h、48 h及72 h后除去培養液，每孔加入200 μl無血清培養液和20 μl MTT(50 mg/m1)，繼續培養4 h后棄培養液，每孔加入200 μl二甲基亞砜，振蕩10 min，用酶標儀測定570 nm波長處吸光度(A)值。參照文獻[2]計算細胞抑制率。細胞抑制率(0A)=(1-實驗組A值/細胞對照組A值)×100%。

1.2.3 流式細胞儀檢測CNE-2Z細胞周期選取對數生長期CNE-2Z細胞，調整細胞濃度為1.0×105/ml，將細胞接種至100 ml培養瓶中，加入適量含10%滅活胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 U/ml鏈霉素的RPMI-1640培養液，在37℃、飽和濕度、5%CO2培養箱中培養24 h，待細胞生長至70%～80%融合時，分對照組(不加任何藥物)、塞來昔布組(50 μmol/L)、PDTC組(50 μmol/L)和塞來昔布+PDTC(25/25 μmol/L)4組。培養48 h后除去培養液，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，用0.25%胰蛋白酶消化細胞，制備成細胞懸液，70%預冷(-20℃)乙醇固定，過夜。吸去乙醇，PBS沖洗3次，調整細胞濃度為1×106/ml，加入RNase酶(20 μg/ml)200 μl消化30 min，加入1 ml碘化丙啶(20 μg/ml)，于室溫遮光染色30 min，上流式細胞儀檢測，每組重復3次，Cell Quest及Modifit軟件分析細胞周期分布。

1.2.4 免疫細胞化學染色檢測NF-κB、COX-2蛋白表達選取對數生長期CNE-2Z細胞，制成5×104/ml濃度細胞懸液，接種于預置蓋玻片的6孔板中，每孔2 ml，放入37℃、飽和濕度、5%CO2培養箱中培養24 h，貼壁后分四組，分別為對照組(不加任何藥物)、塞來昔布組(50 μmol/L)、PDTC(50 μmol/L)組和塞來昔布(25 μmol/L)+ PDTC(25 μmol/L)組。培養24 h，更換無藥培養液培養24 h后除去培養液，PBS洗滌3次，95%的乙醇室溫固定30 min后，PBS洗滌3次，取出蓋玻片，常規SP法免疫化學染色，DAB顯色，晾干封片后光鏡下觀察。CNE-2Z細胞中NF-κB陽性表達標準為細胞漿和細胞核中可見棕黃色顆粒；COX-2陽性表達標準為為細胞漿可見棕黃色顆粒。HSCORE評分：排除爬片邊緣細胞，在低倍鏡下隨機選取細胞分布均勻的視野10個，然后在高倍鏡下每個視野隨機選50個細胞，根據細胞漿或核著色深淺進行NF-κB、COX-2蛋白表達評分：(1)陰性：0分，不著色；(2)弱陽性：1分，淡黃色；(3)陽性：2分，黃色；(4)強陽性：3分，深棕色。根據公式HSCORE=ΣPi(i+1)(i=0，1，2，3；Pi表示評分為i的比例)計算細胞HSCORE得分[3]。

1.2.5 Western blot檢測Caspase-3蛋白表達細胞濃度調為1.0×104ml，接種于100 ml培養瓶中，加入適量培養基，細胞貼壁后分四組，分為對照組(不加任何藥物)、塞來昔布組(50 μmol/L)、PDTC(50 μmol/L)組和塞來昔布(25 μmol/L)+PDTC(25 μmol/L)組。培養24 h，均更換無藥培養液培養24 h，吸去培養液，PBS洗滌3次，用0.25%胰蛋白酶消化細胞，轉移至離心管中，加入蛋白質裂解液100 μl，在冰浴條件下靜置裂解30 min，上離心機離心5 min后收集上清液，用考馬斯蘭亮法定量，進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，將凝膠中的蛋白質轉移到硝酸纖維素膜上，4℃封閉過夜。將硝酸纖維素膜放人含一抗Caspase-3抗體的封閉液中，4℃過夜，電轉液洗3次，每次10 min。放人含辣根酶標記的相應IgG二抗抗體的封閉液中，室溫2 h，電轉液洗3次，每次10 min。將膜放在保鮮膜上，檢測Caspase-3蛋白的表達，并用Quantity One分析軟件進行灰度值測定。

