己酮可可堿對重癥急性胰腺炎大鼠腸黏膜微循環影響的實驗研究

王冬　李勇　徐保利　趙群　范立僑　張志棟　檀碧波　崔平

050011　石家莊市，河北醫科大學第四醫院外三科(王冬、李勇、徐保利、趙群、范立僑、張志棟、檀碧波)；河北省人民醫院醫務處(崔平)

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·論著·

己酮可可堿對重癥急性胰腺炎大鼠腸黏膜微循環影響的實驗研究

王冬李勇徐保利趙群范立僑張志棟檀碧波崔平

050011石家莊市，河北醫科大學第四醫院外三科(王冬、李勇、徐保利、趙群、范立僑、張志棟、檀碧波)；河北省人民醫院醫務處(崔平)

【摘要】目的討己酮可可堿對重癥急性胰腺炎(Severe Acute Pancreatitis,SAP)大鼠腸黏膜微循環的影響及意義。方法SD大鼠96只隨機分為假手術(SO)組、胰腺炎(SAP)組、己酮可可堿(PTX)治療組。建立大鼠SAP模型。3組于2、6、12、24 h 4個時相觀察腹水量及胰腺病理變化、腸黏膜微血管管徑、流速。檢測3組血漿內毒素(LPS)和血清淀粉酶(AMY)、脂肪酶(LIP)水平。結果腹水量、胰腺病理評分各時相SAP組與SO組差異有統計學意義(P<0.05)；PTX組與SAP組相比各指標變化程度較小(P<0.05)。SAP組、PTX組與SO組比較，腸黏膜微血管管徑減小、血流速度減慢(P<0.05)。SAP組、PTX組LPS、AMY、LIP水平明顯高于SO組(P<0.05)；PTX組血液指標均低于SAP組(P<0.05)。結論己酮可可堿可有效改善SAP時腸黏膜的微循環。

【關鍵詞】重癥急性胰腺炎；腸損傷；微循環；己酮可可堿；大鼠

急性重癥胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)病情兇險、預后差[1,2]。SAP發生時患者出現的胰腺外臟器損傷是導致患者死亡的重要原因。在這些臟器中，腸黏膜損傷造成的危害不容忽視[3,4]。腸道是人體最大的細菌庫，SAP時往往伴有腸屏障功能障礙。SAP時發生腸黏膜水腫,腸黏膜上皮細胞凋亡數量增加、上皮細胞間的緊密連接遭到破壞,腸絨毛的高度降低,由于腸系膜血管收縮導致腸系膜血管血流量減少,嚴重者甚至出現黏膜潰瘍、壞死，導致腸屏障功能喪失。屏障功能喪失導致腸道菌群移位和腸源性內毒素血癥，這種感染對機體造成第二次打擊(second attack)，引起的全身毒素吸收使腸黏膜的微循環遭到破壞，通透性增高，大量細菌移位，加重全身炎性反應綜合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS)，最終引發患者多器官障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)，導致患者死亡。因而在SAP發生時積極保護腸黏膜、改善腸黏膜微循環對減輕感染、緩解病情、最終對減輕SAP綜合癥狀、改善SAP治療效果有重要意義，而在這方面的研究筆者還未發現有突破性進展。本研究應用己酮可可堿(pentoxifylline,PTX)對SAP大鼠進行干預，檢測PTX對腸黏膜微循環的影響，了解PTX對緩解SAP的作用及機制，為SAP治療措施的改進提供實驗依據。

1材料與方法

1.1實驗動物SD雄性大鼠96只購于河北醫科大學動物學部，體重(330±30)g，鼠齡約9周。動物在SPF環境下常規飼養：溫度為(23±1)℃；濕度為40%～60%；光照時間早7∶00至晚7∶00；采用新鮮干燥滅菌飼料。96只SD大鼠隨機分為假手術(SO)組、SAP組和PTX組，每組32只。每組按時間分為2、6、12、24 h組，每組8只。

