液態羥基磷灰石膠原海藻酸鈉（Alg/nHAC）人工骨促進Ilizarov骨延長骨愈合的實驗研究*

朱超王華劉偉王邵清王斌馮慶玲劉新暉*

液態羥基磷灰石膠原海藻酸鈉（Alg/nHAC）人工骨促進Ilizarov骨延長骨愈合的實驗研究*

朱超1王華1劉偉1王邵清1王斌1馮慶玲2劉新暉1*

目的探討應用液態海藻酸鈉/納米羥基磷灰石/膠原（Alg/nHAC）促進肢體延長過程中骨愈合的作用。方法制備液態可注射Alg/nHAC人工骨，建立兔脛骨骨延長動物模型，隨機分兩組，A組，骨延長區給予微創注射Alg/nHAC人工骨，B組作為空白對照，分別在延長后2、4、8周進行組織學，X線檢查、新生骨小梁百分比、骨密度以及生物力學的檢測觀察延長區骨愈合情況。結果延長后2、4、8周，A組在組織學、新生骨小梁百分比、骨密度以及生物力學的檢測均明顯優于B組，A組8周時間骨延長區已經愈合。結論液態羥基磷灰石膠原海藻酸鈉（Alg/nHAC）人工骨可以通過微創注射的方式促進延長區骨愈合，為臨床促進骨愈合提供了新的方法。

海藻酸鈣/納米羥基磷灰石/膠原；伊力扎洛夫；骨愈合

隨著Ilizarov牽拉骨再生的生物學原理的創立及其在臨床中的應用，給肢體延長技術帶來了革命性的變化。但是臨床中發現，隨著延長幅度的加大，延長后的并發癥逐漸增加，其中骨愈合較緩慢是其中重要的并發癥之一[1]，本實驗通過建立兔脛骨肢體延長的動物模型觀察了和探討了應用液態海藻酸鈉/納米羥基磷灰石/膠原（Alg/nHAC）微創法促進肢體延長過程中骨愈合的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

健康新西蘭大耳白兔60只，南京醫科大學大學實驗動物中心提供（2～2.5kg），海藻酸鈉/納米羥基磷灰石/膠原（Alg/nHAC），12mm克氏針，飛利浦500mAX線機拍片，IPP（Image-ProPlusIPP）Mediaplayer，DEXAUNIT-2000雙能 X線骨密度儀器，USS生物力學試驗機，自動脫水機TP102，切片機2125，自動石蠟包埋機 TKY-BM，烤片機HI1220，推片機HI1210，雙目照相奧林巴斯顯微鏡CX31，圖像分析系統。

1.2 兔脛骨肢體延長動物模型的制備[2]

新西蘭大耳白兔（2～2.5kg），術前禁食，備左后肢皮膚，1%戊巴比妥鈉靜脈麻醉（3mg/kg）。麻醉成功后，兔仰臥于兔臺，消毒鋪單。先用電鉆在脛骨結節上方約1.0cm處交叉鉆入2枚1.2mm克氏針，安裝預先裝配好的外固定架的一個環，并將克氏針固定在鋼環上，遠端也交叉鉆入2枚1.0mm克氏針，與近端克氏針相對應，同樣用螺栓將針固定在鋼環上。調整外固定架，使外固定架牢固，平行。在無菌條件下于上、下2組鋼針之間取脛骨前外側縱行切口，深達骨膜，并于骨膜下剝離，顯露脛骨上段，小心撬斷腓骨下端，并用線鋸于脛骨結節下完全截斷脛骨，調整外固定架，使骨折兩端靠攏并保持解剖對位，擰緊所有的螺帽。沖洗傷口，縫合骨膜后關閉切口（圖1，圖2）。（彩圖見插頁）術后應用青霉素40萬U肌肉注射5天，同時在刀口及針道處安爾碘濕敷，預防感染。術后第5天開始延長，延長速度為1mm/d，分2次完成，共20天，延長20mm。延長完成后固定9周。按相同條件常規飼養，任兔在籠中自由活動。定期處死動物，取標本。

