DADS上調miR-200b抑制視網膜母細胞瘤細胞的生長與侵襲

劉越峰，張勇，鐘曉東，羅衛民

(湖北醫藥學院附屬十堰市太和醫院眼科中心1、心胸外科2，湖北 十堰 442000)

DADS上調miR-200b抑制視網膜母細胞瘤細胞的生長與侵襲

劉越峰1，張勇1，鐘曉東1，羅衛民2

(湖北醫藥學院附屬十堰市太和醫院眼科中心1、心胸外科2，湖北 十堰 442000)

目的 探索miR-200b和二烯丙基二硫(DADS)相關的抑瘤機制，為揭示DADS抑制視網膜母細胞瘤生長及侵襲的內在分子機制提供理論依據。方法采用qRT-PCR分別檢測不同濃度的DADS對Y79細胞miR-200b表達的影響，DADS分別設置六種濃度：0μmol/L、25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L和400μmol/L。MTT和Transwell侵襲實驗分別檢測DADS和miR-200b對Y79細胞生長及侵襲能力的影響，將實驗設置成五個組，即miRNA陰性對照組(瞬時轉染scramble 40 μmol/L)；miR-200b組(瞬時轉染miR-200b-mimics 40 μmol/L)；DADS陰性對照組(DMSO 10 μmol/L，即mock組)；DADS組(DADS 200 μmol/L)和DADS+miR-200b組(瞬時共轉染miR-200b-mimics 40 μmol/L)和DADS(200 μmol/L)。結果DADS可上調Y79細胞中miR-200b的表達，且其呈劑量依賴性(P＜0.05)；在MTT實驗中，miR-200b組的OD值(0.549±0.057)較miRNA陰性對照組(0.737±0.135)明顯降低；DADS組的OD值(0.508±0.064)較DADS陰性對照組(0.722±0.145)明顯降低；而DADS+miR-200b組的OD值(0.362±0.081)較miRNA陰性對照組和DADS陰性對照組降低最為顯著(P＜0.05)，即DADS可以通過上調miR-200b抑制Y79細胞的增殖能力。在Transwell侵襲實驗中，外源性的高表達miR-200b組(105±13)較miRNA陰性對照組(162±12)能夠顯著抑制Y79細胞的穿膜細胞數，DADS組(102±13)較DADS陰性對照組(154±8)能夠顯著降低Y79的穿膜細胞數，且DADS+miR-200b組(77±8)，細胞穿膜細胞數較miRNA陰性對照組和DADS陰性對照組減少最顯著(P＜0.05)，即DADS通過上調miR-200b抑制Y79細胞侵襲。結論DADS通過上調miR-200b的表達抑制視網膜母細胞瘤細胞的生長及侵襲。

視網膜母細胞瘤；MiR-200b；二烯丙基二硫；增殖；侵襲

二烯丙基二硫(Diallyl disulfide，DADS)對腫瘤的抑制作用多有報道，其為一種最初從大蒜中提取得到的天然化合物二烯丙基二硫。研究報道顯示DADS可抑制肺癌、胃癌、乳腺癌和白血病等多種惡性腫瘤[1-2]。在胃癌中，DADS可抑制細胞的生長并誘導分化[3-4]。在結腸癌中，DADS可抑制腫瘤細胞的增殖[5]。在白血病中，DADS可阻滯細胞的細胞周期[6]。而DADS的抑癌機制與其能抑制DNA的加合物及活性氧形成、激活解毒致癌物的代謝酶、阻滯細胞周期和誘導腫瘤細胞凋亡等相關[7]。

