烏丹降脂膠囊對SD大鼠非酒精性脂肪肝體內FGF-21和TNF-α的調節作用

閻納新　郭云　劉洪德　戴二黑　張巍　楊莉

050021　河北省石家莊市第五醫院

?

·論著·

烏丹降脂膠囊對SD大鼠非酒精性脂肪肝體內FGF-21和TNF-α的調節作用

閻納新郭云劉洪德戴二黑張巍楊莉

050021河北省石家莊市第五醫院

【摘要】目的探討烏丹降脂膠囊對大鼠非酒精性脂肪肝(NASH)模型外周血中成纖維細胞生長因子-21(FGF-21)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的調節作用。方法40只SPF級SD大鼠隨機分為正常對照組、模型組、易善復組、烏丹降脂膠囊組，正常對照組以基礎飼料喂飼，其他3組連續16周通過高脂飼料喂飼，建立非酒精性脂肪肝病模型，同時正常對照組、模型組，以0.9%氯化鈉溶液10 ml·kg(-1)·d(-1)灌胃；易善復組以易善復溶液灌胃10 ml·kg(-1)·d(-1)；烏丹降脂膠囊組以烏丹降脂膠囊灌胃10 ml·kg(-1)·d(-1)；連續灌胃14周后，檢測血清生化指標[谷氨酸氨基轉移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(AST)、總膽固醇(CHOL)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)、超敏C-反應蛋白(CRP)]及FGF-21、胰島素、TNF-α的含量。結果與模型組相比，烏丹降脂膠囊組及易復善組FGF-21、胰島素、TNF-α的含量均明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)，血液生化ALT、AST、CHOL、TG、LDL-C、CRP各指標水平明顯下降，HDL-C水平升高，差異有統計學意義(P<0.05)。結論烏丹降脂膠囊可能通過抑制FGF-21和TNF-α的生成，抑制脂肪合成及減輕肝臟的炎癥，這可能是烏丹降脂膠囊治療非酒精性脂肪肝的機制之一。

【關鍵詞】烏丹降脂膠囊；非酒精性脂肪肝；成纖維細胞生長因子-21；腫瘤壞死因子-α

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liverdisease NAFLD)是一組無過量飲酒史，肝組織學改變與酒精性肝病相類似，以肝實質細胞脂肪變性和脂肪貯積為特征的臨床病理綜合征[1]。目前隨經濟的發展，NAFLD的患病率迅猛增高，現已成為危害人類健康的三大肝病之一，烏丹降脂膠囊(冀藥制字Z20051051)是石家莊市第五醫院自行研制的用于脂肪肝的治療藥物，經多年臨床觀察療效顯著。腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-alph，TNF-α)和成纖維細胞生長因子21(fibmblast growth factor 21，FGF-21)是近年發現與脂肪肝密切相關的脂肪細胞因子，本研究通過大鼠非酒精性脂肪肝模型研究烏丹降脂膠囊在非酒精性脂肪肝形成中對FGF-21及TNF-α的調節作用，探討其治療脂肪肝的作用機制。

1材料與方法

1.1實驗動物SD大鼠40只，雄性，無特定病原體級(SPF)，體重(200±20)g，由河北醫科大學實驗動物中心提供。

1.2飼料與藥物基礎飼料：由河北醫科大學實驗動物中心加工生產；高脂飼料配方：膽固醇2%,豬油10%,基礎飼料88%；烏丹降脂膠囊：石家莊市第五醫院臨床治療脂肪肝的經驗方，由石家莊市第五醫院制劑室提供，冀藥制字：Z20051051；易善復由賽諾菲安萬特公司生產，國藥準字：HZ20109010。

1.3實驗試劑及主要儀器檢測血清胰島素(Insulin)、TNF-α和FGF-21的ELISA試劑盒由R&D公司生產，主要檢測儀器為芬蘭Thermo公司產MK3型全自動酶標儀，檢測生化指標所采用儀器為美國雅培C8000全自動生化分析儀，測定谷氨酸氨基轉移酶(ALT)，天冬氨酸氨基轉移酶(AST)試劑購自日本積水株式會社，總膽固醇(CHOL)，三酰甘油(TG)，高密度脂蛋白(HDL-C)，低密度脂蛋白(LDL-C)，超敏C-反應蛋白(CRP)試劑購于日本協和醫藥。

1.4實驗動物造模方法及標本留取40只SD大鼠隨機分為4組，每組10只，分別為正常對照組、模型組、易善復組和烏丹降脂膠囊組。正常對照組以基礎飼料喂食，而模型組、易善復組和烏丹降脂膠囊組則以高脂飼料喂飼，連續喂養2周后，正常對照組、模型組以0.9%氯化鈉溶液10 ml·kg-1·d-1灌胃；易善復組以易善復溶液(將易善復用雙蒸水配制成8.523 g/L的溶液)10 ml·kg-1·d-1灌胃；烏丹降脂膠囊組以烏丹降脂膠囊溶液(將烏丹降脂膠囊用雙蒸水配置成41.667 g/L的溶液)10 ml·kg-1·d-1灌胃，連續灌胃14周。實驗結束后，3%戊巴比妥鈉(0.15 ml/100 g)腹腔注射麻醉，無菌采集外周靜脈血，凝固后2 000 r/min離心10 min，分離血清備用。