圖1 橫行截骨后

圖2 兔脛骨肢體延長動物型制備術后

1.3 海藻酸鈉/納米羥基磷灰石/膠原（Alg/nHAC）的制備[3]

1.4 動物分組

取60只新西蘭大耳白兔，（2～2.5kg），隨機分成A、B兩組，每組30只。待延長結束后，A組延長區注射液態Alg/ nHAC，B組未給與任何處置作為對照。A、B兩組在相同條件下進行造模及飼養，任兔在籠中自由活動。定期處死動物，取標本。

1.5 觀察指標

1.5.1 大體觀察

觀察術后傷口愈合情況，針道是否感染及日?；顒忧闆r，延長區大體標本成骨情況。

1.5.2 組織學觀察

分別在骨延長中期及結束后、延長結束后第2、4、8周處死動物取材，標本用10%甲醛固定，已骨化的標本脫鈣2周，石蠟包埋切片，HE染色，封片后光鏡下觀察。

1.5.3 X線觀察

術后、骨延長結束后及延長結束后第2、4、8周，飛利浦500mAX線機拍片，曝光條件為：50KV，4ms。觀察延長部位的成骨及骨痂形成情況。

1.5.4 骨小梁百分比面積測定

鏡下觀察組織切片，采集圖像，應用 IPP（Image-Pro PlusIPP）Mediaplayer形態計量軟件測定骨小梁百分比面積測定

1.5.5 骨密度測定

于延長結束后8周，每組各處死5只兔子取材，在DEXAUNIT-2000雙能X線骨密度儀器測定骨密度。

1.5.6 生物力學測定

分別與 2、4、8周兔脛骨延長區進行三點彎實驗。A組、B組每個時間段各5個標本，并取對側正常脛骨5個標本設為C組做對照。標本中點為支點，兩端固定，以30mm為跨距，以0.5mm/min的恒定速度均勻緩慢加載至其斷裂，取均值對比各組最大應力值。

1.6 統計學方法

所得數據用SPSS17.0統計軟件進行統計學分析。計量資料用（±s）表示，組間比較采用t檢驗。＜0.05或0.01表示差異有統計學意義。

2 結果

術后兔子飲食、活動正常，患肢輕度腫脹，1～2周后消腫，切口均正常愈合。實驗過程中有2只兔子因腹瀉死亡，2只兔子于克氏針固定處骨折，上述動物排除實驗，剩余兔子均生存到實驗所需的各時間段。外固定架固定可靠，未對動物產生不良影響。

2.1 大體觀察

骨延長結束后取標本10個，見延長區為致密纖維結締組織，質柔韌，未見骨化。延長結束后第2周，共處死10只兔子取標本，每組5個。A組延長區大部分骨化，手術刀片切割骨痂較困難；B組延長區少部分骨化，仍存在大部分纖維結締組織。延長結束后第4周，共處死10只兔子取標本，每組5個。A組延長區已完全骨化，但強度但強度較健側弱，可輕易用手折斷；B組延長區基本已骨化，骨痂強度不大，可用手術刀片切割。延長結束后第8周，共處死10只兔子取標本，每組5個。A、B組延長區全部骨化，A組外觀已與正常骨相類似，用手難于折斷；B組可輕易用手折斷。手術側脛骨與健側脛骨比較，延長了2cm。

