黃酒釀造過程中優勢細菌產生物胺的檢測與評價

張鳳杰，王德良，薛　潔，閆寅卓（中國食品發酵工業研究院，北京100027）

?

黃酒釀造過程中優勢細菌產生物胺的檢測與評價

張鳳杰，王德良，薛潔，閆寅卓
（中國食品發酵工業研究院，北京100027）

摘要：采用顯色培養基法、脫羧酶序列特異PCR技術和HPLC分析脫羧酶液體培養基生物胺含量變化3種方法檢測和評價來自黃酒釀造過程的41株細菌產生物胺的情況。研究表明，3種方法檢測結果大致相同，互補使用能夠準確分析細菌產生物胺的情況；41株細菌中，53.7 %以上都能產酪胺，31.7 %以上產腐胺，24.3 %以上產組胺；14株短乳桿菌均攜帶酪氨酸脫羧酶基因，其中11株菌的酪胺產量超過50.00 mg/L，且多數菌能代謝產生多種生物胺，因此推斷其對黃酒中生物胺含量影響最大；細菌代謝是否產生物胺及產生物胺的能力無種屬特異性，但有菌株特異性。

關鍵詞：黃酒；細菌；生物胺；顯色培養基；PCR；HPLC

黃酒釀造采用開放式的工藝形式，釀造過程中微生物種類和數量繁多，細菌群落結構復雜，參與發酵過程的細菌主要有乳酸菌、醋酸菌、芽孢桿菌、糖多孢菌、葡萄球菌等，還有一些不可培養的細菌[1-2]。微生物的多種代謝產物對于黃酒風味和品質有重要影響[3]，然而，這也會使黃酒中含有一些微量有害物質，如氨基甲酸乙酯（ethylcarbamate，EC）[4-5]、生物胺（Biogenic amines，BAs）[6]等。

生物胺是一類具有生物活性的含氮低分子量有機化合物的總稱，普遍存在于多種食品中，其中毒性最大的是組胺，其次是酪胺[7]。生物胺生成需要3個條件：（1）生物胺前體物質游離氨基酸；（2）微生物及適合微生物生存的條件；（3）發生脫羧反應的條件。腐胺是黃酒中含量最大的胺，腐胺、酪胺和組胺的平均含量分別為37.201 mg/L、 25.294 mg/L和6.173 mg/L[8]。黃酒中生物胺主要來自釀造過程，豐富的氨基酸和乳酸菌的存在是生物胺增加的主要原因[9-10]，釀造過程中的微生物代謝產生脫羧酶，該酶催化相應的游離氨基酸脫去羧基生成生物胺。氨基酸作為產品價值的一部分而大量存在于黃酒中，所以控制黃酒中生物胺含量的關鍵在于控制釀造過程中能夠產生生物胺的微生物種類和數量。

因此，本研究采用顯色培養基法、脫羧酶序列特異PCR檢測法和HPLC分析生物胺含量變化法這3種方法，篩查黃酒釀造過程中優勢細菌的產胺情況，重點評價其產組胺、酪胺和腐胺的能力。探究產生物胺菌株有無共性差異，為進一步控制黃酒中生物胺含量提供理論依據。

1　材料與方法

1.1材料、試劑及儀器

菌株：實驗室保藏的41株細菌，分離源均為黃酒生產過程。

生物胺檢測培養基[11]：MRS培養基中添加5'-磷酸吡多醛0.05 g/L，溴甲酚紫0.06 g/L，瓊脂20 %，分別添加L-組氨酸1.0 g/L、L-酪氨酸0.4 g/L制成組胺檢測平板、酪胺檢測平板和腐胺檢測平板。

生物胺檢測液體培養基：MRS培養基中添加5'-磷酸吡多醛0.05 g/L，溴甲酚紫0.06 g/L，添加L-組氨酸1.0 g/L、L-酪氨酸0.4 g/L、L-鳥氨酸1.0 g/L。

化學試劑：8種單體生物胺標樣（色胺、β-苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺、精胺），1,7-二氨基庚烷（內標），丹磺酰氯(衍生劑)，均為Sigma公司產品；三氯甲烷，正丁醇，丙酮，甲醇，均為色譜純；乙醚，谷氨酸鈉，乙酸鈉，碳酸氫鈉，氯化鈉，鹽酸等；5'-磷酸吡哆醛（輔酶），溶菌酶，北京陸橋技術有限責任公司；DP302細菌基因組提取試劑盒，2×Tap mastermix，天根生化；瓊脂糖，Biowest Agarose；EB，Sigma等。