1.2主要試劑及儀器牛黃膽酸鈉購自包頭化學制品廠，使用前以0.9%氯化鈉注射液配至濃度為3%。PTX購自山東益健藥業公司。鱟試劑購自湛江海洋生物制品公司。淀粉酶(AMY)、脂肪酶(LIP)試劑盒購自德國Lidman公司。WS-9B型微循環顯微鏡及視圖像分析系統、WS恒溫、恒濕灌流系統均為徐州光學儀器廠產品。COBAS MIRA 全自動生化分析儀為瑞士產品。

1.3大鼠模型制備

1.3.1SAP組：SAP模型參照本課題組前期動物造模方法制備SAP模型[5]，胰膽管內插管給予5%牛黃膽酸鈉，觀察胰腺出現水腫、出血、壞死等改變以確定造模成功。制模成功后給予頸靜脈置管經頸靜脈微量注藥泵補液。

1.3.2SO組：開腹后僅翻動胰腺及其他腹腔器官，不做胰膽管內插管給藥，其余各項操作及補液均同SAP組。

1.3.3PTX治療組：制備SAP模型成功后關腹，用微量注藥泵經頸靜脈給予各組動物0.9%氯化鈉注射液補液。PTX治療組于術后0.5 h經頸靜脈給予PTX3 mg/100 g，后按2 mg·100 g-1·h-1維持。

1.4微循環觀察窗的制備取各時相SD大鼠模型，麻醉后取正中切口，找到盲腸近側4～5 cm回腸，提出此段回腸，置于恒溫、恒濕、灌流系統中，沿對系膜緣無血管區縱行剖開腸壁3 cm，暴露腸黏膜，0.9%氯化鈉注射液沖凈并置于觀測窗上。在落射鹵素燈光源照射下以布氏顯微鏡觀察腸黏膜微循環變化，并進行分析。

1.5微循環指標檢測方法(1)用微循環圖像分析軟件對微血管口徑直接測量(μm)；(2)微循環圖像分析軟件采用光點同步法對微血管血流速度直接測定(μm/s)；(3)血液相關指標檢測：采用鱟試劑法對大鼠血漿LPS的水平進行測定；瑞士COBAS MIRA 全自動生化分析儀對大鼠血清AMY、LIP進行測定。

1.6檢測指標(1)記錄3組各時相大鼠腹水量；(2)觀察胰腺大體改變及病理變化，計算胰腺病理評分；(3)檢測3組各時相大鼠觀察毛細血管口徑、血液流速；微血管出血變化。

2結果

2.13組腹水量變化情況SO組各時相腹腔內偶見少量清亮腹水，均無法計量；SAP組各時相腹腔內均有淡紅色或暗紅色混濁腹水(5～17 ml)，明顯比SO組增多(P<0.05)。PTX組較SAP組各時相腹水量均有明顯減少(P<0.05)。見表1。

表13組不同時相點腹水量比較

組別2h6h12h24hSO組0000SAP組5.16±1.30*9.07±1.55*12.68±2.00*15.46±2.02*PTX組3.86±1.00*#6.56±2.06*#8.85±1.71*#11.40±1.89*#

注：與SO組比較，*P<0.05；與SAP組比較，#P<0.05

2.23組胰腺變化

2.2.1胰腺大體變化：SO組各時相偶見胰腺輕度水腫，無其他明顯改變；SAP組各時相可見胰腺不同程度水腫、充血、灰褐色壞死灶、胰周脂肪散在皂化，且隨時間延長，出血、壞死程度加重；PTX組胰腺存在水腫、出血及壞死現象，但程度比SAP組輕微。

