多重耐藥型與藥物敏感型大腸桿菌在羊肉中生長動力學模型的建立

渠　清，夏云敏，王茁然，金　禮，張　玫，李王強，李　雪，楊艷彬，吳彩蘭，姬　華

（1.石河子大學食品學院，新疆石河子　832000；2.石河子大學農學院植物保護系，新疆石河子　832000）

?

多重耐藥型與藥物敏感型大腸桿菌在羊肉中生長動力學模型的建立

渠清1，夏云敏1，王茁然1，金禮1，張玫1，李王強1，李雪1，楊艷彬1，*吳彩蘭2，*姬華1

（1.石河子大學食品學院，新疆石河子832000；2.石河子大學農學院植物保護系，新疆石河子832000）

摘要：為探討食源性大腸桿菌的生長特性，通過建立多重耐藥型與藥物敏感型大腸桿菌（Escherichia coli）在羊肉中的生長動力學模型，在10，15，20，25，35，37℃不同貯藏溫度下研究了多重耐藥型與藥物敏感型大腸桿菌的生長模型。采用修正的Logistic方程擬合大腸桿菌的一級生長模型，在一級方程的基礎上建立了大腸桿菌的二級平方根方程，分析了大腸桿菌的生長參數。

關鍵詞：大腸桿菌；羊肉；預測模型

姬華（1980—），女，博士，副教授，研究方向為食品質量與安全。

大腸桿菌（Escherichia coli）是人和溫血動物腸道重要的兼性厭氧寄居菌群，也是水源和食品糞便污染指示菌。大腸菌群數量的多少可以反映出食品是否被污染以及污染程度的高低，大腸桿菌也是良好的耐藥指示菌，對大腸桿菌耐藥性的研究可以指示本地區細菌的耐藥狀況和食品的衛生情況。預測微生物學（Predictive microbiology）是建立在計算機基礎上對食品中微生物生長、殘存和死亡進行的數量化預測方法。新疆是我國五大牧區之一，羊肉產量及消費量較高，研究大腸桿菌在羊肉中生長動力學模型有利于為延長羊肉貨架期提供理論支持。國外大腸桿菌預測模型的研究主要集中在出血性大腸桿菌[1]，也有報道在蔬菜、魚片中建立大腸桿菌預測模型[2-4]，以及醋酸、乳酸對大腸桿菌的殺滅作用[5-6]；培養基添加谷氨酸和精氨酸對致病型和非致病型大腸桿菌的影響[7]。本文探討多重耐藥型與藥物敏感型大腸桿菌在羊肉中的生長動力學模型。

1材料和方法

1.1材料

優質新鮮瘦羊肉，分別購于石河子市愛家超市與石河子市友好超市。

菌株：試驗選取2株大腸桿菌，分別為多重耐藥菌13z與藥物敏感菌16z（食品學院食品微生物實驗室保存）。其中，菌株13z為8重耐藥菌，分別對氨芐西林、四環素、氯霉素、復方新諾明、紅霉素、阿莫西林、鏈霉素、萘啶酮酸產生耐藥性；菌株16z為敏感菌株，僅對頭孢他啶顯示中介，對氨芐西林、頭孢噻肟、慶大霉素、亞胺培南、環丙沙星、左氧氟沙星、四環素、氯霉素、阿米卡星、哌拉西林、復方新諾明、紅霉素、阿莫西林、多黏菌素B、鏈霉素、萘啶酮酸等16種藥物均顯示敏感。判斷參照《抗微生物藥物敏感性實驗執行標準》第16版信息增刊提供的紙片法標準。

1.2試驗儀器和設備

DZLX- 40Ⅱ型自動滅菌鍋，上海申安醫療器械廠產品；SPX- 250B- Z型生化培養箱，廣東省醫療器械廠產品；SW- CJ型超凈工作臺，上海智城分析儀器制造有限公司產品。

1.3培養基和試劑

LB培養基、伊紅美藍培養基，青島海博生物技術有限公司產品；0.85％生理鹽水，自制。

1.4原菌液的制備

2株菌均保藏在- 20℃的甘油管中，在超凈工作臺中將2株菌分別接種到LB營養瓊脂培養基中，37℃下培養，活化3次，用無菌棉簽蘸取適量菌落到生理鹽水中，參照麥氏比濁液的濃度，于波長520 nm下的分光光度計上進行測量，待菌液吸光度與麥氏比濁液（0.5）吸光度大致相同即可，菌液濃度約為1.5×108CFU/mL。

