發光細菌及其在環境、食品和飼料檢測中的應用

廖德豐

(譜尼測試集團上海有限公司 200030)

1 發光菌發光機理、發光特性、影響因素和發光基因

1.1 發光機理 發光菌能夠以長鏈脂肪醛(LE)、分子氧和還原型黃素單核苷酸(FMNH2)為底物，在熒光素酶的催化作用下，產生波長約為450～490 nm藍綠光。反應過程如下：FMNH2+LE→FMNH2·LE+O2→LE·FMNH2·O2+RCHO→LE·FMNH2·O2·RCHO→LE·FMN+H2O+RCOOH+光，其中三步反應產生的三種中間產物的壽命極短，很難分離出來。發光細菌發出的光是一種化學發光,是化學能以光輻射的方式的釋放。發光細菌細胞內含有熒光素和熒光素酶,熒光素受到熒光素酶的催化作用而吸收能量,變成氧化型激發態熒光素，隨即退激發射光子而發光。熒光素酶是生物體內催化熒光素或脂肪醛氧化發光的一類酶，細菌熒光素酶是含α、β兩個多肽亞基的單加氧酶，只有兩個亞基共存時才有活性。從不同海洋細菌中提取的熒光素酶的分子量差別不大。

1.2 發光特性 不同種類的發光菌有不同的熒光素酶,發光特性也不同。以最大發射波長來說,弧菌屬為482～485 nm,發光桿菌屬則在474～480 nm。其中費氏弧菌最大發射波長為482 nm，東方弧菌最大發射波長為(484±1) nm,半峰全寬為(92±1) nm，青?；【畲蟀l射波長為485 nm，明亮發光桿菌最大發射波長為475 nm左右。朱文杰等從東方弧菌的細胞裂解液中分離到一種組分,僅需長鏈脂肪醛就可以啟動發光,其最大發射峰在480～490 nm。提取物的吸收光譜顯示在414 nm處有一最大吸收峰,在380 nm和485 nm處各有一個弱吸收峰;提取物與醛反應后，吸收光譜除380 nm峰消失外,其余不變。汪杰等[1]檢測了明亮發光桿菌、鰏魚發光桿菌、哈維氏弧菌和青?；【锇l光的一階和二階微分光譜。結果表明，不同種的發光細菌的微分光譜有顯著差異，同一種菌的不同菌株無顯著差異，提示生物發光光譜可作為發光細菌菌種分類的特征。

1.3 影響因素 發光菌的發光強度與細胞的代謝活性直接相關，環境因素會影響發光菌的生長和發光。杜宗軍等從青島近海海洋沉積物中分離出一株海洋發光菌——弧菌屬的哈維氏發光弧菌，該菌在pH7. 5、溫度30℃、氯化鈉濃度3.0%時,發光強度最高;正常發光的溫度在20℃～40℃、pH6.0～8.0; 液體培養4 h后開始發光, 6 h后發光達到峰值,持續發光時間可達19 h。水體的pH、溫度、鹽度和營養成分等環境條件的變化將引起熒光素酶的改變,從而改變細菌的發光特性。方宏達等分離到一株海洋發光弧菌，它在35℃、pH7.0、氯化鈉濃度2.0%時生長最好，在20℃、pH5～6、氯化鈉濃度3.0%、細菌密度OD600達0.08時發光強度最高。當發光弧菌的密度OD600達到0.08時，發光強度有一個突發式的增強過程，這個現象表明這些菌的發光可能受到細菌密度感應系統的調控。密度感應是細菌感受種群密度的變化而控制特定基因表達的一種機制。自由生活的哈維氏弧菌可以利用密度感應系統來控制發光。

青?；【纳L受甘油影響最大，發光受氮源影響最大，其生長和發光不同步，發光強度到對數中期才迅速增加，并在對數后期達到頂峰，然后很快下降。由此看來，青?；【鸁晒饷傅暮铣蓪儆谡T導型。甘油和少量氯化鈉有利于青?；【纳L和發光。在許多方面環境因子對青?；【纳L和發光的影響與海洋發光菌中誘導型發光型相似，可能的原因是它們的受影響機制相似，但在鹽度、溫度和pH等方面，青?；【c海洋發光菌不同，青?；【m宜的溫度和pH范圍比海洋發光菌寬，對氯化鈉的要求很低，可能是因為它們長期適應于不同的環境。