MicroRNAs(miRNAs)是一種內源性的單鏈非編碼RNA分子，通過與其靶基因3′-UTR(3′-非編碼區)的完全或不完全配對，miRNA能使翻譯抑制或者使靶mRNA降解，并轉錄后水平上對靶基因的表達進行調控[8]。在腫瘤的發生及發展過程中，miRNA可對細胞的增殖、分裂、分化及調亡等重要的生物學過程進行調控，發揮抑制或促進腫瘤進程的作用。據報道，miR-200b在多種細胞，組織或實體腫瘤中表達下調，并與多種腫瘤的生長增殖或復發轉移等相關，如乳腺癌[9]、胃癌[10]和膠質瘤[11]等。

視網膜母細胞瘤是原發于視網膜的惡性腫瘤，常見于兒童的眼部腫瘤?；颊甙搭愋涂煞譃榉沁z傳型和遺傳型兩種，非遺傳型常見于單側發病，無遺傳性；遺傳型常見于雙眼發病，有陽性家族史，發病迅速，易轉移惡化導致死亡[12]。目前對miR-200b在視網膜母細胞瘤組織和細胞中的表達情況報道較少，DADS在視網膜母細胞瘤中的抑制作用和內在機制的研究亦不深入。本研究從miR-200b的角度揭示DADS抑制視網膜母細胞瘤生長及轉移的分子機制，為視網膜母細胞瘤的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 主要材料 人視網膜母細胞瘤Y79細胞；Lipofectamine 2000購于美國Invitrogen公司；MTT試劑盒購于美國Sigma公司；Transwell小室購于美國BD公司；miR-200b mimics、miR-200b inhibitor和scramble購于丹麥Exiqon公司；RNA抽提試劑盒購于美國Applied Biosystems公司；TIMP3和β-actin抗體購于美國Santa Cruz公司。

1.2 qRT-PCR 適量人視網膜母細胞瘤標本和癌旁正常組織，抽提組織中總RNA，逆轉錄合成cDNA，并保存于-80°C中備用。采用六種濃度的DADS(0μmol/L、25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L和400μmol/L)分別處理Y79細胞，48 h后收集每組細胞，提取總RNA。miR-200b(正向)5′-CGCAGCTACATCTGGCTACTG-3′，miR-200b(反向) 5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；U6(正向)5′-GCGCG TCGTGAAGCGTTC-3′，U6(反向)5′-GTGCAGGGTC CGAGGT-3′。PCR體外擴增反應體系為20 μl，包括Taq DNA polymerase 0.2 μl(5 U/μl)，PCR primers 0.4 μl (5 μmol/L)，2×SYBR Mix 10 μl，RT product 2.0 μl及滅菌蒸餾水7.4 μl。循環體系為：96°C 3min，96°C 15 s，65°C、35 s，73°C、30 s，共計38個循環，以U6為內參，測得的miR-200b相對表達量用2-ΔΔCT法來進行分析。

1.3 MTT法 實驗共分五組：(1)miRNA陰性對照組(瞬時轉染scramble 40 μmol/L)；(2)miR-200b組（瞬時轉染miR-200b-mimics 40 μmol/L)；(3)DADS陰性對照組(DMSO 10 μmol/L)(即mock組)；(4)DADS組(DADS 200 μmol/L)；(5)DADS+miR-200b組(瞬時共轉染miR-200b-mimics 40 μmol/L)和DADS(200 μ mol/L)，將轉染后的Y79細胞接種于96孔板，每組設置5個復孔，細胞培養臨近飽和時，在每孔加入滅菌MTT液20 μl(5 mg/ml)，在孵育4 h后取出，向每孔中加入150 μl DMSO，低速振蕩10 min，隨后選擇570 nm波長，于酶標儀上測定各孔的吸光值并記錄結果，每組實驗重復3次。

1.4 Transwell侵襲實驗 細胞分組同MTT法，鋪適量基質膠稀釋液到Transwell小室，過夜成膜，取100 μl(1×105cells/ml)細胞稀釋液接種于Transwell小室的上腔，下腔中加入500 μl含10%胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培養液，放置于37℃、5%CO2細胞培養箱中，36 h后取出，將小室上層細胞用棉簽擦棄，磷酸鹽緩沖液(PBS)輕洗，4%多聚甲醛固定，結晶祡染色，PBS輕洗，倒置并晾干。光學顯微鏡下觀察，攝像，隨機選取4個高倍視野進行細胞計數，取平均值，每組重復3次。