1.5樣品處理

在超凈工作臺內用酒精棉球擦拭整塊鮮肉表面2次，再用紫外線殺菌25 min（紫外燈30 W，距離520 mm）。用無菌手術刀剔除表面的肉，將內部的肉分割成10 g（大小約2 cm×2 cm×2 cm）的肉樣，放入無菌培養皿內，將肉樣的兩面再用紫外線各殺菌25 min，取原肉10 g，用0.85％生理鹽水分別稀釋10倍、100倍，平板計數檢測原肉中的微生物，未發現微生物生長。

1.6接種菌株

接種前將已制備好的2株大腸桿菌菌液充分搖勻，使用無菌生理鹽水分別進行梯度稀釋，制備成菌量為1×103～1×104CFU/mL的菌懸液，無菌操作將10 g無菌肉片懸浮于菌液15 s進行接種，然后將肉塊取出放到無菌均質袋中，分別放置于10，15，20，25，35，37℃條件下恒溫培養貯藏，每隔適當時間取出肉樣進行大腸桿菌計數。

1.7肉樣貯藏與微生物計數

將盛有接種肉樣的均質袋袋口密封，分別貯藏在10，15，20，25，35，37℃的生化培養箱內。按時取出肉樣，用無菌剪刀剪碎，放入裝有90 mL無菌生理鹽水的均質袋內，使用均質機充分拍打90 s，連續10倍稀釋均質液，選取3個合適濃度的菌液，各吸取菌液100 μL涂布LB平板，每個稀釋梯度涂布2個平板，37℃培養24 h后計數。參照國標GB/T 4789.2—2012食品衛生微生物學檢驗-菌落總數測定用平板計數法測定活菌數[8]。

2數學模型與模型驗證

2.1微生物生長動力學預測模型

在10，15，20，25，35，37℃條件下得到的耐藥性及藥物敏感性大腸桿菌試驗數據，分別采用修正的Logistic模型擬合其生長動態。修正的Logistic模型公式及式中參數所代表的意義如下：

式中：t——時間，h；

N（t）——t時的菌數，CFU/g；

N0，Nmax——初始與最大菌數，CFU/g；

μ——在λ0時間點時微生物生長的相對最大比生長速率，h-1；

λ0——微生物生長達到最大生長速率所需要的時間。

最大比生長速率μmax和延滯時間λ通過以下公式求出：

試驗數據應用Origin 8.0統計分析軟件，選取數學模型進行回歸分析。

2.2微生物生長動力學預測模型的驗證

均方誤差（Mean square error，MSE）、偏差因子（Bias factor，Bf）和準確因子（Accuracy factor，Af）用來評價模型的預測效果。將實測值和預測值進行比較，根據二者的殘差計算偏差因子和準確因子，均方誤差、偏差因子和準確因子的計算公式如下：

2.3溫度對微生物生長影響動力學模型

溫度對耐藥性及藥物敏感性大腸桿菌生長影響的動力學模型由平方根模型[9]（即Belehradek方程[10-11]）描述：

式中：b——方程的常數；

T——攝氏溫度，℃；

Tmin——微生物生長的最低溫度，即在此溫度時最大生長比率為零。

3結果與分析

3.1不同貯藏溫度下多重耐藥型與藥物敏感型大腸桿菌的一級動力模型

利用修正的Logistic方程擬合在10，15，20，25，35，37℃條件下大腸桿菌的生長數據，根據修正Logistic方程對大腸桿菌的生長曲線進行回歸。

多重耐藥菌株13z一級動力模型和相關系數見表1，藥物敏感菌株16z一級動力模型和相關系數見表2。

表1　多重耐藥菌株13z一級動力模型和相關系數

表2　藥物敏感菌株16z一級動力模型和相關系數

相關系數R2可以評估回歸方程對樣本數據擬合效果的好壞。R2值越接近1，表明估計的回歸方程對樣本數據的擬合效果越好；R2值越接近于0，表明方程擬合效果越差[12]。由表1、表2可知，修正的Logistic模型適合擬合大腸桿菌在羊肉中的生長狀況；從擬合效果可知，相關系數R2都在0.936 3以上，說明修正的Logistic模型能夠充分地預測10～37℃溫度范圍內大腸桿菌在羊肉中的生長規律。