2.2.23組胰腺病理評分： SAP各時相病理評分明顯高于SO組(P<0.05)。PTX組較SAP組各時相評分均有明顯降低(P<0.05)。見表2。

2.33組微血管管徑變化情況

2.3.1微動脈管徑觀察：SAP組、PTX組微動脈管徑各時相點均小于SO組(P<0.05)，PTX組的微動脈管徑明顯小于SAP組(P<0.05)。見表3。

表2　3組不同時相胰腺病理評分比較　n=8,分,±s

注：與SO組比較，*P<0.05；與SAP組比較，#P<0.05

表33組不同時相微動脈管徑比較

組別2h6h12h24hSO組12.2±1.512.1±1.711.8±1.412.2±1.5SAP組6.1±1.0*7.17±1.05*5.9±0.4*5.8±0.4*PTX組10.2±1.3*#10.0±1.2*#9.8±1.2*#9.4±1.3*#

注：與SO組比較，*P<0.05；與SAP組比較，#P<0.05

2.3.2微靜脈管徑觀察：SAP組、PTX組微靜脈管徑各時相點均小于SO組(P<0.05)，PTX組的微靜脈管徑明顯小于SAP組(P<0.05)。見表4。

表43組不同時相微靜脈管徑的情況

組別2h6h12h24hSO組22.8±2.323.0±2.323.2±2.822.8±2.4SAP組10.4±1.2*12.4±1.8*10.0±1.1*9.3±1.0*PTX組17.5±1.8*#17.8±2.0*#17.4±2.1*#18.4±2.0*#

注：與SO組比較，*P<0.05；與SAP組比較，#P<0.05

2.43組微血管血流速度變化情況

2.4.1微動脈血流速度測定結果：SAP組、PTX組微動脈血流速度各時相點均比SO組緩慢(P<0.05)，但PTX組的微動脈血流速度明顯比SAP組緩慢(P<0.05)。見表5。

表53組不同時相微動脈血流速度比較

組別2h6h12h24hSO組303.0±42.6291.9±35.5309.5±33.1300.2±26.1SAP組109.5±16.8*129.7±19.0*93.7±9.7*89.7±10.4*PTX組219.5±31.6*#226.0±36.3*#223.4±31.5*#214.8±25.7*#

注：與SO組比較，*P<0.05；與SAP組比較，#P<0.05

2.4.2微靜脈血流速測定結果：AP組、PTX組微靜脈血流速度各時相點均比SO組緩慢(P<0.05)，但PTX組的微靜脈血流速度明顯比SAP組緩慢(P<0.05)。見表6。

表63組不同時相微靜脈血流速度比較

組別2h6h12h24hSO組274.2±28.7268.0±28.5270.8±25.7272.6±25.0SAP組99.0±12.7*113.6±13.0*98.5±12.7*84.6±10.6*PTX組211.1±27.1*#218.4±24.7*#215.3±28.4*#207.0±28.9*#

注：與SO組比較，*P<0.05；與SAP組比較，#P<0.05

2.53組血液相關指標比較SAP組各時相LPS、AMY、LIP水平均明顯高于SO組(P<0.05)，且隨時間延長LPS水平逐漸升高(P<0.05)；而SO組LPS、AMY、LIP各時相水平變化不明顯(P>0.05)。PTX組LPS、AMY、LIP水平明顯低于同時點SAP組，但仍高于SO組(P<0.05)。見表7～9。

