槲皮素磁性分子印記聚合物的制備及其吸附性能

阮永欣,　馬應霞,　王茹娟,　邢　丹,　杜雪巖,　張文娟（蘭州理工大學材料科學與工程學院,有色金屬先進加工與再利用省部共建國家重點實驗室,蘭州730050）

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槲皮素磁性分子印記聚合物的制備及其吸附性能

阮永欣,馬應霞,王茹娟,邢丹,杜雪巖,張文娟
（蘭州理工大學材料科學與工程學院,有色金屬先進加工與再利用省部共建國家重點實驗室,蘭州730050）

摘 要:以槲皮素（Qu）為模板分子、N-乙烯基吡咯烷酮（NVP）和丙烯酸（AA）為功能單體、N,N＇-亞甲基雙丙烯酰胺（MBA）為交聯劑、H2O2-Vc為引發劑、KH570修飾的Fe3O4納米顆粒為磁性載體,借助表面分子印跡技術制備了能夠對Qu進行特異性識別的槲皮素磁性分子印跡聚合物（Qu-MMIPs）。利用X射線衍射儀（XRD）、透射電子顯微鏡（TEM）、傅里葉變換紅外光譜儀（FT-IR）、振動樣品磁強計（VSM）和紫外-可見分光光度計（UV-Vis）對樣品進行了結構和性能表征。結果表明：Fe3O4磁性載體表面已成功包覆了分子印跡聚合物。與化學組成相同的磁性非印跡聚合物（Qu-MNIPs）相比,Qu-MMIPs對Qu有較高的吸附選擇性。靜態吸附平衡實驗和Scatchard分析結果表明,Qu-MMIPs中存在兩類不同的結合位點,平衡解離常數分別為1.646× 10(－6)mol/L和6.387×10(－6)mol/L,最大吸附量分別為23.041 mg/g和29.923 mg/g。

關鍵詞:槲皮素；磁性納米顆粒；分子印跡聚合物；吸附

近年來,黃酮類化合物在抗病毒性、抗過敏性、抗炎性、抗腫瘤及抗氧化性等［1］方面表現出了獨特的優勢,從而引起了國內外研究者的廣泛興趣。在黃酮類化合物中,槲皮素（Qu,3,3＇,4＇,5,7-五羥基黃酮）具有清除人體氧自由基等多種生物活性［2-3］,通常用于治療慢性支氣管炎,也可用于冠心病及高血壓的輔助治療［4］。Qu大多數以苷的形式存在于植物的花、葉及果實中,是許多中草藥和天然產物如槐米、紅棗、金銀花、銀杏葉、桑葉、三七的有效成分之一。由于在自然條件下槲皮素的濃度很低,并且其結構與其他黃酮類化合物類似,因此從復雜體系中分離、提純Qu就顯得尤為困難。而分子印跡聚合物（MIPs）因其對印跡分子特殊的高選擇性和親和力成為了近年來的研究熱點,并在眾多領域中有所應用。

目前,有關制備槲皮素分子印跡聚合物（Qu-MIPs）的相關報道也很多［4-8］,并取得了一定的研究成果。范培民［7］等利用分子印跡技術,通過紫外光引發原位聚合的方法制備了槲皮素金屬配位印跡聚合物,但是在其吸附后的分離過程中,往往要經過抽濾、離心等步驟,從而無法實現分離效率的有效提高。而磁性納米顆粒由于其特殊的物理和化學性質,使得磁技術廣泛應用在化學、生物醫學等領域。尤其是以低毒、穩定、價廉易得的Fe3O4作為磁性材料的研究受到了人們的極大關注［9-10］。如果賦予MIPs磁響應性,不僅可以對分子產生特異性識別,而且能夠實現MIPs在外加磁場作用下的快速定向移動,從而實現MIPs的大規模連續化生產。因此,制備以Fe3O4納米顆粒（Fe3O4NPs）為載體的磁性分子印跡聚合物（MMIPs）用于Qu的分離和提純具有潛在的應用價值。

本文以Qu為模板分子、N-乙烯基吡咯烷酮（NVP）和丙烯酸（AA）為功能單體、N,N＇-亞甲基雙丙烯酰胺（MBA）為交聯劑、Fe3O4納米顆粒為磁性載體,一步合成了對槲皮素具有特異識別性的槲皮素磁性分子印跡聚合物（Qu-MMIPs）,并以Qu結構類似物染料木素（Ge）為競爭底物,研究了Qu-MMIPs的吸附特性。此外,對Qu-MMIPs的吸附特性和識別機理的研究將為類似分子識別的設計提供理論依據。