2.2 組織形態學觀察

延長中期及結束后：共處死10只兔子取標本，中期5個，延長結束后5個。延長區為致密纖維結締組織充填，未觀察到骨組織。延長結束后第2周：共處死10只兔子取標本，每組5個。A組植入的材料被纖維性結締組織分割。纖維性結締組及血管長入植入材料的內部，在大部分材料中間能看到纖維性骨痂為主的類骨質形成，而被分割材料的周邊出現少量的骨性骨痂；B組以纖維結締組織為主，有少量的類骨質形成。延長結束后第4周：共處死10只兔子取標本，每組5個。A組：可見大部分成熟骨，骨陷窩及其內骨細胞的數量明顯增加，植入的材料明顯減少；B組出現大量類骨質出現，形成編織骨，骨小梁漸成熟，部分成骨細胞逐漸成熟變為骨細胞，骨小梁較2周時增多，仍以幼稚骨小梁為主。延長結束后第8周，共處死10只兔子取標本，每組5個。A組：注入的材料基本消失，大量的成熟骨性骨痂形成（圖3）（彩圖見插頁）；B組以大量纖維行骨痂和骨性骨痂為主，有少量的成熟骨陷窩及骨細胞出現（圖4）（彩圖見插頁）。

圖3 延長結束后第8周A組：注入的材料基本消失，只有在中心存在有極少量的材料，大量的成熟骨性骨痂形成（HE×100）

圖4 延長結束后第8周B組以大量纖維行骨痂和少量的骨性骨痂為主，有成熟骨陷窩及骨細胞出現（HE×100）

2.3 X線檢查

術后即刻拍片示脛骨截骨完全，腓骨亦斷開，截骨處對位、對線佳；延長后10天拍片示截骨部位已牽開，對位對線良好；延長結束后即刻拍片，牽開約2cm，對位對線良好，延長區低密度顯影，未見鈣化（圖5）。A組注射液態Alg/nHAC也為低密度顯影（圖6）。延長結束后第2周：A組大量的高密度影形成并充填于延長區；B組僅見少量高密度顯影，即僅有少量的新生骨形成，延長區大部分為低密度顯影。延長結束后第4周：A組延長區高密度較2周明顯增高增多；B組骨痂量較2周時增多，但比A組少。延長結束后第8周：A組影像表現已接近正常骨，髓腔貫通，延長區皮質骨與上下鄰近部位正常骨密度相似（圖7）；B組延長區全部骨化，但骨密度較低，骨量不多（圖8）。

圖5 延長結束后即刻拍片牽開約2cm，對位對線良好，延長區低密度顯影，未見鈣化

圖6 A組注射液態NHAC/Alg也為低密度顯影

圖7 延長結束后第8周A組影像表現已接近正常骨，髓腔貫通，延長區皮質骨與上下鄰近部位正常骨密度相似

圖8 延長結束后第8周B組延長區全部骨化，但骨密度較低，骨量不多

2.4 骨小梁百分比面積測定

本實驗共獲取30個標本，其中2周時：10個標本（A組5個，B組5個）；4周時：10個標本（A組5個，B組5個）；8周時：10個標本（A組5個，B組5個）。測定結果經統計學分析顯示A、B兩組分別在2、4、8周有顯著性差異，＜0.01；A組的骨小梁百分比面積明顯高于B組，見表1。

表1 兩組動物在不同時間段骨小梁百分比面積比較（±s）

表1 兩組動物在不同時間段骨小梁百分比面積比較（±s）

組別 2周 4周 8周A組B組值7.1 9.60值11.2±2.01 32.42±2.88 51.49±9.28 4.51±1.83 18.68±3.77 33.11±4.11 10.9＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

2.5 骨密度測定

本實驗8周時共獲取10個標本：（A組5個，B組5個）。以對側正常脛骨（取10個標本）作為C組測量正常值。

A 組 BMD 為（0.1240±0.0069）、B 組 BMD 為（0.0873±0.0042）、C組BMD為（0.1771±0.0078）。A組在8周時BMD高于B組。兩組之間有顯著性差異（＜0.01）。A組在8周時恢復到正常值的70.29%，B組恢復到正常值的49.29%，兩組之間有顯著性差異（＜0.01）。

