綿羊肺腺瘤病毒SU蛋白與Hyal-2蛋白的結合域研究

張月梅，趙世華,么宏強，馬學恩

(1.內蒙古農業大學獸醫學院，內蒙古呼和浩特 010018; 2.內蒙古農牧業科學院獸醫研究所，內蒙古呼和浩特 010031)

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綿羊肺腺瘤病毒SU蛋白與Hyal-2蛋白的結合域研究

張月梅1,2，趙世華2,么宏強1*，馬學恩1*

(1.內蒙古農業大學獸醫學院，內蒙古呼和浩特 010018; 2.內蒙古農牧業科學院獸醫研究所，內蒙古呼和浩特 010031)

摘要：試驗證明綿羊的Hyal-2不僅可以與綿羊肺腺瘤病毒的囊膜蛋白Env結合，也可以單獨與綿羊肺腺瘤病毒SU蛋白亞基結合。為了進一步研究綿羊Hyal-2與SU蛋白可能結合的區域，應用在線生物學軟件預測了SU蛋白的膜外區(對應編碼基因序列238 bp～867 bp)將之前已經構建的缺失型SU蛋白真核表達載體pEGFP-C1-(su1-su5)與pDsRed-monomer-N1-hyal-2共轉染293T細胞，運用激光共聚焦方法結合免疫共沉淀方法確定SU蛋白和Hyal-2蛋白可能結合區域。激光共聚焦顯微鏡觀察結果表明,SU1-SU5與Hyal-2均存在細胞內共定位。免疫共沉淀方法檢測缺失型蛋白SU1-SU5與綿羊Hyal-2均不存在相互作用。su基因所缺失區域238 bp～867 bp對于SU蛋白與受體的結合都是必不可少的。

關鍵詞：綿羊肺腺瘤病毒；SU蛋白；Hyal-2蛋白；結合區域

綿羊肺腺瘤病(OPA)是由綿羊肺腺瘤病毒(Ovine pulmonary adenomatosis virus,OPAV)引起的自然發生的一種慢性進行性接觸傳染性的支氣管肺泡腺癌[1-2]，其特點是肺泡上皮細胞增殖和肺液的過量產生。該病毒的本質是一種逆轉錄病毒，并且它是已知的唯一在自然條件下可以引起綿羊肺腺瘤的病毒[1]。OPAV的細胞受體是一個糖基化磷脂酰肌醇(gycosylphosphatidylinositol，GPI)-錨定蛋白，稱為透明質酸酶2(Hyal-2)。對應于人類染色體3p21.3，這是一個腫瘤抑制區[3-4]。在綿羊、人、猴、牛、狗、兔細胞中，OPAV能夠利用Hyal-2作為受體，但在大鼠、小鼠或者倉鼠不能使用Hyal-2作為受體[5]。與透明質酸酶其他家庭成員相比，Hyal-2具有非常弱的活性，但是作為外源性OPAV和內源性OPAV的 Env蛋白的一個有效受體起作用[4,6]。外源性OPAV的SU結構域在體外可以直接與人類Hyal-2相互作用介導病毒進入人類和大鼠的細胞[7]。為了驗證綿羊的Hyal-2與SU相互作用時SU可能參與的結合區域，本試驗運用激光共聚焦結合免疫共沉淀法驗證了SU與Hyal-2可能結合的區域。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1模板及細胞真核表達載體pEGFP-C1-(su1-su5)和pDsRed-monomer-N1-hyal-2載體，內蒙古農業大學病理實驗室保存；293T細胞，內蒙古農業大學病理實驗室保存。

1.1.2主要試劑與儀器 Lipofectamine 2000、DMEM細胞培養液，購自Invitrogen公司；胎牛血清，購自TBD公司。Pierce Co-Immunoprecipitation (Co-IP) Kit、Anti-RFP(RF5R) mouse antibody，購自Thermo公司；Anti-GFP mouse antibody、Goat-anti mouse IgG HRP 抗體，購自EARTH OX公司。

