雙氫青蒿素對實驗性小鼠肝纖維化的抑制作用

郭永澤　單鐵英　任海霞　蔡莉　李校天　王建華　劉曉東　崔星亮

056002　河北省邯鄲市，河北工程大學附屬醫院(郭永澤、任海霞、蔡莉、李校天、王建華、劉曉東、崔星亮)；河北工程大學(單鐵英)

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·論著·

雙氫青蒿素對實驗性小鼠肝纖維化的抑制作用

郭永澤單鐵英任海霞蔡莉李校天王建華劉曉東崔星亮

056002河北省邯鄲市，河北工程大學附屬醫院(郭永澤、任海霞、蔡莉、李校天、王建華、劉曉東、崔星亮)；河北工程大學(單鐵英)

【摘要】目的探討雙氫青蒿素對膽總管結扎引起的小鼠肝纖維化的抑制作用及其作用機制。方法50只C57BL-6小鼠隨機分為假手術組(n=10)、模型組(n=20)和治療組(n=20)。模型組：采用膽總管結扎的方法建立小鼠肝纖維化模型；治療組：在膽總管結扎術后第3周開始以20 μg/g的雙氫青蒿素灌胃，1次/d，共12次。假手術組：只是分離出膽總管，置線不結扎并縫合腹腔后第3周開始以等劑量的DMSO 0.9%氯化鈉溶液灌胃，1次/d，共12次。3組的肝組織切片經HE和天狼猩紅染色法觀察其組織學病理變化；Western blot方法檢測Ⅰ型膠原和α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)蛋白的表達水平。結果經HE和天狼星紅染色法結果證實小鼠肝纖維化動物模型的成功建立。模型組小鼠肝內出現灶狀壞死，匯管區纖維組織和膽總管明顯增生，肝組織中Ⅰ型膠原蛋白和α-SMA含量增加，與假手術組相比其差異有統計學意義(P<0.05)。治療組經過雙氫青蒿素治療后，小鼠肝內纖維組織增生降低，肝組織中Ⅰ型膠原蛋白和α-SMA含量降低,與模型組比較差異有統計學意義(P<0.05)。結論雙氫青蒿素具有抗肝組織纖維化作用，提示可作為一種新型抗肝組織纖維化藥物。

【關鍵詞】肝纖維化；雙氫青蒿素；膽總管結扎；天狼星紅染色；Ⅰ型膠原；α-平滑肌肌動蛋白

肝纖維化是一種常見的嚴重威脅人類生命健康的疾病，是機體對慢性肝損傷刺激的一種修復反應，其病理學特征表現為：肝組織內以Ⅰ型膠原為主的細胞外基質(extracellularmatrix，ECM)過度增生與異常沉積[1,2]，使肝臟的組織結構遭到破壞，最終導致肝硬化。因此，預防和治療肝纖維化是許多醫學研究者關注的焦點。雙氫青蒿素(dihydroartemisinin，DHA)為青蒿素的衍生物，研究已經證實它具有多種生物學功能如：抗腫瘤、抗瘧疾及調節機體免疫力等[3-5]。近年來，有實驗研究表明，青蒿琥酯能抑制肝星狀細胞的增殖而起到抗肝纖維化的作用[6]。本研究主要采用膽總管結扎制備小鼠肝纖維化動物模型，經過DHA治療后觀察并分析其對小鼠肝纖維化的抑制作用及其作用機制，為臨床上尋找新的防治肝纖維化藥物提供理論基礎。

1材料與方法

1.1實驗動物清潔級健康雄性C57BL-6小鼠50只,5～6周齡，平均體重(0.32±0.28)kg, 購自河北醫科大學動物實驗中心。許可證號：SCXK(冀)2014-1-005。實驗過程符合中華人民共和國的《實驗動物管理條例》及倫理要求。

1.2主要試劑DHA(標準品)，購自上海純優生物科技有限公司，用二甲基亞砜(DMSO)溶解，配成母液，4℃保存，實驗前用0.9%氯化鈉注射液配制，DMSO終濃度<0.1%。DMEM 和FBS 購自Gibco;Ⅰ型膠原多克隆抗體和α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)抗體購自Santa Cruz;SP試劑購自北京中山生物技術公司；天狼星紅染色液購自北京Leagene 公司。

1.3方法

1.3.1肝纖維化動物模型制備:本實驗采用膽總管結扎法制備小鼠肝纖維化模型，具體方法參照文獻[7]：采用3%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉小鼠，在腹下部沿正中線至劍突下切開長約2 cm的切口，充分顯露出膽總管及十二指腸上段，小心分離出膽總管并結扎縫合腹腔。假手術組只是分離出膽總管，置線不結扎并縫合腹腔。以上操作均在無菌條件下進行。術后分籠飼養。