2.6 生物力學測定

本實驗8周時共獲取10個標本：（A組5個，B組5個），并取5個對側正常脛骨（取10個標本）作為 C組測量正常值。

A組的最大折彎應力為（273.524±50.680）N（圖9）、B組最大折彎應力為（132.471±37.010）N（圖10）、C組的最大折彎應力為（396.570±45.121）N（圖11）。A組在8周時最大折彎應力高于B組。兩組之間有顯著性差異（＜0.01）。A組在8周時恢復到正常值的68.94%，B組恢復到正常值的33.33%，兩組之間有顯著性差異（＜0.01）。（圖9-圖11彩圖見插頁）

圖9 A組最大折彎應力

圖10 B組最大折彎應力

圖11 C組最大折彎應力

3 討論

本世紀50年代末60年代初，Ilizarov提出了牽張應力效應、環型外固定器與臨床應用技術，使骨骼延長術得以廣泛的應用，被譽為矯形外科的第4個里程碑[4]。雖然Ilizarov肢體延長術被稱為是骨科治療學上的一次革命，但由于其骨愈合較緩慢，并有較多的并發癥。由于每天僅僅能以1.0mm左右的速度牽拉，加上延長區骨愈合時間，每延長1.0mm約需一兩個月的時間，如延長5.0mm約需半年左右的時間[5]。因此，許多學者在促進骨愈合的機制和方法上進行了探索。Kassis[6]在延長結束后立即對延長區施加軸向微動刺激，觀察到軸向微動刺激能增加骨痂體積、骨痂礦物質含量及密度，有利于骨愈合；Kitoh[7]應用自體骨髓干細胞植入延長區觀察到明顯的促進了骨愈合。徐鵬[8]等通過延長區注射rhBMP2觀察到可明顯促進延長區的骨修復。

上述方法雖有一定效果，作者對結果未能十分滿意。既往的研究證實納米羥基磷灰石有促進骨化和再生的能力[9]，而膠原是一種天然高分子材料，具有優異的生物相容性和生物活性[10]。本試驗應用制備的液態Alg/nHAC，通過微創的方法將Alg/nHAC注射到兔子脛骨延長的動物模型延長區，分別從大體角度和組織學角度都觀察到Alg/nHAC組新生成的骨痂明顯多于對照組，從X線也見到Alg/nHAC組在不同時間段的延長區新形成的高密度均優于對照組。通過測定骨密度和生物力學檢測也證實治療組骨修復程度和強度均高于對照組，所以證實Alg/nHAC是有效的、理想的一種促進牽拉成骨愈合的新型材料。且Alg/nHAC可制備成液態通過注射微創的方法應用，具備創傷小恢復快的特點。Alg/nHAC促進牽拉成骨主要有以下兩方面原因。一方面，納米羥基磷灰石的微結構可以增加植入物的表面面積。這種結結構可以聚集更多的蛋白。這些蛋白可能包括骨誘導蛋白，可以通過影響細胞的黏附、增殖和分化促進成骨。另一方面膠原作為交聯劑，它的螺旋形結構為組織的再生創造了最為合適的微環境。

為了促進骨愈合，近年來又有學者進行了很多研究[11,12]。隨著現代醫學的發展，微創理念逐步深入人心，在臨床治療中引入微創技術無疑有很好的前景。而延長區注射液態Alg/ nHAC可有效的促進牽拉成骨，并且創傷較小，有希望應用于臨床，解決骨干截骨進行延長愈合差的難題，從而減少了骨干骺端固定困難、對鄰近關節所致不良干擾等并發癥。

[1]M.Kenawey,C Krettek,E Liodakis,et al.Leg lengthening using intramedullay skeletal kinetic distractor results of 57 consecutive applications[J].Injury,2011,42（2）:150-155.

[2]王明海，洪洋，甘少磊，等.血管化可注射性納米組織工程骨對骨再生血管形成的影響[J].中華臨床醫師雜志（電子版），2013，7（13）：5948-5952.

