低色素高產普魯蘭多糖生產菌株的篩選

張雪亮

（浙江順風海德爾有限公司，浙江金華322100）

低色素高產普魯蘭多糖生產菌株的篩選

張雪亮

（浙江順風海德爾有限公司，浙江金華322100）

本研究對短梗霉3.4580菌株用紫外線照射處理，獲得變異菌種PL052的糖耐受濃度提高到15%，多糖最高產量在108g/L，且發酵液無色素或色素淡化。通過對變異菌種PL052進行遺傳穩定性試驗，結果顯示，該菌株遺傳穩定，可望應用在工業化生產中。

普魯蘭多糖；紫外線；低色素；高產

普魯蘭多糖（Pullulan），是出芽短梗霉屬（Aureobasidium pullulans）的微生物利用糖質原料發酵產生的細胞外多糖，因此又名短梗霉多糖。該多糖易溶于水，無毒、無味，可食用；具有優良的可塑性、成膜性，其制成的薄膜隔氣性好，在自然界可被微生物降解，不會引發環境污染，故被譽為無公害塑料。由于其獨特的物理化學性質和生物特性，使其在應用中具有其他產品無法替代的優點，在醫藥、食品、化妝品和農藥等行業具有廣泛的用途。

2006年5月19日，國家衛生部發布了第8號公告，普魯蘭多糖為新增4種食品添加劑產品之一，國內企業紛紛介入。尤其2012年毒膠囊事件的爆發，歐美發達國家對動物性來源的原料擔憂，普魯蘭多糖替代明膠做膠囊成了一個首選。但現有普魯蘭多糖菌種產率低，且出芽短梗霉會分泌黑色素，這種物質會牢固地粘附在普魯蘭多糖上，很難用一般方法除去，限制了普魯蘭多糖的工業化規模生產。

本研究現通過對短梗霉3.4580菌株用紫外線照射處理，獲得一株產色素少且糖的產量較高的突變株，為下一步工業化生產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 菌種

出芽短梗霉3.4580，購于中國科學院微生物研究所菌種保藏中心。

1.2 培養基

①斜面，麥芽汁瓊脂；②種子培養基[蔗糖5%，酵母膏0.25%，（NH4）2SO40.05%，KH2PO40.5%，MgSO4·7H2O 0.02%，NaCl 0.1%]，pH 6.0，121℃，滅菌30min；③發酵培養基[蔗糖15%，酵母膏0.3%，（NH4）2SO40.05%，KH2PO40.5%，MgSO4·7H2O 0.02%，NaCl 0.1%]，pH 6.0，121℃，滅菌30min。

1.3 培養方法

①斜面培養，保溫箱28～30℃，培養72h；②種子培養條件，250mL三角瓶裝種子培養基50mL，接斜面種子一環，28～30℃ 220rpm搖床培養24h；③發酵培養條件，250mL三角瓶裝發酵培養基50mL，接種量為5%，28～30℃ 280rpm搖床培養3d。

1.4 細胞生長的測定

量取發酵液，1萬rpm離心30min，上清液倒出測定多糖含量，沉淀的菌體用蒸餾水洗滌3遍后，在105℃烘干后稱重。以細胞干重表示細胞生長。

1.5 發酵液粗多糖含量的測定

準確吸取上述測定細胞生長的上清液，加入2倍體積的乙醇，充分混合均勻，再靜置5min左右沉淀多糖。4 000rpm離心10min，小心傾出上清液，得多糖沉淀，用乙醇洗滌3次，70℃干燥至恒重，即為普魯蘭多糖粗品，稱重計算產量。

1.6 孢子懸浮液的制備

將斜面菌種轉入液體培養基中，28℃ 220rpm活化24h，再轉接培養12～16h，達到對數期，鏡檢涂片分布大量酵母狀孢子時，放入裝有玻璃珠的三角瓶劇烈振蕩10～15min，打碎孢子團快，用脫脂棉過濾。血球計數板計數，用無菌生理鹽水調整孢子濃度到約106個/mL。