1　實驗部分

1.1試劑與儀器

FeSO4·7 H2O、L-抗敗血酸（Vc）、MBA：分析純,天津市大茂化學試劑廠；正丁醇（NBA）、甲醇（MT）、冰乙酸（HAc）、無水乙醇（EA）：分析純,天津市富宇精細化工有限公司；雙氧水、環己烷（CYH）：分析純,天津市恒興化學試劑有限公司；NH3·H2O：分析純,白銀市化學試劑廠；FeCl3·6 H2O：分析純,煙臺市雙雙化工有限公司；KH570：分析純,南京曙光化工集團有限公司；Qu：分析純,陜西森佛生物技術有限公司；AA：分析純,天津市光復精細化工研究所；NVP：分析純,河南洛陽博愛新開源有限公司；Ge：分析純,西安小草植物科技有限公司；乳化劑OP-10：化學純,天津市北辰方正試劑廠。

采用上海一恒科學儀器有限公司HZQ-211C型落地恒溫振蕩器為樣品提供吸附所需的恒溫環境；采用日本電子公司JSM-2010型透射電子顯微鏡分析樣品形貌；采用德國布魯克公司D8/ADVANCE型X射線衍射儀和美國尼高力公司NEXUS-670型傅里葉變換紅外光譜儀表征樣品結構；采用美國Lakeshore公司7304型振動樣品磁強計（VSM）測試樣品的磁性能；采用上海精密科學儀器有限公司UV-752N型紫外可見分光光度計分析樣品的吸附性能。

1.2槲皮素磁性分子印跡聚合物的制備

首先將16.000 g乳化劑OP-10、22 m L正丁醇和50 m L環己烷混合均勻后,加入到裝有機械攪拌、球形冷凝管和N2導管的三口燒瓶中；然后將0.473 g FeCl3·6H2O和0.278 g FeSO4·7H2O溶于25 m L去離子水中,加入到上述三口燒瓶中；滴加3 m L濃氨水,20℃反應1 h。反應結束后,在該體系中加入0.96 m L KH570,50℃反應5 h。同時,將20 m L、10 mmol/L的Qu乙醇溶液、0.454 g AA和0.233 g NVP加入到50 m L燒杯中,室溫下攪拌5 h后加入到上述經KH570改性后的體系中,攪拌10 min后,再加入5.265mmol MBA、0.08 mmol H2O2和0.16 mmol Vc,35℃反應28 h得到KH570改性的Fe3O4納米顆粒（KH570-Fe3O4NPs）。產物利用外加磁場進行分離,先用甲醇-乙酸（甲醇與乙酸體積比為9/1）洗脫液清洗3次后,再放入盛有甲醇、乙酸洗脫液的索氏抽提器中洗脫模板分子,直到洗脫液的吸光度小于0.005。將產物在40℃真空干燥24 h,得到的樣品標記為Qu-MMIPs。

用同樣的方法,不加模板分子制備磁性非印跡聚合物,得到的樣品標記為Qu-MNIPs。

1.3吸附性能測試

準確稱取10 mg的磁性印跡聚合物于25 m L的錐形瓶中,分別加入5 m L不同質量濃度（0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 g/L）的Qu乙醇溶液,封緊瓶口,室溫下將其置于恒溫振蕩器中振蕩吸附2 h,磁鐵吸沉,取上清液用UV-752N在370 nm處測定殘液的吸光度。根據公式（1）［11］計算Qu-MMIPs 對Qu的單位吸附量（Q,mg/g）。

式中：ρ0為Qu的初始質量濃度（g/L）；ρ為Qu吸附殘液的質量濃度（g/L）；V為Qu乙醇溶液的體積（m L）；

m為Qu-MMIPs的質量（g）。

1.4吸附選擇性研究

選取與Qu結構類似的Ge為競爭底物,分別稱取10 mg Qu-MMIPs和Qu-MNIPs置于25 m L的錐形瓶中,各加入5 m L Qu與Ge的混合溶液（每種底物的質量濃度均為0.1 g/L）,恒溫振蕩吸附2 h,磁鐵吸沉,取上清液用UV-752N分別在370 nm和262 nm的波長下測定殘液中每種底物的吸光度。根據公式（2）計算Qu-MMIPs和Qu-MNIPs對每種底物的單位吸附量（Q,mg/g）。