電子天平，賽多利斯科學儀器有限公司產品；PCR儀，Biometra公司產品；迷你離心機，其林貝爾公司產品；凝膠成像系統，Sagecreation公司產品；電泳儀，Bio-Rad公司產品；離心機，Thermo公司產品；電熱恒溫水浴鍋，北京長安科學儀器廠產品；多功能酶標儀，GE Healthcare公司產品；超純水儀，Elga公司產品；恒溫水平搖床，太倉市實驗設備廠產品；制冰機，Graxt公司產品；微量移液器，Eppendorf公司產品；-80℃超低溫箱，Haier公司產品；超凈工作臺，Boxun公司產品；微波爐，格蘭仕公司產品；震蕩儀，Thermo公司產品；電熱恒溫培養箱、電熱鼓風干燥箱，上海一恒科技有限公司產品；滅菌鍋，Hirayama制造公司產品；核酸電泳儀，北京市六一儀器廠產品；熒光倒置顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡，Olympus公司產品。

1.2方法

1.2.1激光共聚焦顯微鏡觀察蛋白的共表達情況 pEGFP-C1-(su1-su5)真核表達載體為運用生物信息學軟件預測SU蛋白膜外區后，按照蛋白多肽從N端到C端順序分別缺失150個堿基(50個氨基酸)后，再通過重疊PCR連接缺失后兩個片段而構建的一系列真核表達載體。pDsRed-monomer-N1-hyal-2真核表達載體為運用重疊PCR方法擴增出hyal-2基因后構建的表達hyal-2的真核表達載體[8]。

轉染前24 h將狀態良好的293T細胞，用胰酶消化4 min左右，待細胞在鏡下觀察成為單個圓形后，迅速吸出胰酶，加入DMEM高糖含血無雙抗培養基，吹打均勻后，鋪細胞于激光共聚焦顯微鏡專用培養皿，第2天觀察細胞匯合度達80%以上進行共轉染試驗，于48 h后將細胞固定及核染，然后觀察細胞內目的蛋白的共表達及定位情況。共轉染的設計：

未轉染的細胞為陰性對照；pDsRed-monomer-N1-hyal-2和pEGFP-C1共轉染；pDsRed-monomer-N1和pEGFP-C1-su1共轉染；pDsRed-monomer-N1和pEGFP-C1-su2共轉染；pDsRed-monomer-N1和pEGFP-C1-su3共轉染；pDsRed-monomer-N1和pEGFP-C1-su4共轉染；pDsRed-monomer-N1和pEGFP-C1-su5共轉染；pEGFP-C1-su1和pDsRed-monomer-N1-hyal-2共轉染；pEGFP-C1-su2和 pDsRed-monomer-N1-hyal-2共轉染； pEGFP-C1-su3和 pDsRed-monomer-N1-hyal-2共轉染；pEGFP-C1-su4和 pDsRed-monomer-N1-hyal-2共轉染；pEGFP-C1-su5和 pDsRed-monomer-N1-hyal-2共轉染；每個共轉染孔兩個重復。于48h后在熒光顯微鏡下觀察熒光強度(結果略)。

之后應用免疫共沉淀試劑盒進行免疫共沉淀。

1.2.2免疫共沉淀法檢測蛋白相互作用將狀態良好的293T細胞，用胰酶消化4 min左右，待細胞在鏡下觀察成為單個圓形后，迅速吸出胰酶，加入DMEM高糖含血無雙抗培養基，吹打均勻后，將細胞鋪于10 cm細胞培養皿(每個樣品需3個)，次日待細胞融合度為80%左右，運用脂質體法進行轉染。

將構建好的缺失型真核表達載體pEGFP-C1-(su1-su5)分別與pDsRed- monomer-N1-hyal-2共轉染入24 h前鋪好的細胞培養皿，每組組合需要3個10 cm細胞培養皿。試驗分組設計原則同上，免疫共沉淀試驗步驟詳見Pierce Co-Immunoprecipitation (Co-IP) Kit說明書。