2 結果

2.1 MTT檢測藥物對CNE-2Z鼻咽癌細胞的生長抑制率的影響塞來昔布+PDTC組對鼻咽癌CNE-2Z細胞的生長抑制作用強于塞來昔布組、PDTC組對鼻咽癌CNE-2Z細胞的生長抑制作用，差異有統計學意義(P＜0.05)，見表1。

表1 各組藥物不同時間對鼻咽癌細胞的生長抑制率(n=5，%，±s)

表1 各組藥物不同時間對鼻咽癌細胞的生長抑制率(n=5，%，±s)

別24 h 48 h 72 h塞來昔布組TC組來昔布+PDTC組值30.21±6.42 35.78±6.33 51.20±3.12 19.48 4472 PD塞F P值＜0.05 7.35±7.11 4.56±6.47 0.34±4.68 6.26＜0.05 52.64±5.97 50.63±5.52 88.32±3.89 81.89＜0.05

2.2 流式細胞儀檢測細胞周期分布塞來昔布組、PDTC組及塞來昔布+PDTC組分別作用48 h后，CNE-2Z細胞的細胞周期分布見表2。塞來昔布+ PDTC組G0/G1期細胞比例明顯增高，細胞呈現G0/G1期阻滯，抑制效果更顯著，差異有統計學意義(P＜0.05)。

表2 流式細胞儀檢測CNE-2Z細胞周期的變化(n=3，%，±s)

表2 流式細胞儀檢測CNE-2Z細胞周期的變化(n=3，%，±s)

組別G0/G1期S期G2/M期對照組塞來昔布組PDTC組塞來昔布+PDTC組F值P值66.84±5.21 81.66±7.80 80.54±5.14 92.52±4.68 9.75＜0.05 21.11±2.21 8.72±1.22 9.87±2.13 4.39±1.92 41.76＜0.05 12.05±1.73 9.62±1.06 9.59±1.44 3.09±1.18 23.36＜0.05

2.3 免疫細胞化學檢測NF-κB和COX-2蛋白的表達NF-κB和COX-2在各組CNE-2Z細胞表達呈陽性，分別在細胞核和細胞漿有黃色顆粒。與對照組、塞來昔布組、PDTC組比較，塞來昔布+PDTC組NF-κB、COX-2的表達明顯降低，差異有統計學意義(P＜0.05)。各組免疫組化染色評分見表3。

表3 各組細胞中NF-κB、COX-2免疫組化染色和組織學評分(分，±s，n=12)

表3 各組細胞中NF-κB、COX-2免疫組化染色和組織學評分(分，±s，n=12)

組別NF-κB COX-2對照組塞來昔布組PDTC組塞來昔布+PDTC組F值P值2.76±0.53 2.13±0.46 1.86±0.35 1.08±0.31 32.70＜0.05 2.56±0.43 1.55±0.29 1.97±0.32 1.17±0.28 37.89＜0.05

2.4 Western blot法檢測Caspase-3蛋白的表達塞來昔布組、PDTC組和塞來昔布+PDTC組與對照組比較，Caspase蛋白表達增高，差異有統計學意義(P＜0.05)；塞來昔布+PDTC組與單獨用藥組比較，Caspase-3表達增高更顯著，差異有統計學意義(P＜0.05)，見圖1。

圖1 各組細胞Caspase-3的表達注：1～4泳道分別為對照組、塞來昔布組、PDTC組和塞來昔布+PDTC組。

3 討論

鼻咽癌的發生、發展、轉移與多種細胞因子相關，如COX-2、NF-κB等在鼻咽癌細胞中的表達與細胞的生長增殖及凋亡等均有相關性[4-5]。本實驗采用塞來昔布與PDTC聯合作用于鼻咽癌CNE-2Z細胞，與單用一藥比較，其抑制生長增殖作用更顯著。NF-κB具有抑制細胞凋亡和參與調控細胞周期的雙重功效，其抑制細胞凋亡可能是通過誘導阻止凋亡進程的基因表達來實現，包括Bcl-2家族的成員、細胞凋亡抑制蛋白(IAP)家族等[6]。有研究在22只人乳腺導管癌裸鼠的腫瘤組織中檢測NF-κB、Caspas-3的表達，結果顯示NF-κB與Caspas-3蛋白表達呈負相關。其機制可能是各種凋亡相關因子作用于Caspas-3的前體，使前體轉化為有活性的Caspase-3，激活了DNA酶，導致細胞核內染色體聚集、斷裂或細胞骨架降解，從而引起細胞凋亡[7]。