3討論

經多年研究，藥物(如生長抑素類)及綜合治療不斷進步，目前輕癥胰腺炎的死亡風險已大大降低，預后良好。另有少數重者的胰腺出血壞死，常繼發感染、腹膜炎和休克等，病死率高，稱為SAP。這些患者仍然預后較差，即使經過積極治療，SAP的病死率仍高達20%～50%，對健康危害極大[5]。SAP雖原發病灶在胰腺，但其損傷是全身性的[6]。胰腺外器官損傷包括肺、肝、心臟、腎臟、腸道的損傷，這些臟器的損傷及功能障礙往往造成嚴重后果，甚至導致患者死亡。因此，在當前胰腺炎的研究中，減輕胰腺外器官損傷已成為胰腺炎綜合治療的重要內容。如能有效控制SAP時的胰腺外臟器損傷，可明顯緩解病情，減低病死率，改善治療效果。在SAP胰腺外器官損傷中，腸黏膜損傷有獨特的特點。但SAP發生時，腸黏膜的微循環在全身炎性反應的影響下出現障礙，導致腸黏膜屏障功能喪失，腸道細菌發生移位，使炎性反應進一步加重，最終導致MODS，患者死亡[7,8]。在急性胰腺炎尤其是SAP發生后，由于全身的炎性反應，引起全身血管通透性增加，導致大量液體到達第三間隙，引起血容量降低，引起腸道及其他內臟血管收縮，導致腸道血液供應減少。同時在SAP發生時，機體處于應激狀態，無氧代謝增加，酸性代謝產物積聚，引起細胞內酸中毒，腸黏膜上皮細胞水腫、脫落、通透性增加，隨后隨著機體自身代償及實施相關治療措施后腸道血流的恢復，缺血再灌注通過白細胞的呼吸爆發、線粒體的細胞色素氧化酶功能異常等多種途徑生成大量氧自由基(OFR)。OFR可破壞 DNA，并促進中性粒細胞的黏附，引起腸黏膜更進一步的損傷。另外，多種炎性介質與細胞因子包括磷脂酶A2(phospholipase A2，PLA2)、一氧化氮(nitricoxide NO)、內皮素(endotllelin，ET)、血小板活化因子(platelet activating factor，PAF)等在腸屏障損害中發揮了重要作用。這些因子通過激活T細胞、B細胞，調節機體的免疫反應，刺激造血干細胞的增殖，使急性期反應蛋白合成及分泌增加、增強炎性反應的強度，損傷腸黏膜細胞，破壞腸黏膜屏障。但SAP發生時，患者由于長時間禁食、胃腸減壓等措施導致營養攝入不充分，加上此時機體處于應激、高代謝狀態，促使谷氨酰胺(glutamnie，Gln)、精氨酸的減少，導致巨噬細胞、淋巴細胞功能調節障礙。本研究發現，SAP大鼠的腸黏膜微血管在短時間內即發生明顯收縮，血流速度呈現先加速、后減速的趨勢，最終發生微血管出血，微循環障礙形成。這種微循環的障礙與腹水量增加有關，并可使胰腺病理狀態進一步惡化。本研究結果與牛天平等[9]的研究相符合。證實本研究成功建立了SAP模型并發生率腸屏障損害。這些結果提示采取措施改善SAP時腸道的微循環狀態對于腸黏膜局部功能及整體病情均有重要意義。

表73組不同時相血漿LPS水平

組別2h6h12h24hSO組48.8±3.448.4±4.947.4±4.747.5±4.0SAP組78.6±6.3*181.0±13.6*289.2±22.2*323.6±27.6*PTX組69.7±5.1*#118.57±12.1*#155.95±9.7*#202.1±18.6*#

注：與SO組比較，*P<0.05；與SAP組比較，#P<0.05

表83組不同時相血清AMY水平

組別2h6h12h24hSO組1133±1651190±1381119±1521164±178SAP組9631±865*16767±1404*16414±1467*15789±1080*PTX組5963±506*#7484±524*#8787±667*#7908±733*#

注：與SO組比較，*P<0.05；與SAP組比較，#P<0.05

表93組不同時相血清LIP水平

組別2h6h12h24hSO組324±34318±27309±27319±27SAP組5732±366*7404±507*7091±702*6796±522*PTX組3077±357*#3571±257*#4444±398*#4647±449*#

