響應面法優化酵母增殖培養基

牛希躍，任曉鏷，葉　林，蘭鴻珠，許　倩（.塔里木大學生命科學學院，新疆阿拉爾843300；2.南疆特色農產品深加工兵團重點實驗室，新疆阿拉爾843300)

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響應面法優化酵母增殖培養基

牛希躍1，2，任曉鏷1，2，葉林1，2，蘭鴻珠1，許倩1，2
（1.塔里木大學生命科學學院，新疆阿拉爾843300；2.南疆特色農產品深加工兵團重點實驗室，新疆阿拉爾843300)

摘要：為評價培養基成分（碳源、氮源、生長因子等)對酵母菌生長量的影響，利用Plackett-Burman實驗研究主要影響因素，經最陡爬坡實驗確定各因素峰值，再利用響應面法優化主要影響因素。結果表明，最適培養基配方為蔗糖58 g/L、蘋果汁22 mL/L、蛋白胨12 g/L、馬鈴薯汁10 mL/L、酵母粉10 g/L、氯化鈣0.1 g/L、磷酸氫二鉀1 g/L，在pH4.5條件下28℃培養24 h，酵母菌的生長量為8.8748 cfu/mL。優化后的培養基與傳統的YPD培養基（8.5543 cfu/mL)相比，酵母菌菌數提高明顯。

關鍵詞：酵母；培養基；PB設計；響應面

酵母菌為半子囊菌綱內孢霉目酵母科酵母菌屬[1]，是一種單細胞真核微生物[2]。在發酵工業中，由于培養基種類繁多，培養基的成分對產物濃度、菌體生長都有重要影響，因此優化微生物培養基就顯得尤為重要[3]。

響應面法（Response Surface Methodology，RSM)優化培養基的實驗設計步驟為：利用Plackett Burman（PB)實驗篩選出幾個重要的影響因素對其進一步研究[4]。用最陡爬坡實驗以實驗值變化的梯度方向為爬坡方向，根據各因素效應值的大小確定變化步長，快速逼近最佳值區域[5]。通過BBD（Box Benken Design)或CCD（Central Composite Design)方法確定實驗點，利用統計分析軟件，確定最佳的實驗條件及各因素間的相互作用。

黃麗金等[6]采用PB設計篩選出德氏乳桿菌保加利亞亞種LB14的生長強化因子為番茄汁、胡蘿卜汁以及關鍵因子——培養基的初始pH值。以旋轉中心組合設計及響應面法確定生長強化因子的最佳濃度及培養基的初始pH值。采用優化培養基培養，LB14的菌體濃度達到1.1×109cfu/mL，比優化前的2.4×108cfu/mL提高了近5倍。

呂國英等[7]采用PB設計評價影響香菇多糖產量主要因素為葡萄糖、魚粉和KH2PO4；用最陡爬坡路徑逼近3個因素的最大響應區域，通過Box-Behnken設計及響應面分析確定了主要影響因素的最佳濃度。結果表明，優化后的培養基中，粗多糖產量為2.33 g/L，比初始培養基提高了1.91倍。

本實驗以酵母菌為研究對象，以單因素實驗為基礎，運用PB法篩選影響酵母菌生長的主要因素。以篩選出的因素為變量，以酵母菌生物量為響應值，運用響應面對培養基進行優化，以期獲得最佳的培養基配比，從而提升酵母菌的收獲量。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

菌株及耗材：分離自阿克蘇紅富士蘋果皮的酵母菌M19；阿克蘇紅富士蘋果；蛋白胨、葡萄糖、牛肉膏、磷酸氫二鉀、氯化鈉、酵母粉、氫氧化鈉等均為分析純。

V2200型分光光度計，上海舜宇恒平科學儀器有限公司；Hi2211型酸度計，意大利哈納儀器公司；HPX-9162 MBE型電熱恒溫培養箱、SWCJ-2FD型潔凈工作臺，上海博迅實業有限公司；LDZX-50KB型立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫療器械廠；EL204-IC型電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海)有限公司；CX21FS1-2型生物顯微鏡，日本奧林巴斯光學工業株式會社；JYL-0051型榨汁機，九陽股份有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1菌種活化