10℃下大腸桿菌13z與16z的一級生長模型曲線見圖1，15℃下大腸桿菌13z與16z的一級生長模型曲線見圖2，20℃下大腸桿菌13z與16z的一級生長模型曲線見圖3，25℃下大腸桿菌13z與16z的一級生長模型曲線見圖4，35℃下大腸桿菌13z與16z的一級生長模型曲線見圖5，37℃下大腸桿菌13z 與16z的一級生長模型曲線見圖6。

圖1　10℃下大腸桿菌13z與16z的一級生長模型曲線

圖2　15℃下大腸桿菌13z與16z的一級生長模型曲線

圖3　20℃下大腸桿菌13z與16z的一級生長模型曲線

圖4　25℃下大腸桿菌13z與16z的一級生長模型曲線

偏差因子衡量預測值是否過高或過低估計了實測值，表示模型的結構偏差。準確因子衡量預測值與實測值的平均誤差，該值等于1表明預測值與實測值完全吻合，預測很準確。Ross建議病原性細菌Bf的范圍在0.90～1.05為最好；0.70～0.90或1.06～1.15能夠接受[13]；Bf＜0.70或者＞1.15不能接受。Lebert認為Bf不能提供全面的模型準確性預測，Af顯示預測值與觀測值的接近程度，Af越接近1，模型越好[14]。MSE的值越小，說明模型表達試驗數據較充分。

圖5　35℃下大腸桿菌13z與16z的一級生長模型曲線

圖6　37℃下大腸桿菌13z與16z的一級生長模型曲線

多重耐藥菌株13z與藥物敏感菌株16z一級動力模型驗證（Logistic）見表3。

表3　多重耐藥菌株13z與藥物敏感菌株16z一級動力模型驗證（Logistic）

由表3可知，在多重耐藥菌株13z的一級動力模型中，20℃的Bf略高于1.15，Af偏差較大，故不能接受。在藥物敏感菌株16z的一級動力模型中，10℃的Bf，Af都偏高，不能接受。其余溫度下建立的一級動力模型Bf，Af，MSE都較好，表明預測值與實際值相似，擬合效果好[15]。

3.2多重耐藥型與藥物敏感型大腸桿菌生長速率二級模型

多重耐藥菌株13z與藥物敏感菌株16z的生長參數見表4。

表4　多重耐藥菌株13z與藥物敏感菌株16z的生長參數

表4反映了在修正Logistic模型的基礎上，計算出不同貯藏溫度條件下大腸桿菌的最大比生長速率。由表4可知，隨著貯藏溫度的升高，2株大腸桿菌生長速率總體呈上升趨勢；而當貯藏溫度降到20℃以下時，生長速率較小，因此適當降低貯藏溫度可以有效防止大腸桿菌的生長繁殖；當貯藏溫度為37℃時，最大比生長速率最大，因此羊肉中大腸桿菌最適生長溫度為37℃。10℃和15℃，多重耐藥菌株13z的生長速率高于藥物敏感菌株16z生長速率。20～37℃，羊肉中藥物敏感菌株16z的生長速率更快。

貯藏溫度對微生物的生長動力學影響需要用二級方程平方根方程進行描述。

多重耐藥菌株13z與藥物敏感菌株16z的平方根二級方程及相關系數見表5，多重耐藥菌株13z與藥物敏感菌株16z平方根二級方程驗證見表6，多重耐藥菌株13z的平方根二級方程見圖7，藥物敏感菌株16z的平方根二級方程見圖8。

表5　多重耐藥菌株13z與藥物敏感菌株16z的平方根二級方程及相關系數

表6　多重耐藥菌株13z與藥物敏感菌株16z平方根二級方程驗證

圖7　多重耐藥菌株13z的平方根二級方程

圖8　藥物敏感菌株16z的平方根二級方程

觀察表6，多重耐藥菌株和藥物敏感菌株平方根二級方程的Bf在0.99～1.02，準確因子較接近與1，表示誤差較低，說明建立的修正Logistic模型和平方根模型能夠很好地預測大腸桿菌10～37℃下在羊肉中的生長動態。