1.5生化指標檢測將4組大鼠的血清標本采用美國雅培C8000全自動生化分析儀測定血清中ALT、AST、CHOL、TG、HDL-C、LDL-C、CRP的含量。

1.6血清Insulin、TNF-α和FGF-21的檢測采用酶聯免疫吸附(ELISA)法測定血清中Insulin、TNF-α和FGF-21的含量，嚴格按說明書操作。

2結果

2.14組大鼠血清生化指標比較與正常對照組相比，模型組ALT、AST、CHOL、TG、LDL-C、CRP各指標水平明顯升高，HDL-C水平下降，易善復組與烏丹降脂膠囊組LDL-C明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，易善復組與烏丹降脂膠囊組ALT、AST、CHOL、TG、LDL-C各指標水平明顯下降，HDL-C水平升高，差異有統計學意義(P<0.05)；與易善復組相比，烏丹降脂膠囊組LDL-C水平明顯下降，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1，圖1。

表14組大鼠血清生化指標比較

組別ALTASTCHOLTGHDL-CLDL-C正常對照組41.27±3.51242.80±23.421.44±0.180.352±0.100.79±0.070.24±0.09模型組95.2±56.62*361.01±172.58*2.12±0.29*0.51±0.14*0.76±0.14*0.99±0.37*易善復組43.20±10.39#243.33±31.40#1.63±0.33#0.37±0.06#0.79±0.08#0.73±0.28*#烏丹降脂膠囊組42.87±9.25#242.93±35.32#1.50±0.29#0.36±0.04#0.80±0.14#0.50±0.15*#△

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與易善復組比較，△P<0.05

圖1　4組大鼠血清生化指標的結果

2.24組大鼠血清細胞因子相關指標結果與正常對照組相比，模型組FGF-21、TNF-α、Insulin、CRP各指標水平明顯升高，易善復組與烏丹降脂膠囊組CRP明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，易善復組與烏丹降脂膠囊組FGF-21、FINS、CRP各指標水平明顯下降，烏丹降脂膠囊組TNF-α明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)；與易善復組相比，烏丹降脂膠囊組TNF-α、CRP 明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2，圖2。

表2　4組大鼠血清細胞因子相關指標比較　±s

注：與正常對照組比較,*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與易善復組比較，△P<0.05

圖2　4組大鼠血清細胞因子檢測結果

3討論

近年對NAFLD發病機制的研究中Day等[2]提出的“二次打擊”學說是目前被學界廣泛接受的假說，第一次打擊主要是指各種原因導致的肝細胞內TG沉積，其中最主要的原因是胰島素抵抗(Insulin resistance，IR)，第二次打擊是指各種原因導致的炎癥和纖維化的形成，其中最主要的原因是氧化應激與脂質過氧化。近年研究顯示脂肪細胞因子FGF-21，主要表達在肝臟、胰腺、肌肉及脂肪細胞等高代謝狀態的組織中[3-6]，它是一種類胰島素的細胞因子，主要功能是可以增加胰島素的敏感性、降低胰島素抵抗、減輕脂肪變性、增加能量消耗。周婷婷等[7]通過在臨床上實驗研究表明非酒精性脂肪肝患者和脂肪肝合并糖尿病患者FGF-21水平均顯著高于正常對照組，也有報道稱敲出FGF-21基因小鼠出現了脂肪肝，由此顯示FGF-21可作為脂肪肝治療的一個新的生物標記物和指示指標[8]。亦有研究顯示刻意使健康機體發生高胰島素血癥的同時可伴有FGF-21的升高[9]。本研究結果顯示模型對照組血清中胰島素、FGF-21含量均明顯增高，而易善復組與烏丹降脂膠囊組與模型對照組相比則明顯降低，甚至有低于正常對照組的趨勢，可見烏丹降脂膠囊可以有效減少胰島素和FGF-21的產生。在烏丹降脂膠囊的構成成分中，生山楂、草決明、丹參、澤瀉、黃芪等均是現代藥理證明具有降脂作用的中藥，而在本研究中顯示模型對照組的CHOL、TG、LDL-C明顯升高，HDL-C明顯降低，而烏丹降脂膠囊組與模型對照組相比CHOL、TG、LDL-C明顯降低，HDL-C明顯升高，達到正常對照組水平，甚至LDL-C低于正常對照組，由此可見降低脂肪的合成和儲存是烏丹降脂膠囊治療脂肪肝的機制之一，即抑制第一次打擊的作用來抑制脂肪肝的形成。