式中：ρe為平衡時Qu吸附殘液的質量濃度（g/L）；V為Qu與Ge的混合溶液的體積（m L）；m為Qu-MMIPs 或Qu-MNIPs的質量（g）。

1.5Qu-MMIPs重復利用率的研究

稱取10 mg Qu-MMIPs于25 m L的錐形瓶中,加入5 m L質量濃度為0.1 g/L的Qu乙醇溶液,封緊瓶口,室溫下靜置吸附2 h,磁鐵吸沉,取上清液用UV-752N在370 nm處測定殘液的吸光度。然后用甲醇、乙酸洗脫液對吸附了Qu的Qu-MMIPs進行洗脫,除去印跡分子Qu,再次得到Qu-MMIPs。如此反復,測定每次吸附后殘液的吸光度,根據公式（3）［12］計算Qu-MMIPs對Qu的吸附率（η,%）。

2　結果與討論

2.1XRD分析

圖1是Qu-MMIPs、KH570改性的Fe3O4NPs和Fe3O4NPs的XRD譜圖。從圖1可以清楚地看到：與JCPDS標準譜圖進行比對,Fe3O4的6個特征峰30.38°、35.58°、43.14°、53.48°、57.08°、62.66°所對應的晶面指數分別為（220）,（311）,（400）,（422）,（511）和（440）,說明制備的Fe3O4NPs具有反尖晶石的結構。由謝樂公式［13］計算得Fe3O4顆粒的平均粒徑在6.7 nm。而經過KH570的表面修飾或印跡聚合反應后,Fe3O4的特征峰依然存在,只是強度依次減弱,說明Fe3O4NPs被成功修飾并且包覆了一層印跡聚合物。

2.2TEM分析

圖1　樣品的XRD譜圖Fig.1 XRD spectra of samples

圖2為Fe3O4NPs和Qu-MMIPs的TEM照片（圖2 （a）、圖2（b））、Qu-MMIPs和Fe3O4NPs的選區電子衍射譜圖（圖2（c）、圖2（d））以及采用TEM統計的Qu-MMIPs粒徑分布圖（圖2（e））。從圖2（a）可見,Fe3O4納米顆粒尺寸在7 nm左右,這與通過XRD計算得到的粒徑大小基本一致,但團聚現象較為嚴重,這是因為顆粒尺寸較小時表面能較大,而團聚有利于降低表面能,從而達到穩定狀態。圖2（b）中納米粒子的尺寸有所增大,約為10 nm,這歸因于在磁性納米顆粒表面包覆了一層印跡聚合物所致,使得Qu-MMIPs的分散性明顯改善。對比Qu-MMIPs和Fe3O4NPs的選區電子衍射譜圖可知,Fe3O4NPs的電子衍射環明顯比Qu-MMIPs的清晰,這進一步說明在Fe3O4納米顆粒的表面包覆了一層薄的印跡聚合物。根據TEM得到的粒徑分布圖,顆粒的粒徑主要集中在9.0～10.5 nm,可見所制備的Qu-MMIPs顆粒擁有比較均一的粒徑分布。

圖2　Fe3O4NPs［10］（a）和Qu-MMIPs（b）的TEM照片、Qu-MMIPs（c）和Fe3O4NPs（d）的選區電子衍射譜圖以及采用TEM統計的粒徑分布圖（e）Fig.2 TEM images of Fe3O4NPs（a）and Qu-MMIPs（b）,SAED patterns of Qu-MMIPs（c）and Fe3O4NPs（d）and particle size distribution collected by TEM（e）

2.3FT-IR分析

圖3　樣品的紅外光譜圖Fig.3 FT-IR spectra of samples

圖3為Fe3O4NPs、KH570-Fe3O4納米顆粒和Qu-MMIPs的紅外光譜圖。在Fe3O4NPs的紅外光譜圖中,587 cm－1處的強峰為Fe—O的伸縮振動峰［13］,KH570-Fe3O4NPs和Qu-MMIPs的紅外光譜圖中也都出現了這個峰。KH570-Fe3O4的紅外光譜圖中,Si—O、CO和C—H的伸縮振動分別出現在1 100、1 713 cm－1和2 848 cm－1,所有這些變化都充分表明,KH570與納米Fe3O4表面的羥基發生了化學反應,即達到了KH570改性納米Fe3O4的目的。在Qu-MMIPs的紅外光譜圖中,1 181 cm－1以及1 416 cm－1處的峰分別是OC—O中C—O的不對稱伸縮振動峰和O—H的變形振動吸收峰；NVP和AA中CO的伸縮振動峰在1 633 cm－1處；在2 929 cm－1處的峰是NVP和AA中甲基或亞甲基的伸縮振動峰；3 421 cm－1處的強寬峰為NVP中N—H和AA中O—H的伸縮振動峰,所有這些特征峰的出現都充分表明,AA和NVP與改性后的納米Fe3O4表面的雙鍵發生了聚合反應,從而形成了以Fe3O4為內核、聚合物為外殼包裹Fe3O4的核-殼結構。