4結論與討論

利用修正的Logistic方程，建立了10，15，20，25，35，37℃條件下多重耐藥型與藥物敏感型大腸桿菌在羊肉中的生長曲線。結果表明，隨著貯藏溫度的升高，生長速率總體呈上升趨勢。在10～20℃時，2株大腸桿菌生長較緩慢，μmax值較低；隨著貯藏溫度升高，μmax逐漸增大，在37℃時羊肉中大腸桿菌生長速率最高。試驗中計算的準確因子和偏差因子接近1，修正Logistic模型能夠較好地預測10～37℃貯藏溫度下多重耐藥型與藥物敏感型大腸桿菌在羊肉中的生長動態。

各貯藏溫度下多重耐藥菌株13z與藥物敏感菌株16z生長曲線對比圖可知，在貯藏溫度為15℃時，多重耐藥菌株13z的平均生長速率大于藥物敏感菌株16z；20℃下2種菌株的平均生長速率基本持平；而在溫度為25～37℃時，藥物敏感菌株16z的生長曲線較多重耐藥菌株13z更趨向于S型。

本文應用平方根方程建立了羊肉中多重耐藥型與藥物敏感型大腸桿菌隨貯藏溫度變化的動力學模型——最大比生長速率的預測模型，得出2種菌株在羊肉中的最大比生長速率都隨貯藏溫度的上升逐漸增大、貯藏溫度與最大比生長速率的平方根線性相關的結論。

國外有大量在食品或營養肉湯中建立大腸桿菌生長模型的試驗。Jun Wang等人[16]研究生菜中大腸桿菌O157 : H7對比不同相對濕度與溫度的生長情況，發現溫度的升高比相對濕度的變化對大腸桿菌O157 : H7在生菜中的生長更有影響力。Lindqvist R等人[17]研究香腸中大腸桿菌的生長情況，發現在適宜條件下菌株之間的差異可以忽略不計；而在不利條件下，不同產毒菌株增長速率差異較大。在本研究中，羊肉中多重耐藥型與藥物敏感型大腸桿菌的生長速率大致相同。

除研究大腸桿菌在羊肉中的生長預測模型外，為探究同一菌種不同菌株生長預測模型在同種培養介質中的差別，本文利用了實驗室篩選的多重耐藥菌株13z與藥物敏感菌株16z進行了對比試驗。微生物預測模型已有報道，但大多都是單一類型菌種預測模型的研究。隨著抗生素使用量的增大，研究多重耐藥菌株和藥物敏感菌株的生長特性，具有一定的研究價值[18]。

食品中不可能只存在單一類型的微生物拓展，除研究單一菌種生長預測模型外應考慮到食品中微生物的多樣性、各菌種間相互作用，研究2種或多種微生物共同在某類食品中的生長預測模型，大腸桿菌與其他微生物的相互作用有待進一步研究。

參考文獻：

[1]Carney E，O'Brien S B，Sheridan J J，et al. Prevalence and level of Escherichia coil O157 : H7 on beef trimmings，carcasses and boned head meat at a beef slaughter plant [J] . Food Microbiology，2006，23：52-59.

[2]Ozer N P，Demirci A. Electrolyzed oxidizing water treatment for decontamination of raw salmon inoculated with Escherichia coil O157 : H7 and Listeria monocytogenes Scott A and response surface modeling [J] . Journal of Food Engineering，2006，72：234-241.

[3]Yu C，Davidson V J，Yang S X. A neural network approach to predict survival/death and growth/no growth interfaces for Escherichia coil O157 : H7 [J] . Food Microbiology，2006，23：552-560.

[4]Bharathi S，Ramesh M N，Varadaraj M C. Predicting the behavioural pattern of Escherichia coil in minimally processed vegetables [J] . Food Control，2001，12：275-284.

[5]Entani E，Asai M，Tsujihata S，et al. Antibacterial action of vinegar against food-borne pathogenic bacteria including Escherichia coil O157 : H7 [J] . Journal of Food Protection，1998，61（8）：953-959.

[6]Presser K A，Ross T，Ratkowsky D A. Modelling the growth limits（growth/no growth interface）of Escherichia coil as a function of temperature，pH，lactic acid concentration，and water activity [J] . Applied and Environmental Microbiology，1998，64（5）：1 773-1 779.

