飼料中添加枯草芽孢桿菌對團頭魴幼魚生長性能、肝臟抗氧化指標、腸道菌群結構和抗病力的影響

孫盛明　蘇艷莉　張武肖　戈賢平*　朱　健

(1.中國水產科學研究院淡水漁業研究中心，農業部淡水漁業和種質資源利用重點實驗室，無錫214081；

2.南京農業大學無錫漁業學院，無錫214081)

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飼料中添加枯草芽孢桿菌對團頭魴幼魚生長性能、肝臟抗氧化指標、腸道菌群結構和抗病力的影響

孫盛明1蘇艷莉2張武肖2戈賢平1*朱健1

(1.中國水產科學研究院淡水漁業研究中心，農業部淡水漁業和種質資源利用重點實驗室，無錫214081；

2.南京農業大學無錫漁業學院，無錫214081)

摘要：本試驗旨在研究飼料中添加枯草芽孢桿菌對團頭魴幼魚生長性能、肝臟抗氧化指標、腸道菌群結構和抗病力的影響。選取初始體重為(1.81±0.01) g的團頭魴幼魚360尾，隨機分為4組(每組3個重復，每個重復30尾)，分別飼喂添加0(T0組，作為對照組)、2×107(T1組)、2×108(T2組)、2×109 CFU/g枯草芽孢桿菌(T3組)的等氮等脂飼料。試驗期為8周。結果表明：1)與對照組相比，T1組和T2組團頭魴幼魚的增重率、特定生長率顯著升高(P<0.05)，且T1組的飼料系數顯著降低(P<0.05)。2)與對照組相比，T1組團頭魴幼魚的肝臟抗氧化酶(超氧化歧化酶、過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶)活性顯著升高(P<0.05)，同時該組肝臟丙二醛含量顯著降低(P<0.05)。3)各組全魚水分、粗蛋白質、粗脂肪和粗灰分含量均無顯著差異(P>0.05)。4)變性梯度凝膠電泳(DGGE)圖譜顯示攝食不同添加量枯草芽孢桿菌飼料的團頭魴幼魚的腸道菌群結構發生了改變。5)采用嗜水氣單胞菌對魚體進行攻毒，各組96 h后的累積死亡率未產生顯著差異(P>0.05)，但T1組和T2組的累積死亡率低于對照組和T3組。由此可見，飼料中添加2×107 CFU/g的枯草芽孢桿菌能夠提高團頭魴幼魚的生長性能、抗氧化能力，并改變腸道菌群結構，但對其體成分和抗病力沒有顯著影響。

關鍵詞：團頭魴；枯草芽孢桿菌；生長；抗氧化能力；腸道菌群結構

隨著高密度集約化養殖快速發展，養殖水環境日益惡化，從而導致養殖動物的疾病暴發甚至大規模死亡。鑒于傳統的抗菌藥物具有在動物體內殘留、引起病原菌的耐藥性等缺點，國內外學者紛紛致力于各種抗菌藥物替代品的研究，故此，益生菌作為抗生素時代之后的一種新型飼料添加劑得到廣泛關注并成為研究熱點[1-2]。在養殖魚類上應用的益生菌是指添加到飼料或應用于養殖水體中在一定程度上改善養殖魚類的水環境或腸道內微生物平衡，從而對寄主產生包括刺激免疫、改善胃腸道形態、促進生長和飼料利用、提高魚肉品質等有利影響的微生物細胞[3]。與其他益生菌相比，枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)具有穩定性好、抗性強、耐高溫、耐酸堿和產酶豐富等優勢。已有研究表明，飼料中添加枯草芽孢桿菌不僅能促進水生動物的生長，提高消化酶活性和非特異性免疫力，而且還能夠改善其腸道菌群結構[4-10]。

團頭魴(Megalobramaamblycephala)，隸屬于硬骨魚綱(Osteichthyes)，鯉形目(Cypriniformes)，鯉科(Cyprinidae)，鳊亞科(Abramidinae)，魴屬(Megalobrama)，其肉質鮮美、生長快、經濟價值高，為我國目前主要養殖魚類之一[11-12]。隨著集約化養殖模式的擴大和推廣，因高密度養殖、投飼頻率增加以及水體污染等問題導致團頭魴的病害和重大疫病頻發，而營養素是影響水生動物抗病力最重要且最易于調控的因子之一，但有關枯草芽孢桿菌在團頭魴幼魚飼料中的應用研究鮮有報道。本研究旨在探討飼料中添加枯草芽孢桿菌對團頭魴幼魚生長性能、肝臟抗氧化指標、腸道菌群結構和抗病力的影響，為枯草芽孢桿菌在團頭魴養殖中的應用提供科學依據。