2結果

2.1共轉染的激光共聚焦顯微鏡的熒光觀察

由圖1可知，對照組的共轉染后細胞內的2種蛋白均不存在蛋白的細胞內共定位，即pEGFP-C1-(su1-su5)和pDsRed-monomer-N1共轉染的對照組和pEGFP-C1和pDsRed-monomer-N1-hyal-2共轉染的對照組均不存在細胞內蛋白的共定位。而pEGFP-C1-(su1-su5)和pDsRed-monomer-N1-hyal-2共轉染的樣品組存在蛋白的細胞內共定位情況。

2.2免疫共沉淀檢測結果

由圖2和圖3可知，用Anti-RFP(RF5R) mouse antibody作為檢測共轉染后免疫共沉淀試驗的檢測抗體檢測Hyal-2融合蛋白，發現除了共轉染pDsRed-monomer-N1-hyal-2和pEGFP-C1-su1的蛋白裂解液在81 ku出現陽性條帶，其他對照組和樣品組均未出現陽性條帶。

3討論

將構建好的缺失型真核表達載體pEGFP-C1-(su1-su5)與Hyal-2真核表達載體共同轉染293T細胞，由于Hyal-2真核表達載體pDsRed-monomer-N1-hyal-2中融合有紅色熒光蛋白DsRed，而缺陷型SU蛋白真核表達載體pEGFP-C1中融合有綠色熒光蛋白EGFP，可以在兩種攜帶目的基因的真核表達載體共轉后，在不同的激發光下觀察熒光的發生，從而確定兩種真核表達載體表達的目的蛋白是否能共表達在細胞中，以及通過激光共聚焦顯微鏡觀察共表達的目的蛋白的共定位情況。試驗結果表明，將pEGFP-C1-(su1-su5)真核表達載體與pDsRed-monomer-N1-hyal-2共轉染后均存在蛋白的細胞內共定位情況。但是從之前的試驗結果中pDsRed-monomer-N1-hyal-2單獨轉染后目的蛋白細胞內定位觀察及pEGFP-C1-(su1-su5)單獨轉染后目的蛋白的細胞內定位不難發現，無論是Hyal-2蛋白還是SU1-SU5蛋白均定位于細胞質中[8]，因此，相同的亞細胞定位并不能證明蛋白發生了相互作用。蛋白是否存在相互作用還需進行免疫共沉淀反應。最后通過SDS-PAGE和蛋白質免疫印跡方法鑒定蛋白是否存在相互作用。試驗結果表明，su1-su5基因所缺失的堿基序列均對于SU蛋白與Hyal-2蛋白的結合是必須的，即su基因的238 bp～867 bp對于與受體的結合都是必不可少的，這與Miller A D[9]的報道略有差異，可能是分段方法的不同引起的。

A1～A4.pDsRed-monomer-N1和pEGFP-C1-su1共轉染；B1～B4.pDsRed-monomer-N1和pEGFP-C1-su2共轉染；C1～C4.pDsRed-monomer-N1和pEGFP-C1-su3共轉染；D1～D4.pDsRed-monomer-N1和pEGFP-C 1-su4共轉染；E1～E4.pDsRed-monomer-N1和pEGFP-C1-su5共轉染；F1～F4.pDsRed-monomer-N1-hyal-2和pEGFP-C1共轉染；G1～G3.未轉染細胞(陰性對照)；H1～h1.pEGFP-C1-su1和pDsRed-monomer-N1-hyal-2共轉染；J1～J4.pEGFP-C1-su2和pDsRed-monomer-N1-hyal-2共轉染；K1～K4.pEGFP-C1-su3和pDsRed-monomer-N1-hyal-2共轉染；L1～L4.pEGFP-C1-su4和pDsRed-monomer-N1-hyal-2共轉染；M1～M4.pEGFP-C1-su5和pDsRed-monomer-N1-hyal-2共轉染