注：與SO組比較，*P<0.05；與SAP組比較，#P<0.05

PTX全稱為3，7-二氫-3，7-二甲基-1-(5-氧代己基)-1H-嘌呤-2，6-二酮，屬于甲基黃嘌呤衍生物，可以阻斷環磷酸腺苷(cAMP)轉變為AMP。PTX具有明顯的擴血管、抑制血小板聚集的作用，還能夠通過抑制免疫細胞活性、抑制炎性介質、阻斷細胞鈣內流、清除氧自由基等作用而減輕炎性反應、緩解機體的應激狀態[10,11]。邵洪波等[12]研究發現將PTX給予化學燒傷患者靜脈滴注，結果發現PTX可以有效改善創面的微循環，對化學燒傷有明顯減輕作用。關于PTX的作用機制，徐家麗等[13]研究發現PTX可通過調節腫瘤壞死因子-α(TNF-α)而影響VEGF表達，從而干預血管內皮細胞形成。PTX的這種作用可能也是其在腸黏膜中的作用機制。張慶富等[14]對高壓電燒傷大鼠進行研究，發現高壓電燒傷大鼠血管緊張素Ⅱ(Ang-Ⅱ)含量增高，引起微血管收縮；PTX可通過抑制Ang-Ⅱ表達而使腸系膜微血管舒張。這些研究為PTX的作用機制做出了一定的闡述。但目前關于PTX對于SAP時腸黏膜的作用還不清楚。本研究發現，PTX可以有效改善腸黏膜微循環狀態、減輕出血再灌注損傷，對腸黏膜屏障具有明顯的保護作用。進一步研究發現，PTX還可以明顯降低血液中LPS、AMY、LIP水平，這一作用對于緩解SAP的全身炎性反應有重要意義。

SAP雖原發于胰腺，但其造成的損害是全身性的，多種臟器在SAP時發生功能障礙。糾正休克，改善器官微循環及缺血再灌注損傷。對于SAP并發休克患者應積極補充血容量，改善微循環障礙，因此液體及藥物治療改善SAP患者的微循環狀態成為了在SAP綜合治療中不可忽視的核心治療環節之一。多種藥物對SAP微循環的改善效果并不令人滿意。本研究在新藥物改善SAP腸道微循環障礙方面開展了工作。結果發現PTX對于SAP時腸黏膜微循環有明顯的改善作用，是值得進一步研究并進行臨床推廣的藥物。其他研究者的相關研究報道很少，因此本研究具有較好的創新性。加之PTX毒副作用較小，具有很好的臨床推廣前景。但本研究只進行了大鼠動物實驗，具體的作用機制還不明確，且該藥物用于臨床對SAP患者腸黏膜作用如何也未涉及。這些內容在進一步的研究工作中應深入探討，同時在條件成熟時進行臨床應用，為SAP綜合治療水平的提高做出貢獻。

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Experimental study of the effects of pentoxifylline on microcirculation of intestinal mucosa in rats with severe acute panreatitis

WANGDong,LIYong,XUBaoli,etal.

DepartmentofGeneralSurgery,TheFourthHospitalofHebeiMedicalUniversity,HebeiShijiazhuang050011,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effects and significance of pentoxifylline (PTX) on microcirculation of intestinal mucosa in rats with severe acute panreatitis (SAP).MethodsA total of 96 SD rats were randomly divided into 3 groups: shame-operation (SO) group,SAP model group,PTX treatment group.After the animal models with SAP were established, the ascites amount, pancreatic pathological changes, micrangium caliber and velocity of intestinal mucosa were observed at 2h,6h,12h,24h after operation, moreover,the levels of plasma LPS,serum AMY and LIP were detected for the three groups.ResultsThere were significant differences in ascites amount, pancreatic pathological scores at the four time points between SAP group and SO group as well as between PTX group and SAP group (P<0.05).As compared with those in SO group, micrangium caliber and velocity of intestinal mucosa were significantly decreased in SAP group and PTX group (P<0.05).The levels of LPS,AMY,LIP in SAP and PTX group were significantly higher than those in SO group (P<0.05).ConclusionPTX can effectively improve microcirculation of intestinal mucosa in rats with SAP.

【Key words】severe acute pancreatitis；intestinal injury；microcirculation；pentoxifylline；rats

(收稿日期：2015-09-04)

【中圖分類號】R 576.1

【文獻標識碼】A

【文章編號】1002-7386(2016)06-0808-04

通訊作者：李勇，050011石家莊市，河北醫科大學第四醫院外三科；

doi:10.3969/j.issn.1002-7386.2016.06.002

E-maill：li_yong_hbth@126.com