儀器設備：高效液相色譜儀，Perkin Elmer Series 200，紫外檢測器；安捷倫C18色譜柱（5μm，150 mm×4.6 mm）；氮吹儀；溫度梯度PCR儀，美國ABI公司；凝膠成像儀，美國Bio-Rad公司；電泳儀，北京六一儀器廠；MiniSpin個人型高速離心機，德國Eppendorf；立式電壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫療器械廠；LRH-250生化培養箱，上海恒科儀器有限公司；SW-CJ-2FD型雙人單面超凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司等。

1.2實驗方法

1.2.1顯色培養基法檢測產胺菌

將細菌分別劃線于相應的3種生物胺檢測平板，30℃培養5 d，記錄顏色變化，結果以黃色為陰性，紫紅色或紫色為陽性。

1.2.2特異序列PCR擴增檢測產胺細菌

細菌DNA提?。壕杲臃N于MRS培養基中30℃活化12 h，吸取1 mL菌液，8000 r/min離心5 min收集菌體，用無菌水洗滌2次，加入50 μL雙蒸水重懸菌體，制成菌懸液。按照天根DP302細菌基因組提取試劑盒說明提取細菌基因組。

引物：酪氨酸脫羧酶引物TD2(5'-ACTTAGTCAACCATRTTGAA- 3')/ TD5(5'- CAAATGGAAGAAGAAGTAGG-3')，目標片段1132 bp；組氨酸脫羧酶引物HDC1 (5'-ATGTCAGAGTTTGATAAAAAG-3')/HDC2(5'-TTAATAATTGATGTTTCCACC-3')，目標片段904 bp。

25μL反應體系：2×Tapmastermix12.5μL，引物(10μM) 各1 μL，模板DNA2 μL，加雙蒸水補足至25 μL。

PCR反應條件：95℃預變性，5 min；循環次數30次；95℃變性，30 s，52℃退火，1 min，72℃延伸，2 min；72℃終延伸，10 min。

本實驗選用已報道的組氨酸和酪氨酸脫羧酶基因擴增引物序列，由生工生物工程（上海）有限公司合成，按照上述25 μL反應體系和PCR反應條件分別對組氨酸脫羧酶基因和酪氨酸脫羧酶基因進行序列擴增，擴增產物經1.2 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測，4℃保存。

1.2.3 HPLC法分析細菌產胺情況

菌株接種于MRS培養基活化18 h，然后接種于添加氨基酸和輔酶的改良MRS生物胺檢測培養基，30℃培養5 d后檢測培養液中的腐胺、酪胺和組胺含量，以不接種的培養基作空白。

2　結果與分析

2.1顯色培養基檢測產胺細菌

將41株細菌分別劃線于組胺、腐胺和酪胺檢測平板上，30℃培養，記錄顏色變化，如圖1，可以明顯觀察到黃色與紫色（紫紅）的對比。隨著培養時間的延長，平板顏色逐漸出現變化，且顏色變化與生長時間和菌苔量均有關：不同菌株出現顏色變化的時間不同；已經出現顏色變化的培養基隨時間變化顏色更加鮮明（即黃色更黃，紫紅色更深）；所有菌株在培養5 d后，顏色不再變化。

41株細菌檢測結果匯總見表1，結果表明：41株菌中，產組胺、酪胺和腐胺的比例分別為39.0 %、56.1 %和31.7 %，7株菌的3種胺檢測平板均為陰性；14株短乳桿菌中5株產組胺、7株產酪胺、6株產腐胺；6株干酪乳桿菌中3株產組胺、4株產酪胺、4株產腐胺；6株植物乳桿菌中3株產組胺、2株產酪胺、2株產腐胺；8株羅旺促桿菌中3株產組胺、7株產酪胺，但無菌株產腐胺；L4和L23檢測結果為產組胺和酪胺，不產腐胺；L47和L2檢測只產酪胺。產胺的菌株無菌種、菌屬特異性，但有菌株特異性。

圖1 生物胺檢測平板結果

2.2特異序列PCR擴增檢測產組胺和酪胺細菌

酪氨酸脫羧酶基因和組氨酸脫羧酶PCR擴增條帶的電泳圖如圖2，擴增條帶與目標條帶大小相符，且條帶清晰，方法穩定，說明該方法可用于檢測組胺和酪胺產生菌。41株菌的PCR檢測結果見表1。結果表明：41株菌中，產組胺、酪胺的比例分別為24.4 %和53.7 %，15株菌的酪氨酸脫羧酶和組氨酸脫羧酶的擴增結果均為陰性；10株菌攜帶組氨酸脫羧酶基因，其中14株短乳桿菌中6株檢出，6株干酪乳桿菌中3株檢出，另有1株羅旺醋桿菌；23株菌攜帶酪氨酸脫羧酶基因，14株短乳桿菌全部檢出，6株干酪乳桿菌中3株檢出，6株植物乳桿菌中4株檢出，另有1株羅旺醋桿菌和1株戊糖片球菌。其他菌檢測不到目標條帶。綜上分析，短乳桿菌攜帶這2種脫羧酶基因的比例最大。