1材料與方法

1.1枯草芽孢桿菌制劑

試驗用枯草芽孢桿菌制劑為枯草芽孢桿菌B115菌株，由浙江省淡水水產研究所魚病室提供，經30 ℃、180 r/min振蕩培養后制成含不同濃度枯草芽孢桿菌的菌液，使用前用平板計數法測定制劑中細菌數量。

1.2試驗飼料

以魚粉、豆粕、菜籽粕、棉籽粕和小麥粉等為主要原料配制基礎飼料，其組成及營養水平見表1。用含不同濃度枯草芽孢桿菌的菌液替代基礎飼料中的空白菌液，配制3種試驗飼料?；A飼料中枯草芽孢桿菌的濃度為0(T0組，作為對照組)，3種試驗飼料中枯草芽孢桿菌的濃度分別為2×107(T1組)、2×108(T2組)、2×109CFU/g(T3組)。飼料原料經過粉碎過60目孔徑分篩，按表1配比混合均勻，少量的組分采用逐級擴大法混合，加入枯草芽孢桿菌菌液，再次充分混勻后，用SLP-45型制粒機(中國水產科學研究院漁業機械儀器研究所研制)制成粒徑為2.0 mm的沉性顆粒飼料，50 ℃烘干后于4 ℃冰箱中保存備用。

1.3飼養管理

試驗用團頭魴幼魚由中國水產科學研究院淡水漁業研究中心苗種基地提供，試驗魚被放入有溫控系統的循環流水養殖圓形桶(規格為直徑820 mm，高700 mm)內養殖。選取健康、初始均重為(1.81±0.01) g的團頭魴幼魚360尾，隨機分為4組，每組3個重復，每個重復30尾魚。試驗前2周使用不含枯草芽孢桿菌的對照組飼料進行馴化，待團頭魴幼魚表現出主動搶食為止，隨后開始以組為單位隨機投喂不同枯草芽孢桿菌添加量的試驗飼料。每天投喂4次，分別于08:00—8:30、11:00—11:30、14:00—14:30、17:00—17:30進行投喂，達飽食水平，日投喂量為魚體重的2%～4%，并根據攝食和生長情況作適當調整。試驗期為8周，8周后對各組試驗魚進行稱重及采樣。養殖期間水溫為26～30 ℃，pH為7.0～8.0，溶氧濃度大于5 mg/L，氨氮濃度小于0.4 mg/L，亞硝酸鹽氮濃度小于0.06 mg/L。

表1　基礎飼料組成及營養水平(干物質基礎)

1)維生素預混料為每千克飼料提供The vitamin premix provided the following per kg of the diet：VA 900 000 IU，VD 250 000 IU，VE 4 500 mg，VC 5 000 mg，VK3220 mg，VB1320 mg，VB21 090 mg，VB65 000 mg，VB12116 mg，生物素 biotin 50 mg，泛酸鈣 calcium pantothenate 1 000 mg，葉酸 folic acid 165 mg，膽堿 choline 60 000 mg，煙酸nicotinic acid 2 500 mg。

2)礦物質預混料為每千克飼料提供The mineral premix provided the following per kg of the diet：CuSO4·5H2O 2.5 g，FeSO4·7H2O 28 g，ZnSO4·7H2O 22 g，MnSO4·4H2O 9 g，Na2SeO30.045 g，KI 0.026 g，CoCl2·6H2O 0.1 g。

1.4樣品采集和測定方法

1.4.1樣品采集與制備

試驗結束后，禁食24 h后，統計每組存活尾數，養殖魚全部稱量體重和測量體長。每組隨機取3尾魚立即剖開腹部，剝離出肝臟并稱重，將剝離出的肝臟置于離心管內于-80 ℃超低溫冰箱中保存，用于測定丙二醛(MDA)含量以及超氧化歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性；分離出腸道置于無菌離心管中，并轉入-80 ℃超低溫冰箱中保存，用于測定腸道菌群結構。每組取3尾魚進行全魚營養成分分析。