1.5 統計學方法 應用SPSS16.0軟件進行統計學分析，計量資料以均數±標準差(±s)表示，兩兩間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 DADS對Y79細胞miR-200b表達的影響 采用六種濃度的DADS(0μmol/L、25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L和400μmol/L)分別處理Y79細胞，48 h后收集每組細胞，提取總RNA。qRT-PCR結果顯示：與對照組(DADS 0μmol/L)視網膜母細胞瘤細胞Y79中miR-200b的表達量(0.758±0.125)比較，隨DADS劑量的增加miR-200b的表達量逐漸上調。DADS濃度不同(25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L和400μmol/L)時，miR-200b的表達量分別為(0.811±0.275)、(1.573±0.101)、(1.956±0.273)、(2.341±0.218)和(2.824±0.242)，差異具統計學意義(P＜0.05)，即DADS可上調Y79細胞中miR-200b的表達，且其呈劑量依賴性。

2.2 DADS通過上調miR-200b抑制Y79細胞增殖 實驗分組如方法中所述，在轉染48 h后，各組分別與其對應陰性對照組比較。MTT實驗結果顯示miR-200b組的OD值(0.549±0.057)較miRNA陰性對照組(0.737±0.135)明顯降低；DADS組的OD值(0.508±0.064)較DADS陰性對照組(0.722±0.145)明顯降低；而DADS+miR-200b組的OD值(0.362±0.081)較miRNA陰性對照組(0.737±0.135)和DADS陰性對照組(0.722±0.145)降低最為顯著。差異均具有統計學意義(P＜0.05)，即DADS可以通過上調miR-200b抑制Y79細胞的增殖能力。

2.3 DADS通過上調miR-200b抑制Y79細胞侵襲 實驗分組如方法中所述，在轉染48 h后，各組分別與其對應陰性對照組比較。Transwell侵襲實驗結果顯示，轉染miR-200b組的Y79的穿膜細胞數(105±13)較miRNA陰性對照組(162±12)明顯降低；DADS組的細胞穿膜數(102±13)較DADS陰性對照組(154±8)明顯減少；且DADS+miR-200b組的細胞穿膜數(77±8)較miRNA陰性對照組(162±12)和DADS陰性對照組(154±8)減少最顯著。差異均具有統計學意義(P＜0.05)，即DADS通過上調miR-200b抑制Y79細胞侵襲。

3 討 論

視網膜母細胞瘤常發病于五歲以下的兒童，常常由于患者年齡過小，自我辨別能力較弱，大多患兒就診時實際已發生侵襲或轉移，此時的治療效果常常是有限的，甚至會導致死亡[13]。臨床上常用的治療方法有眼球摘除手術、放射或化學治療、光凝固治療等[14]。傳統治療方法除可能存在較大毒副反應，治療效果也常常是有限的，且眼球摘除手術造成的視力永久性失去是無法恢復的。因此，針對視網膜母細胞瘤的新的抗癌藥物的研發與探索也成為了當務之急。

DADS對胃癌、乳腺癌及結腸癌等多種腫瘤具有抑制作用[3-5]。本研究筆者從miR-200b的層面來探討DADS的抑瘤機制。首先我們用不同濃度的DADS處理視網膜母細胞瘤細胞Y79，提取總RNA后檢測miR-200b的表達量，結果顯示隨著DADS劑量的增加，miR-200b的表達量呈梯度式上調。說明DADS可上調Y79細胞中miR-200b的表達水平且與劑量呈依賴性關系。隨后，我們采用MTT實驗探索Y79細胞的增殖能力，DADS處理后，Y79細胞的增殖能力明顯降低，且miR-200b和DADS共同處理后細胞的增殖能力降低最為顯著，說明DADS能夠通過上調調miR-200b從而抑制Y79細胞的增殖。最后，我們也采用Transwell侵襲實驗來檢測Y79的穿膜能力，DADS處理后細胞穿膜數明顯減少，miR-200b和DADS共同處理后Y79的穿膜數減少最顯著，說明DADS能夠通過上調miR-200b來抑制Y79細胞的侵襲。證實DADS可通過上調miR-200b的表達水平抑制視網膜母細胞瘤細胞的生長及侵襲。