[3]Xinhui Liu,Chao zhu,Yijiong Li,et al.The preparation and in vitro evaluations of a nanoscaled injectable bone repair material[J]. Journal of Nanomaterials,Volume 2015（2015）:858493.

[4]秦泗河.Ilizarov技術概述[J].中華骨科雜志，2006，26（9）：642-645.

[5]Kanellopoulos AD,Soucacos PN.Management of nonunion with distracetion osteogenesis[J].Injury,2006,37（1）:51-55

[6]KassisB,GlorionC,T abibW.Callusresponsetomicromovement after elongation in the rabbit[J].J Pediatr Ortho,1996,16（4）: 480485.

[7]Kitoh H,Kitakoji T,Tsuchiya H,et al.Transplantation of marrowderived mesenchymal stem cells and platelet-rich plasma during distraction osteogenesis-a preliminary result of three cases[J]. Bone,2004,35（4）:892-898.

[8]徐鵬，王丹輝，李長勝，等.重組人骨形態發生蛋白2局部注射促進兔脛骨延長區的骨愈合 [J].中國組織工程研究與臨床康復，2007，11（32）:6335-6337.

[9]Y Deng,H Wang,L Zhang,et al.In situ synthesis and in vitro biocompatibility of needle-like nano-hydroxyapatite in agar-gelatinco hydrogel[J].Materials Letters,2013,104:8-12.

[10]YC Chiu,M H Cheng,S Uriel,et al.Materials for engineering vascularized adipose tissue[J].Journal of Tissue,2011,20（2）:37-48.

[11]X Li,H Liu,X Niu,et al.The use of carbon nanotubes to induce osteogenic differentiation of human adipose-derived MSCs in vitro and ectopic bone formation in vivo[J].Biomaterials,2012,33（19）:4818-4827.

[12]X Li,L Wang,Y Fan,et al.Nanostructured scaffolds for bone tissue engineering[J].Journalof Biomedical Materials Research A, 2013,101A（8）:2424-2435.

The experimental study on promoting the Ilizarov distraction osteogenesis by the injectiong of liquid Alg/nHAC biocomposites

Zhu Chao1,Wang Hua1,Liu Wei1,et al.
1 Department of Orthropaedics,Jiangning Hospital of Nanjing affiliated to Nanjing Medical University,Nanjing Jiangsu,211100;2 Department of Material Science and Engineering,Tisinghua University,Beijing,10081,China

Objective To investigate the effect of liquid sodium alginate/nanohydroxyapatite/collagen(Alg/nHAC)on promoting thehealingprocessof bonelengthening.Methods Alg/nHACinjectable artificialbone was fabricatedbyusing nano technology,and Animal model of rabbit tibia limbs,elongation were produced.All animals were randomly divided into two groups.After the end of the extension,liquid Alg/nHAC was injected into group A in the region of elongation. Group B were not given any treatment as control.Histologically morphological observations,X-ray examination,biomechanical test,bone density,and biomechanical test were used to evaluate the bone healing of extention area at 2,4 and 8 weeks after termination of bone elongation.Results Group A were better than Group B in histologically morphological observations,X-ray examination,biomechanical test,bone density,and biomechanical test at 2,4 and 8 weeks after termination of bone elongation.Group A bone elongation area has healed at 8 weeks after termination of bone elongation.Conclution Liquid alginate/nanohydroxyapatite/collagen(Alg/nHAC)can promote bone healing of extended area by minimally invasive injection.It provides a new method to promote bone healing in clinical.

Alg/nHAC; Ilizarov;Bone healing

R318

B

10.3969/j.issn.1672-5972.2016.06.02

swgk2016-07-00167

朱超（1982-）男，碩士，主治醫師。研究方向：骨科。

*[通訊作者]劉新輝（1971-）男，博士，主任醫師。研究方向：骨科。

2016-07-20)

江蘇省自然科學基金項目BK20141436

1南京醫科大學附屬南京江寧醫院骨科，江蘇南京211100；2清華大學材料科學與工程系北京100081