1.4.2肝臟抗氧化指標的測定

肝臟中MDA含量以及SOD、CAT和GSH-Px活性均采用南京建成生物工程研究所的試劑盒進行測定，具體的測定方法按照試劑盒的說明進行操作，肝臟中蛋白質含量的測定采用考馬斯亮藍法。

1.4.3全魚營養成分的測定

采用常壓干燥法在105 ℃的烘箱中烘至恒重來計算干物質含量；采用凱氏定氮法(GB/T 6432—1994)測定粗蛋白質含量；采用索氏抽提法(GB/T 6432—1994)測定粗脂肪含量；采用560 ℃灼燒法(GB/T 6438—1992)測定粗灰分含量。

1.4.4腸道菌群結構的測定

腸道菌群通過變性梯度凝膠電泳(DGGE)進行分離及后續克隆測序。采用帶GC夾細菌通用引物518R和341F[13]進行細菌基因組DNA的擴增，擴增片段為細菌的16S rDNA的V3可變區，擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。使用大連寶生物工程公司的膠回收純化試劑盒(KAPA 2G Robust PCR Kit)從1%瓊脂糖凝膠中回收純化PCR產物，按試劑盒中的使用說明進行操作。將PCR擴增產物通過DGGE進行分離，采用的凝膠變性梯度為35%～55%，聚丙烯酰胺凝膠濃度為8%(化學變性劑為100%尿素7 mol/L和40%的丙烯酰胺)，在1×TAE緩沖液中150 V、60 ℃下電泳5 h，電泳完畢后采用銀染的方法進行染色，銀染結束后利用凝膠成像儀觀察并記錄結果[14]。

1.4.5生長性能的測定

主要生長性能指標用以下公式求得：

增重率(WGR，%)=100×(終末均重-

初始均重)/初始均重；

特定生長率(SGR，%/d)=100×(ln終末均重-

ln初始均重)/養殖天數；

飼料系數(FCR)=攝入飼料干重/

(終末體重-初始體重)；

存活率(SR，%)=100×終末尾數/初始尾數。

1.5攻毒試驗

采樣結束后，繼續投喂各組剩下的團頭魴，穩定1周后，進行嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)的攻毒試驗。攻毒試驗期間停止投喂飼料。攻毒試驗前以不同濃度梯度的嗜水氣單胞菌菌液做預試驗，依據預試驗篩選出的半致死濃度(LD50)進行攻毒試驗，按照50 g體重腹腔注射0.5 mL生理鹽水懸浮的嗜水氣單胞菌(濃度為5×107CFU/mL)，注射96 h后統計各組死亡魚的數量。

1.6數據分析

試驗數據用SPSS 16.0統計軟件包中的單因素方差分析(one-way ANOVA)進行統計，若差異顯著，再進行Tukey’s多重比較，差異顯著水平為P<0.05，所有結果均以平均值±標準誤(mean±SE)表示。

2結果與分析

2.1生長性能

由表2可知，T1組和T2組的終末體重、增重率和特定生長率顯著高于不添加枯草芽孢桿菌的對照組(P<0.05)，且T1組的飼料系數顯著低于對照組(P<0.05)。然而，枯草芽孢桿菌添加量最高的T3組在增重率、特定生長率方面均低于T1組(P<0.05)、T2組(P<0.05)以及對照組(P>0.05)，說明飼料中過量添加枯草芽孢桿菌對團頭魴幼魚的生長有一定的抑制作用。

2.2體成分

由表3可知，團頭魴幼魚攝食添加不同劑量枯草芽孢桿菌的飼料與攝食不添加枯草芽孢桿菌的飼料相比，其全魚水分、粗蛋白質、粗脂肪和粗灰分含量均無顯著差異(P>0.05)。

表2　飼料中添加枯草芽孢桿菌對團頭魴幼魚生長性能的影響

同行數據肩標無字母或相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下表同。

In the same row, values with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as below.