注：左為tdc引物TD2/ TD5，右為hdc引物HDC1/ HDC2；M.maker DL2000；泳道1～9依次為L2、L3、L5、L6、L7、L36、L37、L40、L46 PCR產物。圖2 細菌酪氨酸脫羧酶基因和組氨酸脫羧酶擴增序列電泳圖

2.3 HPLC法分析細菌產胺能力

按照1.2.3方法對41株分離菌的產生物胺的能力進行初步評價，檢測結果見表1和表2。結果表明：41株菌中，產組胺、酪胺和腐胺的比例分別為26.8 %、87.8 %和43.9 %，2株菌的3種培養基中未檢出3種胺；醋桿菌和芽孢桿菌不產生組胺，只有1株片球菌L4產生少量組胺，28株乳桿菌中有2株菌產組胺含量在2.00～10.00 mg/L，另外有8株乳桿菌也產生少量組胺；41株細菌中產酪胺的細菌數最多，只有4株不產酪胺，產酪胺最多的菌集中在短乳桿菌，有10株短乳桿菌產酪胺的量超過50.00 mg/L，2株干酪乳桿菌、2株植物乳桿菌和2株芽孢桿菌產酪胺的含量在10.00～50.00 mg/L之間；產腐胺的菌也多屬于乳酸菌，尤其是短乳桿菌和干酪乳桿菌。

綜上分析，細菌產生物胺的能力無種屬特異性，但短乳桿菌中產生物胺的菌株數量和生物胺含量高的菌株數量都比其他菌種大；細菌產生物胺的能力有菌株特異性，即同種屬不同菌株產生物胺的能力不同。

2.4檢測產胺微生物的方法比較

顯色培養基法、特異序列PCR法和HPLC法檢測41株產胺微生物，檢測結果進行對比，見表1。顯色培養基檢測結果表明，23株菌中至少1種胺的檢測平板為陽性；PCR快速檢測結果表明，25株菌攜帶組氨酸或酪氨酸脫羧酶基因，HPLC法表明39株菌的培養液檢測至少含有1種胺。3種檢測方法結果不完全相符，但大致相同，說明3種方法有各自的優點和缺陷性，互補使用能夠準確分析待測細菌產生物胺的情況。

3種檢測方法各有利弊。顯色培養基法受顯色劑、pH值、氧氣等諸多因素影響，容易出現假陽性和假陰性現象，但檢測周期短，操作簡單，成本低，可以作為初步篩查乳酸菌產胺情況的手段。PCR檢測技術快速、簡便，但檢測到的陽性菌僅說明其攜帶脫羧酶基因，具有產生物胺的潛在可能性，但基因是否表達和脫羧酶是否具有活性都是不確定的，因此此方法是具有前瞻性的方法。HPLC法可以直接分析培養液中的生物胺種類和含量，比較各菌株之間的產胺能力，但僅能說明在某一特定條件下的細菌產胺情況，受培養基質等諸多因素的影響。

3　小結與討論

表1 41株細菌產胺能力的3種方法檢測結果

細菌代謝是否產生物胺及產生物胺的能力無種屬特異性，但有菌株特異性。

細菌代謝氨基酸產生相應生物胺應是黃酒生物胺的主要來源，尤其是乳酸菌。短乳桿菌從產生物胺的菌株數量比和產胺能力強的菌株數量比來看都是對黃酒生物胺影響最大的菌株，且短乳桿菌產酸有惡臭[2]，會影響黃酒的風味品質。

芽孢桿菌和醋酸菌為黃酒釀造有害菌，因此應嚴格控制。乳酸菌是黃酒釀造過程中必不可少的微生物，也是黃酒生物胺的主要來源。研究發現，許多乳酸菌不產生物胺或只產生少量毒性較小的生物胺，如干酪乳桿菌L37。另外，已有報道許多細菌能降解生物胺，這些細菌代謝產生胺氧化酶，催化生物胺生成醛[12-13]。因此，高效利用此類無氨基酸脫羧酶活性或胺氧化酶活性較大的優良乳酸菌，實現混合菌株的現代化和機械化發酵形式，是解決黃酒生物胺安全問題最有效和最根本的措施，如生物酸化浸米[14-15]。但目前黃酒釀造技術相對落后，要想實現現代化發酵形式存在很多困難，也需要更加深入的研究。

參考文獻：

[1]欒同青,李志軍,鐘其頂,等.黃酒釀造過程細菌群落結構變化初步研究[J].食品工業科技, 2013(12)：177-180.