1.3.2實驗分組:將50只小鼠隨機分成假手術組(n=10)、模型組(n=20)及治療組(n=20)。模型組：按上述方法建立小鼠肝纖維化模型，常規飼養；治療組：按上述方法膽總管結扎術后第3周開始以20 μg/g 的DHA灌胃，1次/d，共12次。假手術組：只是分離出膽總管，置線不結扎并縫合腹腔，第3周開始以等劑量的DMSO 0.9%氯化鈉溶液灌胃(DMSO終濃度<0.1%)，1次/d，共12次。

1.3.3標本采集及制備:最后1次灌胃后48 h，麻醉處死各組小鼠，打開腹腔，無菌下取肝組織，肉眼觀測其顏色、質地等，用冰磷酸鹽緩存液(PBS)洗去血跡，取相同部位的右肝組織，10%多聚甲醛固定24 h，常規梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋。

1.3.4HE染色:上述各組肝組織采用石蠟包埋，并以5 μm的厚度連續切片，二甲苯脫蠟、梯度濃度乙醇至水、蘇木精染色5 min、自來水洗3 min、1%鹽酸乙醇30 s、自來水洗3 min、1%氨水30 s、伊紅染色1 min、二甲苯透明和中性樹膠封片。然后光學顯微鏡下觀察肝組織結構改變情況。

1.3.5天狼星紅染色:根據文獻的操作步驟對肝組織進行天狼星紅染色[8]，然后光學顯微鏡下觀察肝組織結構改變和膠原沉積情況，并采用image-Pro Plus軟件對肝組織膠原沉積進行定量分析。

1.3.6Western blot檢測肝組織中Ⅰ型膠原蛋白(Col Ⅰ)和α-SMA蛋白的表達水平:用上樣緩沖液5×SDS與3組的肝組織總蛋白提取物50 μg均勻混合，100℃煮沸5 min，冰上冷卻，加入PAGE凝膠孔內，進行恒壓為120 V電泳。在100 V恒壓和180 mA的條件下分別用45 min將凝膠上蛋白轉移至PVDF膜，用TTBS 20 ml和1 g奶粉封閉2 h。將膜分別浸入Ⅰ型膠原蛋白和α-SMA抗體，抗體濃度均為1∶250，4℃過夜。TTBS溶液洗膜3次，10min/次，將膜浸入辣根過氧化物酶標記的二抗溶液(1∶10 000)，37℃反應2 h，TTBS溶液洗膜3次，10 min/次，化學發光法顯色。底片經掃描儀透掃后，用ImageJ2X軟件對Western條帶進行定量分析，以GAPDH作為內參矯正，用目的蛋白的吸光度與內參吸光度的比值代表目的蛋白的相對表達含量。

2結果

2.1HE染色法觀察肝組織的病理學改變假手術組：肝小葉結構清晰，肝細胞大小均勻且排列整齊，無變性和壞死現象，匯管區無異常。模型組：多數肝小葉結構遭到破壞，紊亂，在中央靜脈周圍的肝細胞出現變性并發生片狀壞死現象，炎性細胞浸潤，結締組織和小膽管增生、匯管區擴大，假小葉形成。治療組：較少的肝小葉結構破壞，肝細胞排列較整齊可發現肝細胞再生現象，少量炎性細胞浸潤和小膽管增生。見圖1。

A 假手術組B 模型組C 治療組

圖1肝組織的病理學改變(HE×100)

2.2天狼星紅染色法觀察肝組織的病理學改變假手術組中央靜脈周圍和匯管區有少量膠原纖維；模型組在小葉周邊、匯管區和中央靜脈周圍出現大量紅色膠原纖維，表明肝纖維化、肝硬化已經形成。治療組在小葉周邊、匯管區和中央靜脈周圍膠原纖維明顯減少。采用image-Pro Plus軟件分析，結果顯示，模型組狼星紅染色陽性面積高于假手術組(P<0.05)，治療組天狼星紅染色陽性面積明顯低于模型組(P<0.05)。見圖2，表1。

2.3雙氫青蒿素抑制肝組織中Ⅰ型膠原蛋白和α-SMA蛋白的表達水平Western blot檢測結果顯示：假手術組肝組織中有少量Col Ⅰ和α-SMA陽性表達;模型組與之類似；與假手術組相比，模型組肝組織中Col Ⅰ和α-SMA表達明顯增加(P<0.05)；與模型組比較，治療組肝組織中Col Ⅰ和α-SMA表達明顯降低(P<0.05)。見圖3、表2。