發光細菌的發光強度在一定實驗條件下是恒定的，當發光菌接觸外來物質時，發光強度改變。有毒物質會使發光菌細胞的代謝活性下降，發光強度下降，因此發光菌發光強度的變化能夠準確、快速地反映外來物質的毒性。

1.4 發光基因 目前對發光菌的研究已經達到基因水平，細菌發光是其發光基因及其操縱子表達調控的結果。發光細菌發光離不開熒光素酶，研究發現,編碼熒光素酶的基因是luxA和luxB。發光基因包括結構基因luxC、luxD、luxA、luxB、luxE(為在操縱子上的排列順序)和調節基因luxI和luxR等，luxC和luxD位于luxA和luxB基因的上游一側，luxE基因位于luxA和luxB基因的下游一側。luxC、luxD、luxA、luxB和luxE這5個結構基因存在于已知的所有發光細菌中。在lux操縱子中，luxA和luxB是緊密相連的。例如，哈維氏弧菌的luxA基因中含有1065個堿基對(bp)，編碼的熒光酶α亞基是355個氨基酸組成的多肽，分子量為40 kD；luxB基因中含有972 bp，編碼的熒光酶β亞基是324個氨基酸組成的多肽，分子量為36 kD，由α、β兩亞基組成的熒光酶的分子量為76 kD。luxC和luxD分別編碼脂肪酸還原酶和多肽轉移酶，luxE編碼合成酶。luxC含有1431 bp，編碼含有477個氨基酸的蛋白質，分子量為55 kD；luxD編碼分子量為33 kD的蛋白質；luxE編碼分子量為42 kD的蛋白質。發光細菌發光基因的種類和數量因發光細菌的種類而異。例如，luxF僅發現于明亮發光桿菌。已經發現哈維氏弧菌有3個平行密度感應系統來控制熒光素酶的結構操縱子的密度依賴性表達，每個系統都由傳感器和相應的自誘導分子組成。

王妍穩等[2]將luxA和luxB克隆到表達載體PHSG396中,轉化大腸桿菌Top10,實現重組質粒在大腸桿菌中的表達。羅愛紅等[3]將青?；【鶴67熒光素酶基因luxA和luxB和結構基因luxC、luxD、luxA、luxB、luxE分別在大腸桿菌中表達，在相同培養條件下,luxA和luxB重組菌比luxA、luxB、luxC、luxD、luxE重組菌獲得更大的相對發光強度,說明luxA和luxB重組菌表達效果更好。重金屬Cd2+、Hg2+和Cr6+對重組菌的毒性影響檢測表明,luxA和luxB重組菌得到了更低的半有效濃度(EC50)。魏永濤通過三親本雜交的方法將標記基因luxA和luxB接合轉移進熒光假單胞CP1108菌株，所得的標記菌株CP1108L具有發光活性，轉移頻率為(4.65±0.01)×105。將標記菌株連續進行20 次傳代，各代菌株均可檢測到發光現象。

luxI編碼發光細菌自誘導物因子合成酶，luxR編碼發光系統的調節蛋白。luxI和luxR基因的表達產物都是lux系統完整表達并產生發光的調節物質，任何一個基因的有效突變都會改變lux系統的表達水平，甚至使發光細菌變為暗變種。