1.7 誘變處理

取上述懸浮液5mL于平板上，將平板置于紫外燈下30cm處，打開紫外燈，各平板分別照射不同時間后，放入30℃的培養箱中培養，檢測紫外線照射處理的致死率，將長出的菌落移接于麥芽汁固體斜面上。待斜面培養成熟后，轉接入三角瓶發酵培養基中，搖瓶發酵檢測多糖產量，篩選高產菌株。

2 結果與分析

2.1 誘變結果

出芽短梗霉菌株具有復雜的生活周期，在其生長過程中細胞形態常有如下5種變化：酵母狀、芽孢子、腫脹孢子、菌絲體和厚垣孢子。一般取酵母狀孢子對紫外線較敏感。在實際試驗中，通常采用照射距離為30cm。3.4580菌株按上述方法制備孢子懸浮液，用30W紫外燈照射后，各平板共挑選出突變株168株，經篩選有16個株多糖產量有不同程度的提高。檢測致死率和正突變率列于表1。表1結果顯示，照射時間越長，致死率越高；照射時間對正突變率的影響沒有明顯的規律。

表1 紫外線照射誘變的結果

2.2 出發菌株和變異菌株的菌落特征比較

菌落特征反映了菌株的性能，菌落大小體現了菌體繁殖速度與多糖產量的高低，以大者為優。發酵液顏色與菌落顏色基本一致，菌落顏色淺，發酵液顏色也淺，以乳白色為優。采用觀察菌落特征的方法篩選多糖產量高而色素低的優良菌株，大大簡化了菌種篩選的步驟，縮短了篩選時間。

出發菌株3.4580在麥芽汁固體培養基上生長48h后，菌落中央開始出現黑色絨毛狀菌絲，搖瓶培養也在同一時間培養液變成綠黑色；而誘變而來的菌株PL052在麥芽汁固體培養基上培養6～7d后才產生灰黑色孢子，搖瓶培養中都末見有黑色素出現，PL052在搖瓶培養過程中，發酵液一直呈現黃白色。出發菌株3.4580的糖耐受濃度只有5%，多糖產量只有10～20g/L,而PL052的糖耐受濃度大大提高，初始糖濃度可達15%，多糖產量100g/L左右，生產效率提高明顯。與出發菌株3.4580相比，突變菌株PL052的菌落明顯大于出發菌種。

2.3 誘變菌株的遺傳穩定性分析

將誘變菌株PL052連續傳代培養，共20代，取第5、10、15、18和20代作搖瓶多糖發酵試驗，結果誘變菌株PL052的發酵液最終顏色為黃白色，多糖產量維持在83～108g/L，最高產量為108g/L。由此可見，誘變菌株PL052是穩定的。

3 結論

出發菌株3.4580的多糖產量在10～20g/L，糖耐受濃度為5%，通過紫外線誘變，獲得的變異菌株PL052的糖耐受濃度提高到15%，多糖產量穩定在83～108g/L，且無色素或色素淡化，說明誘變效果顯著，多糖生產效率提高幅度較大。誘變菌株PL052經連續傳代培養，結果顯示，該菌株遺傳穩定，具有在工業化生產中應用的潛力。

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Screening of Low Pigment and High Producing Pullulan Production Strain

Zhang Xue liang
(Zhejiang Shunfeng Haider Limited Company,Zhejiang Jinhua322100)

Ultraviolet irradiation treatment of A ureobasidium pullulans 3.4580 strain,A mutants strain PL052 was obtained,which the sucrose tolerance concentration was increased to 15%,The highest producing of pullulan was 108g/L,and the fermentation solution had no pigment or hypopigmentation.Through the genetic stability test of the mutant strain PL052,The results showed that the genetic stability of the strain could be used in industrial production.

pullulan;UItraviolet;low pigment;High yield

TQ920.1

A

2096-0387（2016）06-0027-03

張雪亮（1970-），男，浙江東陽人，大專，工程師，研究方向：生物發酵。