本實驗結果顯示塞來昔布、PDTC單獨應用可以抑制鼻咽癌CNE-2Z細胞的生長增殖，表現為CNE-2Z細胞G0/G1期細胞增多，S期及G2/M期細胞減少，CNE-2Z細胞生長過程明顯受阻于G0/G1期。塞來昔布與PDTC聯合應用后細胞生長過程受阻于G0/G1期更顯著。免疫細胞化學染色實驗中，Cox-2、NF-κB表達陽性，二藥聯用比單獨應用一種藥物其表達降低更明顯。從蛋白水平分析，二藥聯用后Caspase-3表達升高，可能是通過Cox-2、NF-κB途徑抑制了鼻咽癌細胞的生長增殖，促進了細胞凋亡[8]。NF-κB是一種重要的多功能核轉錄因子，是由p65和p50構成的雜二聚體，參與真核細胞凋亡相關基因的轉錄與表達，其抑制細胞凋亡的作用可能與凋亡相關抑制蛋白家族中某些成員有關，抑制NF-κB活性可以誘導家族中某些因子的表達變化，從而促進Caspase-3表達，發揮抗凋亡作用[9]。

本實驗提示Cox-2抑制劑塞來昔布聯合NF-κB抑制劑吡咯烷二硫氨基甲酸對人鼻咽癌細胞株CNE-2Z生長增殖有抑制作用，其協同促進人鼻咽癌細胞株CNE-2Z凋亡機制有待進一步研究。隨著更多相關實驗的進行，塞來昔布、PDTC的作用機制會更加明確，它們將成為很有前景的抗腫瘤藥物。

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Effects of celecoxib combined with pyrrolidine dithiocarbamate on human nasopharyngeal carcinoma CNE-2Zcell lines.

XIANG Yin-zhou,GU Yu,PENG Ping,XU Jun,NING Na.Department of Otolaryngology,the People's Hospital of Three Gorges University,the First People's Hospital of Yichang

ObjectiveTo study the sound effects of celecoxib combined with pyrrolidine dithiocarbamate(PDTC)on the growth of human nasopharyngeal carcinoma CNE-2Z cell lines and the possible mechanisms.MethodsThe experiment enrolled 4 groups:control group(without drug),celecoxib group(celecoxib 50 μmol/L),PDTC group(PDTC 50 μmol/L)and celecoxib+PDTC group(celecoxib 25 μmol/L+PDTC 25 μmol/L). The inhibition rate of cell growth was detected by four methyl thiazolyl tetrazolium colorimetric(MTT)method.The tumor cell cycle was analyzed by flow cytometry.The expressions of nuclear factor kappa B(NF-κB)and cyclooxygenase (COX)-2 were examined by immunocytochemistry method.The expression of cysteinyl aspartate specific proteinase (caspase)-3 was tested by Western blot.ResultsThe proliferation activity of nasopharyngeal carcinoma CNE-2Z cells with celecoxib,PDTC,celecoxib+PDTC processing(24 h,48 h and 72 h)all were inhibited significantly(P＜0.05).Compared to PDTC group and celecoxib group,the inhibition rate of celecoxib+PDTC group showed significant difference (P＜0.05).Treated by Celecoxib and PDTC for 48 h,cell cycle was prevented in G0/G1phase.Cell percentage in G0/G1phase was significantly higher than that of celecoxib group and PDTC group(P＜0.05).The result of immunocytochemical staining indicated that the expressions of NF-κB and COX-2 in celecoxib+PDTC group were significantly lower than that of celecoxib group and PDTC group(P＜0.05),and Western blot indicated that the expression of caspase-3 in celecoxib+PDTC group was significantly higher(P＜0.05).ConclusionCOX-2 inhibitor celecoxib combined with PDTC can inhibit the proliferation of CNE-2Z cell lines.Its possible mechanism is to decrease the expressions of COX-2 and NF-κB,and enhance the expression of caspase-3 protein.

Celecoxib;Pyrrolidine dithiocarbamate;Human nasopharyngeal carcinoma cell line;Inhibition

R739.63

A

1003—6350（2016）01—0007—03

2015-07-13)

湖北省宜昌市科技局基金資助項目(編號：A14301-16)

向銀洲。E-mail：2402342279@qq.com