2 發光細菌在環境、食品和飼料檢測中的應用

2.1 環境檢測 利用發光細菌的發光強度作為指標來監測環境中的有毒物質，在國內外越來越受到重視，發光細菌法已經廣泛用于環境中的重金屬、抗生素、農藥等檢測，可分析空氣、土壤和水等樣品。汽車尾氣、香煙煙霧和氨氣等對細菌發光有不同程度的抑制作用，時間和劑量效應明顯。吳淑杭等[4]以明亮發光桿菌T3變種作為測試菌，發現單一重金屬Hg2+、Cd2+與 Cr6+對明亮發光桿菌的毒性有顯著的正效應,毒性從大至小依次為Hg2+、Cd2+和Cr6+,對明亮發光桿菌的EC50分別為0.044 mg/L、6.05 mg/L和30.65 mg/L，總體上, Hg2+與Cd2+以及Cd2+與Cr6+之間為加和作用,而Hg2+與Cr6+之間以拮抗作用為主。研究發現，明亮發光桿菌T3的相對發光率與硝酸鹽、氟化物和敵百蟲的濃度呈負相關,其相關系數為-0.90～-0.99。硝酸鹽、氟化物和敵百蟲作用15 min時使發光細菌產生50%光損失時的濃度(EC5015 min值)分別為2210.00 mg/L、245.2 mg/L和8880.28 mg/L。

抗生素和農藥廣泛用于農業生產中，污染問題引起廣泛的關注。朱祥偉等[5]以毒物對青?；【鶴67發光抑制為毒性指標，測定了吡蟲啉(IMI)、抗蚜威(PIR)、啶蟲脒(ACE)及敵百蟲(DIP) 4種殺蟲劑和氯霉素(CHL)、鹽酸四環素(TET)、硫酸鏈霉素(STR)及硫酸巴龍霉素(PAR) 4種抗生素的短期(15 min)毒性和長期(12 h)毒性。采用短期毒性與長期毒性EC50之比為指標，表征同一物質的毒性差異。結果表明：3種殺蟲劑(IMI、ACE和PIR)的短期毒性與長期毒性差異不大；殺蟲劑DIP和抗生素CHL及TET的短期毒性與長期毒性差異明顯；抗生素STR和PAR只有較強的長期毒性。楊潔等[6]采用青?；【鶴67 作為測試菌劑,作用時間為15 min。結果表明，5種可溶農藥對青?；【鶴67的毒性從高到低依次為敵敵畏、敵百蟲、殺蟲單、樂果、乙酰甲胺磷；6種難溶于水農藥的毒性從高到低依次為甲氨基阿維菌素、甲胺磷、莎稗磷、高效氯氰菊酯、惡霜靈、氰戊菊酯。中國科學院南京土壤研究所研制出GXY-2型生物毒性測定儀，已經有學者將此儀器和明亮發光桿菌用于評價工業廢水和重金屬污染土壤的毒性。

在水質分析中,應用浮游生物、藻類和魚類等水生生物進行毒性檢測所需時間長、費用高,而發光菌毒性檢測法具有靈敏度高、相關性好、反應速度快、成本低廉、自動化程度高等優點。謝海平等[7]分別利用從發光魚肉中分離得到的一株鰒發光桿菌N1株和美國Microtox急性毒性檢測系統,對珠江陸源入海排污口污水進行了急性毒性對比測試。結果表明,利用鰒發光桿菌N1株的急性毒性測試結果和美國Microtox毒性檢測系統的急性毒性測試結果有較好的相關性;依據毒性大小進行排序,珠江陸源入海排污口9個監測站位污水的急性毒性測試數據中，有6個監測站位的排序結果在兩種測試間相一致。

2.2 食品檢測 食品安全已成為社會普遍關注的問題。在檢測不明毒性物質的情況下,發光菌法檢測比化學分析或儀器法檢測,在檢測速度、操作的便捷程度和綜合性評價上更具優勢。

食品中過量食品添加劑會危害人體健康，發光菌法已經用于檢測食品添加劑。郭柔杉等[8]將發光菌法應用于果汁中亞硝酸鈉綜合毒性的檢驗，發現其發光強度抑制率與亞硝酸鈉溶液質量濃度呈正相關,相關系數為0.9533～0.9573,最佳檢測平衡時間為15 min,誤差限范圍為0.6150～2.3466;發光強度抑制率與果汁中亞硝酸鈉質量濃度同樣呈正相關,相關系數為0.9555～0.9970,最佳檢測平衡時間為15 min,誤差限范圍為0.0852～2.4483。郭柔杉等[9]利用發光費氏弧菌評價常用色素毒性，發現色素溶液質量濃度與發光抑制率呈正相關,相關系數在0.8760～0.9873之間,EC50范圍在0.72～2.86 mg/L之間; 果汁中色素質量濃度與發光抑制率呈正相關,相關系數在0.9136～0.9951之間,EC50值在1.02～2.96 mg/L之間。