A1-A4.Cotransfection of pDsRed-monomer-N1 and pEGFP-C1-su1；B1-B4.Cotransfection of pDsRed-monomer-N1 and pEGFP-C1-su2；C1-C4.Cotransfection of pDsRed-monomer-N1 and pEGFP-C1-su3；D1-D4.Cotransfection of pDsRed-monomer-N1 and pEGFP-C1-su4；E1-E4.Cotransfection of pDsRed-monomer-N1 and pEGFP-C1-su5；F1-F4.Cotransfection of pDsRed-monomer-N1-hyal-2 and pEGFP-C1；G1-G3.Negative control；H1-h1.Cotransfection of pEGFP-C1-su1 and pDsRed-monomer-N1-hyal-2；J1-J4.Cotransfection of pEGFP-C1-su2 and pDsRed-monomer-N1-hyal-2；K1-K4.Cotransfection of pEGFP-C1-su3 and pDsRed-monomer-N1-hyal-2；L1-L4.Cotransfection of pEGFP-C1-su4 and pDsRed-monomer-N1-hyal-2；M1-M4.Cotransfection of pEGFP-C1-su5 and pDsRed-monomer-N1-hyal-2

圖1激光共聚焦顯微鏡的熒光觀察

Fig.1Fluorescent observation with laser confocal microscope

1.共轉染pDsRed-monomer-N1-hyal-2和pEGFP-C1-su1的蛋白裂解液；2.偶聯山羊抗鼠IgG對照，含有共轉染hyal-2-pDsRed-monomer-N1和pEGFP-C1-su1的蛋白裂解液；3.pEGFP-C1和pDsRed-monomer-N1-hyal-2共轉染蛋白免疫共沉淀對照；4.pEGFP-C1-su1和pDsRed-monomer-N1共轉染蛋白免疫共沉淀對照；5. pEGFP-C1-su2和pDsRed-monomer-N1共轉染蛋白免疫共沉淀對照；6.pEGFP-C1-su3和pDsRed-monomer-N1共轉染蛋白免疫共沉淀對照；7.pEGFP-C1-su4和pDsRed-monomer-N1共轉染蛋白免疫共沉淀對照；8.pEGFP-C1-su5和pDsRed-monomer-N1共轉染蛋白免疫共沉淀對照；M.蛋白分子質量標準

1.Lysis buffer of pDsRed-monomer-N1-hyal-2 and pEGFP-C1-su1 cotransfected in cells；2.Control of goat anti-mouse IgG；3.Co-immunoprecipitation control of pEGFP-C1and pDsRed-monomer-N1 cotransfected in cells；4.Co-immunoprecipitation control of pEGFP-C1-su1 and pDsRed-monomer-N1 cotransfected in cells；5.Co-immunoprecipitation control of pEGFP-C1-su2 and pDsRed-monomer-N1 cotransfected in cells；6.Co-immunoprecipitation control of pEGFP-C1-su3 and pDsRed-monomer-N1 cotransfected in cells；7.Co-immunoprecipitation control of pEGFP-C1-su4 and pDsRed-monomer-N1 cotransfected in cells；8.Co-immunoprecipitation control of pEGFP-C1-su5 and pDsRed-monomer-N1 cotransfected in cells；M.Protein molecular weight Marker

圖2免疫共沉淀檢測結果(1)

Fig.2Detection results of co-immunoprecipitation (1)

1.偶聯山羊抗兔IgG對照，共轉染hyal-2-pDsRed-monomer-N1和pEGFP-C1-su2的蛋白裂解液；2.共轉染hyal-2-pDsRed-monomer-N1和pEGFP-C1-su1的蛋白裂解液；3.pEGFP-C1-su1和pDsRed-monomer-N1-hyal-2共轉染蛋白免疫共沉淀；4.pEGFP-C1-su2和pDsRed-monomer-N1-hyal-2共轉染蛋白免疫共沉淀；5.pEGFP-C1-su3和pDsRed-monomer-N1-hyal-2共轉染蛋白免疫共沉淀；6.pEGFP-C1-su4和pDsRed-monomer-N1-hyal-2共轉染蛋白免疫共沉淀；7.pEGFP-C1-su5和pDsRed-monomer-N1-hyal-2共轉染蛋白免疫共沉淀；M.蛋白分子質量標準