A 假手術組B 模型組C 治療組

圖2　觀察肝組織的病理學改變(天狼星紅×100)

注:與假手術組比較，*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05

圖3　Western blot顯示肝組織中Ⅰ型膠原和α-SMA的蛋白表達水平

吸光度，±s

注:與假手術組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05

3討論

DHA是青蒿素的一種衍生物，屬于倍半萜內酯類化合物。吳蘋等[9]實驗研究顯示，發生腎炎的小鼠經過DHA治療后，發現其腎炎的程度減輕，其機制是DHA可以調節腎炎小鼠體內炎性因子的釋放。袁曉梅等[10]建立肺纖維化的小鼠模型并采用DHA治療，結果表明DHA可以呈劑量依賴性抑制小鼠肺纖維化。

本實驗采用膽總管結扎的方法建立肝纖維化動物模型。該方法建立的肝纖維化模型所需時間短，穩定且不容易發生逆轉，比較適合用于選擇抗纖維化藥物的實驗研究[11]。

肝纖維化的主要病理特征是細胞外基質在肝組

織內異常增生和沉積，其中以Ⅰ型膠原最為主明顯。實驗研究已經證實，在肝纖維進展的過程中，肝星狀細胞增殖活化，Ⅰ型膠原和α-SMA基因和蛋白表達上調，膠原合成增加[12]。經過PDGF-B 反義寡脫氧核苷酸、S-亞硝基-N -乙酰半胱氨酸等抗纖維化的藥物治療后，肝星狀細胞失活并恢復到靜止狀態，而Ⅰ型膠原和α-SMA 的基因和蛋白表達也下調，肝纖維化程度逐漸減輕[13-16]。本實驗的研究表明，肝纖維化的小鼠肝細胞出現灶狀壞死，匯管區纖維組織和膽總管明顯增生，肝組織中Ⅰ型膠原蛋白和α-SMA含量增加。經過雙氫青蒿素治療后，小鼠肝內纖維組織增生降低，Ⅰ型膠原蛋白和α-SMA含量降低。這說明DHA可能是通過抑制肝星狀細胞增殖活化而抗肝纖維化，提示可作為一種新型抗肝組織纖維化藥物。

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The inhibitory effects of dihydroartemisinin on liver fibrosis in experimental mice

GUOYongze*,SHANTieying,RENHaixia*,etal.

*AffiliatedHospitalofHeibeiEngineeringUniversity,Hebei,Handan056002,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the inhibitory effects and action mechanism of dihydroartemisinin (DHA) on liver fibrosis induced by bile duct ligation in experimental mice.MethodsFifty C57BL-6 mice were randomly divided into sham-operation group (n=10),model group (n=20) and treatment group (n=20). The animal models with hepatic fibrosis were established by bile duct ligation,then,on the third week after bile duct ligation, the mice in treatment group were given DHA 20μg/g by gavage,once a day for 12 days. However the mice in sham-operation group were given equal dose of DMSO physiological saline by gavage, once a day for 12 days. The histopathological changes were observed by HE and sirius red staining for three groups,moreover, the expression levels of typeⅠcollagen and α-smooth muscle actin (α-SMA) were detected by Western Blot.ResultsThe results by HE and sirius red staining demonstrated that the animal models with hepatic fibrosis were successfully established in experimental mice. The focal cellular necrosis and fibrous tissue hyperplasia were found in liver of mice of model group,furthermore, the expression levels of type I collagen and α-SMA were obviously increased,there were significant differences between model group and sham-operation group (P<0.05). After treatment by DHA in treatment group,the fibrous tissue hyperplasia in liver was improved and the expression levels of type I collagen and α-SMA were significantly decreased, as compared with those in model group (P<0.05).ConclusionDHA has the effects of anti-fibrosis of liver tissues, thus, it suggests that DHA can be regarded as a potential therapeutic drug for liver fibrosis.

【Key words】liver fibrosis;dihydroartemisinin;bile duct ligation; sirius red staining; type I collagen;α-smooth muscle actin

(收稿日期：2015-09-14)

【中圖分類號】R 975.5

【文獻標識碼】A

【文章編號】1002-7386(2016)06-0824-03

doi:10.3969/j.issn.1002-7386.2016.06.006

項目來源：邯鄲市科學技術研究及發展項目(編號：1323108088-5)