食品中抗生素、獸藥和農藥殘留是食品安全關注的重點問題。發光菌法測定食品中抗生素、獸藥和農藥殘留具有快速、簡單和價廉等特點。朱金國等[10]利用明亮發光桿菌建立了發光細菌檢測四環素族抗生素體系。結果表明，當金霉素、土霉素和四環素濃度在0.00625～1 μg/mL范圍內，發光菌發光強度的抑制與這些抗生素的濃度均呈良好的線性關系；該體系對四環素族抗生素的檢測靈敏度可達 0.00625μg/mL,比傳統的杯碟法高5倍，具有快速、簡便的特點。王亞群等[11]從青島近海分離篩選出1株對氯霉素敏感的鰒發光桿菌，發現氯霉素濃度與細菌發光強度抑制率呈良好的線性關系。該方法的線性范圍為0.1～1.0 ng/mL,相關系數R2為0.989,檢測靈敏度可以達到0.1 ng/mL。石穎等[15]發現恩諾沙星、環丙沙星、左氧氟沙星、沙拉沙星、諾氟沙星濃度分別為20～2000 mg/L、100～10000 mg/L、20～200 mg/L、10～1000 mg/L和10～1000 mg/L時,青?；【南鄬Πl光率隨這些獸藥質量濃度的降低而增加;暴露時間為15 min時,8種獸藥對青?；【募毙远拘源笮∫来螢檫秽蛲?左氧氟沙星>諾氟沙星>磺胺六甲氧嘧啶鈉>沙拉沙星>恩諾沙星>環丙沙星>磺胺間甲氧嘧啶納，毒性最強的呋喃唑酮的EC50值不足毒性最小的磺胺間甲氧嘧啶納的EC50值1/1000，這與農業部235號公告規定的禁止呋喃唑酮用于所有動物性食品中相吻合。吳淑杭初步建立了青?；【?、明亮發光桿菌T3變種發光細菌法農產品食用安全性快速評價體系，包括發光細菌法牛奶、鮮豬肉和牛肉食用安全性快速評價方法。另據報道，GXY-2生物毒性測定儀和明亮發光桿菌已經用于快速檢測蔬菜有機磷農藥殘留。

發光菌法可以快速檢測飲用水綜合毒性。王曉媛等[13]報道采用以青?；【鶴67為檢測試劑的水質毒性檢測系統對汶川地震災區居民126個飲用水源進行急性毒性的測定，同時與當地檢測部門的理化檢測指標進行對比，結果表明，現場急性綜合毒性快速檢測在這次突發事件中起到了樣品的毒性快速初篩的作用，在很大程度上及時保證了當地居民的飲水安全，并大大減輕當地疾控人員工作負擔。

2.3 飼料檢測 發光菌法不但可以用于食品檢測，而且可以用于飼料檢測。陳俏梅等[14]發現發光菌對苯酚、滅害靈和Pb2+、Zn2+、Cr+金屬離子敏感。在所測定的范圍內 ,其發光強度隨有毒物質濃度增加而減弱，相關系數在0.92以上；以Hg2 +為毒性對照物；對10種飼料原料和3種人用食品進行測定，其中脫水蔬菜相對抑光率最大，為 39.74%，相當于1.85×10-5% Hg2 +的表征毒性 ,提示該樣品可能受到農藥和化肥等較嚴重的污染。研究結果表明鹽酸金霉素、吉他霉素、鹽霉素、黃霉素對明亮發光桿菌的急性毒性EC50分別為9.21mg/L、146.13mg/L、4.24 mg/L和134.68 mg/L；發光細菌的相對發光強度隨著這些抗生素濃度的增加而降低,并分別在2～16 mg/L、25～200 mg/L、1～8 mg/L和25～200 mg/L范圍內呈良好線性關系。