2.4VSM分析

圖4分別為Fe3O4NPs、KH570-Fe3O4NPs和Qu-MMIPs的磁滯回線。從圖4可以看出,3種樣品均沒有磁滯現象,剩磁和矯頑力都近似為零,顯示出超順磁性。室溫下,Fe3O4NPs、KH570-Fe3O4NPs和Qu-MMIPs的飽和磁化強度分別為63.7、58.4 emu/g和46.5 emu/g。與純Fe3O4的飽和磁化強度相比,Qu-MMIPs的飽和磁化強度則有所下降,這可能是由于表面包覆了印跡聚合物層影響了其磁響應性所致。

圖4　Fe3O4NPs和KH570-Fe3O4NPs（a）以及Qu-MMIPs（b）的磁滯回線Fig.4 Hysteresis loops of Fe3O4NPs,Fe3O4NPs modified with KH570（a）and Qu-MMIPs（b）

圖5為Qu-MMIPs分散在水中和在外磁場作用下的磁分離數碼照片。從圖5可以看出,在沒有外磁場存在時,Qu-MMIPs均勻地分散在水溶液中,呈黑色懸浮狀。當施加外磁場時,黑色顆粒被快速吸引到有外加磁場的瓶壁一側,溶液變得透明,這說明Qu-MMIPs具有良好的磁響應性,可作為磁性分離的載體。

圖5　Qu-MMIPs分散在水中（a）和在外磁場作用下的磁分離（b）數碼照片Fig.5 Digital photographs of Qu-MMIPs dispersed in the water（a）and external magnetic field（b）

2.5槲皮素磁性分子印跡聚合物Qu-MMIPs的吸附性能

2.5.1 吸附等溫線 圖6所示為Qu在0.01～2.5 g/L的吸附等溫線和Qu-MMIPs對Qu的Scatchard分析曲線。當Qu的起始質量濃度低于1.0 g/L時,吸附量增加很快；當Qu的起始質量濃度高于1.0 g/L 時,吸附容量趨于平衡,這表明Qu-MMIPs上的活性結合位點達到吸附飽和。而Qu-MNIPs與Qu-MMIPs 對Qu的吸附變化趨勢相同,吸附量也隨模板分子濃度的增加而增加,隨后也達到飽和。但與Qu-MMIPs相比,Qu-MNIPs的吸附容量卻小很多。

為了進一步研究Qu-MMIPs的吸附特性,通過Scatchard模型對所得Qu-MMIPs的吸附熱力學數據進行分析。Scatchard模型方程［14］為：

式中：Qe（mg/g）為不同質量濃度下的平衡吸附量；Qmax（mg/g）是Qu-MMIPs的最大吸附量；Kd（g/L）是Qu-MMIPs的平衡解離常數。

通過對Qe/ρe和Q關系圖的兩段線性部分進行擬合,可以分別得到高親和力位點方程和低親和力位點方程。根據上述兩條線性曲線的斜率和截距便可計算出,高親和位點的Kd和Qmax分別為0.497×10－3g/L 和23.041 mg/g,低親和位點的Kd和Qmax分別為1.929×10－3g/L和29.923 mg/g。Qu-MMIPs會形成兩種不同親和能力的結合位點,這主要是因為功能單體與模板分子通過氫鍵相互作用,在印跡聚合物的合成過程中形成了一定數量的印跡孔穴,而沒能與模板分子定向配位的功能單體在聚合物中是任意分布的,從而形成了特異性和非特異性兩種不同的吸附。

圖6　Qu-MMIPs和Qu-MNIPs的結合吸附等溫線（a）,Qu-MMIPs對Qu的Scatchard分析曲線（b）Fig.6 Adsorption isotherms for Qu-MMIPs and Qu-MNIPs（a）,Scatchard analysiscurve of Qu-MMIPs for Qu（b）

2.5.2 吸附選擇性 圖7為Qu-MMIPs和Qu-MNIPs分別對Qu和Ge的飽和吸附量。結果表明,Qu-MMIPs對模板Qu有較高的吸附量,但對Ge的吸附量則相對較低。這主要是由于在Qu-MMIPs中不存在Ge的特異性識別位點,從而使得Ge不能像Qu一樣,可與特定的空間結合位點形成較強的作用力。Qu-MNIPs對兩種底物的吸附量都較低,沒有選擇性,這也表明Qu-MMIPs對Qu的吸附是具有特異性的。