[7]Cui S H，Meng J H，Bhagwat A A. Availability of glutamate and arginine during acid challenge determines cell density -dependent survival phenotype of Escherichia coli strains [J] . Applied and Environmental Microbiology，2001，67（10）：4 914-4 918.

[8]中華人民共和國衛生部. GB/T 4789.2—2010食品衛生微生物學檢驗-菌落總數測定[S]．北京：中國標準出版社，2010．

[9]Baranyi J，Roberts T A. Mathematics of predictive food microbiology [J] . International Journal of Food Microbiology，1995，26（2）：199-218.

[10]Ratkowsky D A，Olley J，Mc Meekin T A，et al. A relationship between temperature and growth rate of bacterial cultures [J] . Journal of Bacteriology，1982，149（1）：1-5.

[11]Ross T. In dices for performance evaluation of predictive models in food microbiology [J] . Journal of Applied Microbiology，1996，81：501-508.

[12]紀瑩.傳統米制松糕的貨架期預測模型研究[D] .無錫：江南大學食品學院，2008.

[13]Ross T. Meat and Livestock，Predictive food microbiology models in the meat industry（MSRC.003）[M] . Sydney

Australia Meat and Livestock，1999：326-328.

[14]Lebert I，Robles -Olvera V，Lebert A. Application of polynomial models to predict growth of mixed cultures of Pseudomonas spp. and Listeria in meat [J] . International Journal of Food Microbiology，2000，61（1）：27-39.

[15]朱泓全，唐雪姣，王楊，等.鹵雞腿中大腸桿菌生長模型的研究[J] .中國食物與營養，2015（1）：9-12.

[16]Jun Wang，Jeanne-Marie Membré，Sang-Do Ha，et al. Modeling the combined effect of temperature and relative humidity on Escherichia coli O157 : H7 on lettuce [J] . Food Science and Biotechnology，2012，21（3）：859-865.

[17]Lindqvist R，Lindblad M. Time to growth and inactivation of three STEC outbreak strains under conditions relevant for fermented sausages [J] . International Journal of Food Microbiology，2011，145（1）：49-56.

[18]Murakami S，Aoki K. Microbial Transformation of Aniline Derivatives：Regioselective biotransformation and detoxification of 2 -Phenylenediamine by Bacillus cereus strain PDa -1 [ J] . Journal of Bioscience and Bioengineering，2006，102（1）：21-27.

Study on the Growth Predictive Models of Multidrug- resistant and Drug- sensitive Escherichia coli in Mutton

QU Qing1，XIA Yunmin1，WANG Zhuoran1，JIN Li1，ZHANG Mei1，LI Wangqiang1，LI Xue1，YANG Yanbin1，*WU Cailan2，*JI Hua1
（1. College of Food Science and Technology，Shihezi University，Shihezi，Xinjiang 832000，China；2. Department of Plant Protection，Agricultural College of Shihezi University，Shihezi，Xinjiang 832000，China）

Abstract：The growth characteristics of foodborne Escherichina coli is studied in this paper. The growth kinetic model of drug resistance and sensitivity E.coli in mutton are established in this research. The growth model of multiple drug resistance and sensitivity strains are studied at 10，15，20，25，35，37℃. The Escherichina coli primary growth equation is fitted by the modified Logistic equation，then the secondary square root equation is established on the basis of primary growth equation. The growth parameters of Escherichina coli are also analyzed.

Key words：Escherichina coli；mutton；predictive model

*通訊作者：吳彩蘭（1979—），女，在讀博士，講師，研究方向為微生物學教學科研。

作者簡介：渠清（1994—），女，本科，研究方向為食品質量與安全。

基金項目：石河子大學大學生研究訓練計劃（SRP2014187）；國家大學生創新訓練項目（201510759029）；國家自然科學基金項目（31301469）；石河子大學高層次人才啟動項目（RCZX201225）；石河子大學“3152”青年骨干教師項目（3152SPXY02033）；石河子大學教育教學改革項目（KG- 2013- 32）。

收稿日期：2015- 12- 02

文章編號：1671- 9646（2016）03a- 0001- 05

中圖分類號：R155.5

文獻標志碼：A

doi：10.16693/j.cnki.1671- 9646（X）.2016.03.001