1.Control of goat anti-miouse IgG；2.Lysis buffer of pDsRed-monomer-N1-hyal-2 and pEGFP-C1-su1 cotransfected in cells；3.Co-immunoprecipitation results of pEGFP-C1-su1and pDsRed-monomer-N1-hyal-2 cotransfected in cells；4.Co-immunoprecipitation results of pEGFP-C1-su2 and pDsRed-monomer-N1-hyal-2 cotransfected in cells；5.Co-immunoprecipitation results of pEGFP-C1-su3 and pDsRed-monomer-N1-hyal-2 cotransfected in cells；6.Co-immunoprecipitation results of pEGFP-C1-su4 and pDsRed-monomer-N1-hyal-2 cotransfected in cells；7.Co-immunoprecipitation results of pEGFP-C1-su5 and pDsRed-monomer-N1-hyal-2 cotransfected in cells；M.Protein molecular weight Marker

圖3免疫共沉淀檢測結果(2)

Fig.3Detection results of co-immunoprecipitation (2)

本試驗通過將缺失型pEGFP-C1-(su1-su5)真核表達載體，與pDsRed-monomer-N1-hyal-2共轉染將其轉入293T細胞中，實現了pEGFP-C1-(su1-su5)與pDsRed-monomer-N1-hyal-2在細胞內的共表達；運用激光共聚焦顯微鏡觀察到了各種組合下蛋白的細胞內定位情況，結果表明，SU1-SU5與Hyal-2均存在細胞內共定位。免疫共沉淀法結果證明，su1-su5基因所缺失的堿基序列238 bp～867 bp對于SU蛋白與Hyal-2蛋白的結合是必須的。

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Study on Possible Binding Region Between SU Protein of Ovine Pulmonary Adenomatosis Virus and Hyal-2 Protein

ZHANG Yue-mei1,2, ZHAO Shi-hua2，YAO Hong-qiang1, MA Xue-en1

(1.CollegeofVeterinaryMedicine,InnerMongoliaAgriculturalUniversity,Huhhot,InnerMongolia,010018,China;2.InstituteofVeterinaryMedicine,InnerMongoliaAcademyofAgriculturalandAnimalHusbandry,Huhhot,InnerMongolia,010031,China)

Abstract:The experimental results have shown that the Hyal-2 can not only be combined with the Env protein of Ovine pulmonary adenomatosis virus(OPAV),but also can be combined with the SU protein of OPAV.To design the experiment for further studying the possible binding regions of Hyal-2 and SU protein,the extracellular domain of SU protein was predicted by using online biology software(238 bp-867 bp). pEGFP-C1- (su1-su5) and pDsRed-monomer-N1-hyal-2 vectors were cotransfected into 293T cells.The possible binding area between SU protein and Hyal-2 protein by using laser confocus and co-immunoprecipitation methods was determined.The results showed that SU1-SU5 and Hyal-2 were co-located in the cells,there was no interaction between the SU1-SU5 and the Hyal-2 of sheep by using the method of co-immunoprecipitation.The deleted region 238 bp-867 bp of the su gene is essential for the binding of SU with the receptor.

Key words:ovine pulmonary adenomatosis virus;SU protein;Hyal-2 protein;binding region

文章編號:1007-5038(2016)04-0049-05

中圖分類號:S852.65;Q789

文獻標識碼:A

作者簡介：張月梅( 1982- ) ，女，內蒙古呼和浩特人，助理研究員，博士，主要從事動物傳染病相關研究。*通訊作者

基金項目：國家自然科學基金項目( 31101788)

收稿日期：2015-09-14