TNF-α是主要由活化的單核/巨噬細胞產生的、能殺傷和抑制腫瘤細胞的細胞因子[10]。在NAFLD的發病中，TNF-α是參與“二次打擊”的重要炎性因子，同時還在IR的形成中起著重要作用[11,12]，本研究顯示模型對照組血清中TNF-α、CRP均比正常對照組明顯升高，且ALT、AST的含量亦明顯升高，表明所造動物模型確實形成了肝臟的炎癥，形成肝臟損傷，而烏丹降脂膠囊組的TNF-α、CRP比模型對照組明顯降低，甚至明顯低于易善復組，AST、ALT則恢復至正常對照組水平，表明烏丹降脂膠囊可以抑制TNF-α的產生，使肝臟的炎癥減弱，促進肝功能恢復，即烏丹降脂膠囊可以降低“第二次打擊”的作用抑制脂肪肝的形成。根據文獻報道，有關NAFLD的記載早已有之，多屬“肝癖”、“脅痛掣、積聚”等范疇[13]。其病因可由痰濕之體，肝、脾、胃、腎等臟腑失養或虛損，氣血虧虛為內因，以及過食肥甘、膏粱、感受濕毒或情志失調等外因而致本病[14,15]。但是中藥復方由于具有多靶點作用機制，且不良反應少，近年日益受到人們的關注。烏丹降脂膠囊的生山楂可消食導滯，化痰消積，陳皮可以健脾燥濕化痰，半夏可以燥濕化痰，消痞散結，丹參可活血祛瘀的作用，從中醫的角度來看具有健脾化痰、活血化瘀的功效，有利于脂肪肝的治療，而本研究進一步證實烏丹降脂膠囊對NAFLD形成的兩次打擊的階段均有一定的抑制作用，可見其作用是多靶點的，甚至在改善肝臟炎癥方面優于易善復，但是它的價錢明顯低于易善復，所以是值得推廣的一種用于治療非酒精性脂肪肝的復方中藥。

參考文獻

1劉銳，李勁平，伍娟娟，等.丹苘軟膠囊對非酒精性脂肪肝模型大鼠胰島素抵抗及瘦素抵抗的影響.中國實驗方劑學雜志,2012,8:188-191.

2Day CP，James OFW．Steatohepatitis：a tale of two“hits”? Gastroentero-logy,1998，114：842-845.

3Zhang X, Yeung DCY, Karpisek M, et al. Serum FGF21 levels are increased in obesity and are independently associated with the metabolic syndrome in humans.Diabetes,2008,57:1246-1253.

4Inagaki T.Research perspectives on the regulation and physiological functions of FGF21 and its association with NAFLD.Front Endocrinol(Lausanne),2015,23:147.

5Zhang W,Chu S,Ding W,et al.Serum level of fibroblast growth factor 21 is independently associated with acute myocardial infarction.PLoS One,2015,10:1-9.

6盧盼，曹仁賢.成纖維生長因子21在2型糖尿病及肥胖中的研究進展．現代醫藥衛生，2014，30：55-58.

7周婷婷，秦波，鄭天鵬，等.非酒精性脂肪肝患者血漿FGF21水平及與肥胖、胰島素抵抗關系研究．第三軍醫大學學報，2010，32：265-268.

8Liu WY,Huang S,Shi KQ,et al.The role of fibroblast growth factor 21 in the pathogenesis of liver disease: a novel predictor and therapeutic target.Expert opinion on therapeutic targets,2014,15:1-9.

9Mai K，Bobbert T，Gmtll C，et al．Physiological modulation of circulating FGF21：relevance of free fatty acids and insulin．Am J Physiol Endocrinol Metab，2010，299：E126-130.

10Barbuio R，MiIanski M，Bertolo M，et al．Infliximab reverses steatosis and improves insulin signal transduction in liver of rats fed a high-fat diet．Journal of Endocrinology,2007,194：539-550.

11高慧亭，徐麗姝，李東風，等.GLP-1對非酒精性脂肪肝大鼠肝氧化應激及TNF-α、TGF-β1的影響．南方醫科大學學報，2013，33：1661-1664.

12蘆建慧,陳儉靜,彭相文,等.非酒精性脂肪肝病患者血清腫瘤壞死因子-α的檢測及意義．國際免疫學雜志，2013，36：310-313.

13余世敏，胡東輝，張京偉.清肝降脂湯治療非酒精性脂肪肝的臨床療效研究．重慶醫學，2012，41：3255-3256,3259.

14劉銳,李勁平,伍娟娟,等.丹苘軟膠囊對非酒精性脂肪肝模型大鼠胰島素抵抗及瘦素抵抗的影響．中國實驗方劑學雜志，2012，18：188-191.

15朱文正，戚國勇，賈彥.中西藥合用治療非酒精性脂肪肝療效觀察．實用中醫藥雜志，2014，30：35-36.

(收稿日期：2015-10-27)

【中圖分類號】R 575

【文獻標識碼】A

【文章編號】1002-7386(2016)06-0918-03

通訊作者：楊莉，050021河北省石家莊市第五醫院；

doi:10.3969/j.issn.1002-7386.2016.06.041

項目來源：河北省中醫藥管理局科學技術研究計劃基金項目(編號：2012166);河北省科學技術研究與發展計劃項目(編號：14277753D)

E-mail：yangli_yl6666@126.com