通常以印跡因子（α）來表示分子印跡聚合物的特異選擇性（α＝QQu-MMIPs/QQu-MNIPs,QQu-MMIPs和QQu-MNIPs分別為槲皮素磁性印跡和非印跡聚合物對Qu的吸附量）,α值越大,特異性越強,印跡效果越好。經計算得到Qu和Ge的α分別為2.32和1.32。從這些數據可知,制備的磁性印跡聚合物具有一定的選擇性,能夠實現對Qu的選擇性吸附。

2.5.3 重復利用性 圖8為槲皮素磁性分子印跡聚合物的吸附量隨洗脫次數變化的關系圖。從圖中可以看出,Qu-MMIPs呈現出良好的重復利用性,經過6次持續的吸附-洗脫循環之后,Qu-MMIPs對Qu的吸附率僅僅降低了9%。此結果表明,Qu-MMIPs在經過多次循環攪拌和抽提等機械外力的作用后,其空間結構并未損壞,仍保持著良好的結合位點,有較好的再生性能。

圖7　Qu-MMIPs和Qu-MNIPs對Qu 及Ge的飽和吸附量Fig.7 Saturated adsorption amount of Qu-MMIPs and Qu-MNIPs for Qu and Ge

圖8　Qu-MMIPs對Qu的吸附率與重復使用次數的關系Fig.8 Relationship between adsorption rate and recycling times of Qu-MMIPs for Qu

3　結　論

通過分子印跡技術,利用一步合成法成功制備了槲皮素磁性分子印跡聚合物,該聚合物具有良好的磁響應性,能夠滿足磁分離的要求,其對模板分子槲皮素具有特異的吸附能力,印跡因子為2.32。該方法將為多肽、蛋白質等生物大分子的有效分離提供一種新的途徑。

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Preparation and Adsorption Property of Quercetin Magnetic Molecularly Imprinted Polymers

RUAN Yong-xin,MA Ying-xia,WANG Ru-juan,XING Dan,DU Xue-yan,ZHANG Wen-juan
（State Key Laboratory of Advanced Processing and Recycling of Non-ferrous Metals,School of Materials Science and Engineering,Lanzhou University of Technology,Lanzhou 730050,China）

Abstract：Quercetin（Qu）magnetic molecularly imprinted polymers（Qu-MMIPs）with the specific recognizing property for Qu,were prepared using Qu as template molecule,acrylamide（AA）and N-vinylpyrrolidone（NVP）as functional monomers,N,N＇-methylene bisacrylamide（MBA）as crosslinker,H2O2-Vc as initiator and Fe3O4nanoparticles（NPs）modified withγ-methacryloxypropyltrimethoxysilane （KH570）as magnetic carrier.The as-synthesized polymers were characterized by X-Ray Diffraction（XRD）,Transmission Electron Microscopy（TEM）,Fourier Transform Infrared Spectroscopy（FT-IR）,Vibrating Sample Magnetometer（VSM）and UV-Visible Spectrophotometer（UV-Vis）.Results indicated that the modified Fe3O4magnetic carriers were coated with molecularly imprinted polymers.In comparison with magnetic molecularly non-imprinted polymers,Qu-MMIPs had better recognition performance for the Qu molecules.Static adsorption test and Scatchard analysis showed that two kinds of binding sites existed inbook=69,ebook=78Qu-MMIPs,and the corresponding dissociation constants were 1.646×10(－6)mol/L and 6.387×10(－6)mol/L.Furthermore,the maximum adsorption capacities of Qu onto Qu-MMIPs were 23.041 mg/g and 29.923 mg/g,respectively.

Key words：quercetin；magnetic nanoparticles；molecularly imprinted polymer；adsorption

作者簡介：阮永欣（1988-）,男,江蘇徐州人,碩士生,主要從事磁性納米功能材料的研究。E-mali：15214038152@163.com

基金項目：國家自然科學基金（51403091）；甘肅省自然科學基金（1310RJZA081）；省部共建有色金屬先進加工與再利用國家重點實驗室開放基金（SKL1315）

收稿日期：2015-11-16

文章編號:1008-9357（2016）01-0068-007

DOI：10.14133/j.cnki.1008-9357.2016.01.008

中圖分類號:TB34

文獻標志碼:A

通信聯系人：杜雪巖,E-mali：Duxy@lut.cn