表3　飼料中添加枯草芽孢桿菌對團頭魴幼魚體成分的影響

2.3肝臟抗氧化指標

由表4可知，T1組的SOD、CAT和GSH-Px活性均顯著高于對照組(P<0.05)，且T1組的MDA含量顯著低于對照組(P<0.05)，說明飼料中添加適量的枯草芽孢桿菌能提高團頭魴幼魚肝臟中抗氧化酶活性并降低MDA的積累。T2組和T3組與對照組相比，SOD、CAT、GSH-Px活性及MDA含量均沒有顯著差異(P>0.05)。

表4　飼料中添加枯草芽孢桿菌對團頭魴幼魚肝臟抗氧化指標的影響

2.4腸道菌群結構

由圖1可知，DGGE分離圖譜及聚類分析相似性范圍為0.38～0.80，對照組與3個試驗組(T1組、T2組和T3組)的相似性較低，表明攝食含枯草芽孢桿菌飼料的團頭魴幼魚腸道菌群結構發生了明顯變化。

圖1　各組團頭魴幼魚腸道細菌的DGGE圖譜及聚類分析

2.5攻毒試驗

由表5可知，各組團頭魴幼魚腹腔注射嗜水氣單胞菌96 h后的累積死亡率均在50%以上，對照組、T1組、T2組和T3組的累積死亡率分別為61.7%、51.7%、53.3%和58.3%，T1組和T2組的累積死亡率低于對照組和T3組，但組間沒有顯著差異(P>0.05)。

表5　嗜水氣單胞菌攻毒后團頭魴幼魚的累積死亡率

3討論

3.1飼料中添加枯草芽孢桿菌對團頭魴幼魚生長性能的影響

相關研究表明枯草芽孢桿菌對魚類腸道菌群的結構組成有重要的影響[15-17]，益生菌對仔魚健康穩定的腸道菌群系的構建有重要的意義。有研究指出，多種枯草芽孢桿菌菌株被添加至仔魚的飼料中均取得了良好的效果，枯草芽孢桿菌的添加對仔魚的生長有良好的促進作用[18-19]。本試驗研究發現，在飼料中添加適量枯草芽孢桿菌能提高團頭魴幼魚的增重率、特定生長率并降低其飼料系數，說明飼料中添加適量的枯草芽孢桿菌對團頭魴幼魚的生長有促進作用，這與在羅非魚(Oreochromisniloticus)[20-21]、凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)[22]以及肉雞(Gusgallus)[23]上的研究結果相一致。本研究發現，飼料中添加過量枯草芽孢桿菌對團頭魴幼魚的生長有一定的抑制作用，符合高權新等[17]對益生菌使用量的有關說明，這主要有2個方面原因：一方面，芽孢桿菌產生過量的酶有可能抑制動物體內內源酶的活性，降低內源酶對營養物質的分解；另一方面，飼料中過量添加枯草芽孢桿菌可導致魚體內菌群比例失調，進而影響其生長性能。

3.2飼料中添加枯草芽孢桿菌對團頭魴幼魚肝臟抗氧化指標的影響

SOD在團頭魴乃至其他水產動物體內的抗氧化酶系統中起著重要的作用[24]，魚體內過多的超氧陰離子自由基的清除需要由抗氧化酶系統中的SOD、CAT等來完成，主要是通過SOD的歧化反應把自由基轉化為過氧化氫(H2O2)，然后通過CAT和GSH-Px把H2O2分解為對機體無害的水(H2O)，從而阻止了自由基積累對魚體的毒害[25-26]。本研究表明，飼料中添加2×107CFU/g枯草芽孢桿菌對團頭魴幼魚的抗氧化酶活性有顯著的提高作用，同時還能顯著降低脂質過氧化產物MDA的含量。

3.3飼料中添加枯草芽孢桿菌對團頭魴幼魚腸道菌群結構的影響

本試驗發現不同添加量的枯草芽孢桿菌對團頭魴幼魚腸道菌群結構有一定的影響。DGGE圖譜中的條帶表示的是一個可能的優勢細菌類群或可操作分類單元(OTU)[27]，本研究中對照組的條帶數均值高于3個試驗組，表明飼料中添加枯草芽孢桿菌降低了腸道菌群結構的多樣性，故此聚類分析圖中對照組與3個試驗組的相似性較低，表明攝食含枯草芽孢桿菌飼料的團頭魴腸道菌群結構發生了明顯變化。

3.4飼料中添加枯草芽孢桿菌對團頭魴幼魚抗病力的影響

嗜水氣單胞菌是團頭魴以及其他淡水魚類的主要致病菌之一，本試驗中給試驗魚腹腔注射一定劑量的嗜水氣單胞菌，96 h后T1、T2組的累積死亡率低于對照組，而T3組的累積死亡率是最高的，該結果表明飼料中添加適量枯草芽孢桿菌對團頭魴幼魚的抗病力有所提高，這與在條紋鱸[28]和尼羅羅非魚[29]上所得結果相一致。由前面得出的適量枯草芽孢桿菌的添加對魚體的抗氧化能力有促進作用，并結合枯草芽孢桿菌的添加對魚類腸道菌群結構的改善，本試驗推測飼料中添加適量的益生菌將提高腸道原有有益菌群的消化能力[30]，強化魚體的抗氧化系統，從而提高魚體的免疫力和抗病力。