[2]張鳳杰,褚小米,薛潔,等.黃酒釀造過程中細菌群落組成及發酵特性研究[J].釀酒科技, 2013(12)：32-35.

[3]壽虹志,凌志勇,楊旭,等.淺析黃酒麥曲中的微生物與黃酒風味的關系[J].中國釀造,2007(8)：59-61.

[4]李曉敏,王霈虹,吳殿輝,等.黃酒發酵液中產瓜氨酸乳酸菌的分離鑒定與評價[J].釀酒科技, 2015(6)：11-15.

[5]方若思,董亞晨,徐騰洋,等.精氨酸代謝酶對傳統黃酒發酵氨基甲酸乙酯產生的調控作用[J].浙江大學學報：農業與生命

科學版,2013(2)：203-208.

[6]周韓玲,杜麗平,孟鎮,等.黃酒發酵液中產生物胺乳酸菌的分離鑒定與評價[J].食品與發酵工業,2011(8)：47-50.

[7] Nout M J R. Fermented foods and food safety[J]. Food Research International, 1994，27(3)：291-298.

[8]張敬,趙樹欣,薛潔,等.發酵型飲料酒中生物胺含量的調查與分析[J].食品與發酵工業, 2012(6)：165-170.

[9]張鳳杰,薛潔,王異靜,等.黃酒中生物胺的形成及其影響因素[J].食品與發酵工業, 2013(2)：62-68.

[10]張無疾,夏小樂,張斌,等.黃酒前酵中生物胺生成規律的研究[J].現代食品科技, 2015(10)：1-9.

[11] Bover-Cid S, Holzapfel W H. Improved screening procedure for biogenic amine production by lactic acid bacteria[J]. International Journal of Food Microbiology, 1999, 53 (1)： 33-41.

[12] Ohya T. Identification of 4-methylspinaceamine, a Pictet-Spengler condensation reaction product of histamine with acetaldehyde, in fermented foods and its metabolite in human urine[J]. JAgric Food Chem, 2006, 54(18)：6909-6915.

[13] Hisano T,Abe S, Wakashiro M, et al. Microbial spermidine dehydrogenase: purification and properties of the enzyme in Pseudomonas aeruginosa and Citrobacter freundii[J].J Ferment Bioeng, 1990, 69(6)：335-340.

[14]程斐,周高峰,謝廣發,等.適用于黃酒生物酸化浸米的乳酸菌篩選[J].食品與生物技術學報, 2013(10)：1079-1084.

[15]謝廣發,曹鈺,程斐,等.應用生物酸化浸米技術生產黃酒[J].食品與生物技術學報, 2014(2)：217-223.

Detection of Biogenic Amines Produced by Predominant Bacteria in Yellow Rice Wine Brewing Process

ZHANG Fengjie, WANG Deliang，XUE Jie and YAN Yinzhuo
(China National Research Institute of Food and Fermentation Industries, Beijing 100027,China)

Abstract:The change of biogenic amines (produced by 41 bacteria strains in yellow rice wine brewing process) content in decarboxylase liquid culture medium was analyzed by three methods including chromogenic medium method, decarboxylase sequence specific PCR and HPLC. The results showed that the three methods obtained similar results, and the complementary use of the three methods could accurately analyze biogenic-amines-producing status as follows: over 53.7 % of 41 bacteria strains could produce tyramine, over 31.7 % of them could produce putrescine and over 24.3 % of them could produce histamine; 14 strains of Lactobacillus brevis were carrying a tyrosine decarboxylase gene and tyramine yield from 11 strains of them exceeded 50.00 mg/L, and most of them could produce various biogenic amines (it could be inferred that those bacteria strains had the strongest influence on biogenic amines content in yellow rice wine); whether bacterial metabolism produced biogenic amines was not species-specific, but strains-specific.

Key words:yellow rice wine; bacteria; biogenic amines; chromogenic medium; PCR; HPLC

作者簡介：張鳳杰，女，碩士，工程師，主要從事黃酒釀造研究，E-mail：zhangfengjie86@126.com。

收稿日期：2015-11-16

基金項目：科技部院所基金項目（2014EG111217），國家自然科學基金青年基金（31401680）。

DOI：10.13746/j.njkj.2015436

中圖分類號：TS262.4；TS261.4；TS261.1

文獻標識碼：A

文章編號：1001-9286（2016）04-0017-04

優先數字出版時間：2016-02-25；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160225.1742.007.html。