將酵母M19接入YPD液體培養基中，活化3次后以3 %（106cfu/mL)的接種量接入到各培養基中，28℃培養24 h后測定菌體的生長量。

1.2.2 PB實驗

本實驗選取7個影響因素作為研究對象，PB實驗設計表選用7因素，N=16次的實驗表格，每組實驗做3個平行，取平均值。分析實驗結果，比較各因素對酵母菌生長量的影響。

1.2.3爬坡設計

根據PB實驗結果中各個顯著影響因素效應的大小來設定步長及變化方向，找出峰值，以逼近最佳響應區域。

1.2.4中心組合設計

根據爬坡實驗結果，利用Design Expert軟件的旋轉中心組合法對主要影響因素進行3因素3水平響應面分析設計。每個實驗重復3次，取平均值。

1.2.5統計與分析

運用Design expert軟件對實驗結果進行擬合，并對擬合方程做顯著性檢驗及方差分析。

1.2.6驗證實驗

比較M19在普通YPD培養基和響應面法優化的培養基中的生長量從而評價優化后的培養基。

2　結果與討論

2.1 PB實驗

根據實驗室及相關研究結果[8]，本實驗選取7個因素，蔗糖（X1)、蛋白胨（X2)、酵母粉（X3)、磷酸氫二鉀（X4)、氯化鈣（X5)、蘋果汁（X6)、馬鈴薯汁（X7)作為研究對象，PB實驗選用7因素，N=16次的實驗表格，影響因子及編碼見表1。利用Design expert軟件分析實驗結果，比較各因素對酵母菌生長量的影響，篩選主要影響因素。

各影響因素主效應分析結果見表2，從表2可以看出，7個因素中對響應值（酵母菌菌數)影響的順序依次為蘋果汁、蔗糖、蛋白胨、馬鈴薯汁、酵母粉、氯化鈣、磷酸氫二鉀。因此將馬鈴薯汁、酵母粉、氯化鈣、磷酸氫二鉀這4個顯著性較低的因素設定在一個較好的水平上，選擇蘋果汁、蔗糖、蛋白胨這3個因素進行下一步實驗。

表1 N=16的PB實驗設計及結果

表2 PB實驗設計因素水平及顯著性檢驗

2.2爬坡實驗

由PB實驗可知（表2)，在酵母菌M19培養過程中，蔗糖因素產生了顯著影響，具有正效應，應增加；蘋果汁和蛋白胨都為負效應，應減少[9-10]，根據這2個因素效應大小的比例設定它們的變化方向及步長進行實驗，設計及結果見表3。

2.3響應面實驗

由最陡爬坡實驗（表3)可知，第5組實驗時酵母菌菌數獲得最大值，因此選定實驗5的水平作為響應面的實驗中心點[11]。利用Design Expert軟件中旋轉中心組合對酵母菌培養基進行3因素3水平響應面分析，因素水平及實驗結果見表4及表5。表5中的15個實驗點可以分為兩類：一是零點，為區域的中心點，零點實驗重復3次，用以估計實驗誤差；二是析因點，共有12個析因點，自變量在X1、X2、X3所構成的三維頂點取值。

表3 爬坡實驗設計及結果

表4 響應面因素水平表

表5 實驗方案與結果

2.4數據分析

根據表5的實驗結果利用Design Expert軟件對下表進行多元回歸分析，經回歸擬合后，實驗因子對響應值的影響可以得到二次多項回歸方程：

式中：Y代表酵母菌菌數[Log（cfu/mL)]；Xa、Xb、Xc分表代表蘋果汁、蔗糖、蛋白胨。各項系數的絕對值大小反映各因素對響應值的影響程度，系數的正負反映影響的方向[12]。

由該模型的方差分析（表6）可以看出，失擬項的P= 0.2575＞0.05，不顯著，說明本實驗無其他顯著影響因素，實驗模型的失擬度好，可以用該模型分析預測酵母菌菌數[13]。模型的P值小于0.01（P=0.0001)，說明模型極顯著；用上述回歸方程來反映各因子與響應值之間的關系，其自變量和因變量之間的線性關系是顯著的。

表6 二次多項回歸模型方程方差分析

表7 二次多項回歸模型方程系數顯著性檢驗

由表7可看出，Xb因素對酵母菌生長量的線性影響是顯著的，Xa2、Xb2、Xc2對酵母菌菌數的曲面效應亦顯著；交互項中的XaXb對酵母菌菌數的交互效應影響顯著[14]；其余影響不顯著，可以忽略，可得出回歸方程：

根據上述回歸方程作出的響應面分析圖見圖1。

圖1為蘋果汁與蔗糖的等高線圖，因等高線的形狀可反映出交互效應的強弱大小，圓形表示兩因素交互作用不顯著，而橢圓形則與之相反[15]，從其等高線圖可以看出此兩因素的交互作用顯著。由圖1可知，當蛋白胨的量達到最好時（12 g/L)，蘋果汁的水平點為中心點24 mL/L時，在實驗范圍內隨著蔗糖量的增加，酵母菌菌數不斷增長，且曲線較陡，說明蔗糖量的變化對酵母菌菌數的影響較大。當蔗糖的量增加到中心點附近時，酵母菌菌數達到最大；隨著蔗糖量的進一步加大，酵母菌菌數減少，說明高濃度蔗糖對酵母菌的生長有抑制作用。當蔗糖含量在中心點56 g/L時，酵母菌菌數隨著蘋果汁的增加而增加，在中心點附近達到最大值。之后隨著蘋果汁量的增加，酵母菌菌數增長較平穩。