4結論

① 飼料中添加適量枯草芽孢桿菌能夠提高團頭魴幼魚的生長性能、抗氧化能力，并改變腸道菌群結構。

② 團頭魴幼魚飼料中枯草芽孢桿菌的適宜添加量為2×107CFU/g。

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(責任編輯菅景穎)

Effects of DietaryBacillussubtilison Growth Performance,Liver Antioxidant Ability, Intestinal Microflora Structure and Disease Resistance of Juvenile Blunt Snout Bream(Megalobramaamblycephala)

SUN Shengming1SU Yanli2ZHANG Wuxiao2GE Xianping1*ZHU Jian1

(1. Key Laboratory of Freshwater Fisheries and Germplasm Resources Utilization, Ministry of Agriculture, Freshwater Fisheries Research Center, Chinese Academy of Fishery Sciences,Wuxi 214081, China; 2. Wuxi Fishery College, Nanjing Agricultural University, Wuxi 214081, China)

Abstract:This experiment was conducted to investigate the effects of dietary Bacillus subtilis (B. subtilis) on growth performance, liver antioxidant ability, intestinal microflora structure and disease resistance of juvenile blunt snout bream (Megalobrama amblycephala). Three hundred and sixty juvenile blunt snout bream with an average body weight of (1.81±0.01) g were randomly chosen and divided into 4 groups with 3 replicates per group and 30 fish per replicate. Four isonitrogenous and isolipidic diets were formulated with the B. subtilis supplemental level was 0 (T0 group, as control group), 2×107 (T1 group), 2×108 (T2 group), 2×109 CFU/g (T3 group), respectively, and those diets were randomly fed one of four groups for 8 weeks. The results showed as follows: 1) the weight gain rate (WGR) and specific growth rate (SGR) of T1 and T2 groups were significantly higher than those of control group (P<0.05), and the feed conversation ratio (FCR) of T1 group was significantly lower than that of control group (P<0.05). 2) Compared with the control group, the activities of liver antioxidant enzymes (superoxide dismutase, catalase and catalase) of T1 group were significantly increased (P<0.05), meanwhile, the liver malondialdehyde content in that group was significantly decreased (P<0.05). 3) No significant differences were observed in moisture, crude protein, crude lipid and ash contents of whole body among all groups (P>0.05). 4) The denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) image demonstrated that the intestinal microflora structure was changed when juvenile blunt snout bream fed diets supplemented with different levels of B. subtilis. 5) Following challenged by Aeromonas hydrophila on the 96 h, fish fed different experimental diets showed no significant differences in cumulative mortality, but the cumulative mortality in T1 and T2 groups was lower than that in control and T3 groups. It is concluded that adding 2×107 CFU/g B. subtilis to juvenile blunt snout bream diet can improve growth performance and antioxidant ability, and change the intestinal microflora structure, but cannot significantly affect the body composition and disease resistance.[Chinese Journal of Animal Nutrition, 2016, 28(2)：507-514]

Key words:blunt snout bream (Megalobrama amblycephala); Bacillus subtilis; growth; antioxidant ability; intestinal microflora structure

*Corresponding author, professor, E-mail: gexp@ffrc.cn

中圖分類號：S828

文獻標識碼：A

文章編號：1006-267X(2016)02-0507-08

作者簡介：孫盛明(1983—)，男，山東萊州人，助理研究員，博士，研究方向為水產動物營養與飼料。E-mail: sunsm@ffrc.cn*通信作者：戈賢平，研究員，博士生導師，E-mail: gexp@ffrc.cn

基金項目：中央級公益性科研院所基本科研業務費專項資金(2015C06XK01)；江蘇省自然科學基金(SBK2015020058)；國家大宗淡水魚類產業技術體系華東養殖崗位(CARS-46-14)；十二五國家科技支撐計劃長江下游池塘高效生態養殖技術集成與示范(2012BAD25B07)

收稿日期：2015-07-24

doi：10.3969/j.issn.1006-267x.2016.02.024