本次研究從miRNA-200b層面來探討DADS在視網膜母細胞瘤中的抑瘤機制，證實DADS可通過上調miR-200b的表達抑制視網膜母細胞瘤的生長及侵襲，即DADS可潛在的靶向miR-200b治療視網膜母細胞瘤，為視網膜母細胞瘤的防治提供了新的思路，也進一步闡明了miR-200b和DADS在視網膜母細胞瘤可能的生物學功能。

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Suppression of diallyl disulfide on the proliferation and invasion of retinoblastoma cells by up-regulating miR-200b.

LIU Yue-feng1,ZHANG Yong1,ZHONG Xiao-dong1,LUO Wei-min2.Department of Ophthalmology1, Department of Cardiothoracic Surgery2,the Affiliated Hospital of Hubei University of Medicine,Shiyan 442000,Hubei, CHINA

Objective To explore the internal molecular mechanisms related to miR-200b for the suppressing effect of diallyl disulfide(DADS)on the proliferation and invasion of retinoblastoma cells.MethodsThe expression of miR-200b regulated by different dose of DADS(0μmol/L,25μmol/L,50μmol/L,100μmol/L,200μmol/L and 400μmol/L)in Y79 cells was detected by quantitative real time polymerase chain reaction(qRT-PCR).The proliferation and invasion ability of Y79 cells in vitro regulated by miR-200b and DADS were assessed by MTT and Transwell invasion assays,with five groups set up∶miRNA-negative control group(transient transfection with scramble 40 μmol/L);miR-200b group(transient transfection with miR-200b-mimics 40 μmol/L);DADS-negative control group(mock group,DMSO 40 μmol/L);DADS group(DADS 200 μmol/L)and DADS+miR-200b group(transient transfection with both miR-200b-mimics 40 μmol/L and DADS 200 μmol/L).ResultsmiR-200b expression was increased with the increase of the doses of DADS,in a dose-dependent manner(P＜0.05).For MTT,the OD value was significantly lower in miR-200b group than miRNA-negative control group[(0.549±0.057)vs(0.737±0.135)],in DADS group than DADS-negative control group[(0.508±0.064)vs(0.722±0.145)],and the OD value in DADS+miR-200b group was the lowest[(0.362±0.081)].The differences were all statistically significant(P＜0.05).The results indicate that DADS could inhibit the proliferation capacity of Y79 cells by increasing the expression of miR-200b.In Transwell invasion assays,the number of cells penetrating membrane was significantly less in miR-200b group than miRNA-negative control group[(105±13)vs(162±12)],in DADS group than DADS-negative control group[(102±13)vs(154±8)],and the number in DADS+miR-200b group was the lowest[(77±8)].The differences were all statistically significant (P＜0.05).The results indicate that DADS could inhibit the invasion capacity of Y79 cells by increasing the expression of miR-200b.ConclusionDADS can suppress the proliferation and invasion of human retinoblastoma cells by up-regulation of miR-200b.

Retinoblastoma;MiR-200b;Diallyl disulfide(DADS);Proliferation;Invasion

R739.7

A

1003—6350（2016）03—0351—03

2015-09-11)

湖北省教育廳科學研究計劃指導性項目(編號：B2015477)；湖北省十堰市科技課題(編號：14Y40)

羅衛民。E-mail:luoweimin0803@sina.com