2.5驗證性實驗

為了驗證優化培養基增菌效果的可靠性，用其進行了5個平行的驗證實驗，普通YPD培養基進行了3個平行的驗證實驗，驗證實驗培養基的菌數為8.8748 cfu/mL，而普通YPD培養基的菌數為8.5543 cfu/mL。

圖1 響應面法（X1，X2)立體分析圖

3　結論與總結

通過單因素實驗，確定酵母菌（M19)最適生長溫度及pH值，然后用PB實驗評價影響酵母菌生長的主要因素，篩選出具有顯著效果的3個因素分別為蔗糖、蘋果汁、蛋白胨。在此基礎上經最陡爬坡路徑實驗找出其峰值，逼近最佳相應區域后，對影響酵母菌生長量3個主要因素的最佳水平及其交互作用進行了研究和探討，利用響應面法優化酵母菌培養基配方。最終得到最適培養基配方為蔗糖58 g/L、蘋果汁22 mL/L、蛋白胨12 g/L、馬鈴薯汁10 mL/L、酵母粉10 g/L、氯化鈣0.1 g/L、磷酸氫二鉀1 g/L、溫度28℃，培養基pH4.5條件下培養3 d，酵母菌的生長量為8.8748 cfu/mL。優化后的培養基與傳統的YPD培養基（8.5543 cfu/mL)相比，酵母菌菌數提高明顯。

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茅臺2016年一季度各項指標均超兩位數增長

本刊訊：據《新華網》報道，從2016年3月14日召開的貴州全省白酒產業座談會上獲悉，貴州茅臺集團在2016年一季度實現了超級旺季的銷售業績，各項指標均超過兩位數的增長。

茅臺一季度各項指標暴漲，預計一季度，茅臺集團可完成增加值130億元左右，同比增長37 %以上，占全年計劃398億元的32 %；實現銷售收入150億元左右，同比增長41 %，占全年計劃436億元的34 %；實現利潤總額75億元左右，同比增長約26 %，占全年計劃231億元的32 %。

2016年茅臺集團的總體目標是完成工業增加值398億元，同比增長5 %左右；完成白酒產量7.8萬噸，其中茅臺基酒4萬噸；完成白酒銷量7.5萬噸，同比增長10 %以上；實現銷售收入436億元，同比增長4.2 %；實現利潤總額231億元，同比增長1.7 %，實現稅金165億元左右。（江源薦，駱佳龍編輯）

來源：新華網2016-03-18

Optimization of Yeast Culture Medium by Response Surface Method

NIU Xiyue1,2, REN Xiaopu1,2, YE Lin1,2, LAN Hongzhu1and XU Qian1,2
（1.College of Life Sciences, Tarim University,Alar, Xinjiang 843300；2. Key Lab of Deep-processing of Special Agricultural Products,Alar, Xinjiang 843300, China)

Abstract:In order to evaluate the effects of culture medium compositions（carbon source, nitrogen source, growth factors etc.) on the growth rate of yeast, the main influencing factors were determined by Plackett-Burman design. On the basis of the most steep climb path experiment, the peak values of those factors were determined and those factors were then optimized by response surface method as follows: sucrose 58 g/L, apple juice 22 mL/L, peptone 12 g/L, potato juice 10 mL/L, yeast powder 10 g/L, calcium chloride 0.1 g/L, dipotassium hydrogen phosphate 1 g/L, and the growth rate of yeast was 8.8748 cfu/mL after 24 h culture at 28℃and pH 4.5. Compared with traditional YPD culture medium （8.5543 cfu/mL), yeast quantity in the optimized culture medium increased by 2 times.

Key words:yeast; culture medium; PB design; response surface method

通訊作者：許倩，E-mail：xuqiantaru@126.com。

作者簡介：牛希躍（1978-），男，碩士，實驗師，研究方向為農產品加工，E-mail：hljnxy@126.com。

收稿日期：2015-12-23

基金項目：兵團工業科技攻關項目（2014BA026）；南疆特色農產品深加工兵團重點實驗室開放課題（AP1503）；國家自然科學基金項目（31260393）。

DOI：10.13746/j.njkj.2015476

中圖分類號：TS261.1；TS262.3；Q93-3

文獻標識碼：A

文章編號：1001-9286（2016)04-0047-04

優先數字出版時間：2016-02-02；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160202.1326.002.html。