禾花鯉魚種暴發性死亡征病原菌的分離鑒定及藥敏試驗

龍蘇 鄧小紅 梁靜真 牛志偉 韓書煜 范華龍 黃鈞

摘要：【目的】明確引起禾花鯉發生暴發性死亡征的病原菌及其耐藥性，為有效防控禾花鯉暴發性死亡征提供科學依據?！痉椒ā坎捎贸Ｒ幏椒ǚ蛛x病原菌，以API 20NE生化鑒定與16S rRNA基因序列分析相結合的方法進行鑒定，人工回歸感染試驗確定分離菌株的致病性，K-B紙片擴散法測定病原菌對藥物的敏感性?！窘Y果】從廣西全州縣患暴發性死亡征禾花鯉的肝臟中分離獲得1株優勢菌株（TH5），API 20NE生化鑒定和16S rRNA基因序列分析結果顯示，分離菌株TH5為簡達氣單胞菌（Aeromonas jandaei），與簡達氣單胞菌標準菌株ATCC 49568（NR 119040）和CDC 0787-80（NR 037013）的相似度分別為99.9%和99.6%。人工回歸感染試驗結果表明，菌株TH5是導致禾花鯉暴發性死亡征的病原菌。該菌株對復方新諾明、環丙沙星、多粘菌素B等11種藥物高度敏感，對青霉素G、復達欣、先鋒霉素VI等8種藥物已產生耐藥性?！窘Y論】引起廣西全州縣養殖禾花鯉暴發性死亡征的病原菌是簡達氣單胞菌，生產中可選用復方新諾明、環丙沙星、多粘菌素B等藥物進行防治。

關鍵詞： 禾花鯉；簡達氣單胞菌；分離鑒定；藥敏試驗

中圖分類號： S965.116.42 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）07-1241-06

0 引言

【研究意義】禾花鯉（Procypris merus）是鯉魚（Cyprinus carpio）的變種，原產于廣西北部，體短而肥，全身紫褐色，細葉鱗，皮薄，內臟隱約可見，因其在稻田中被長期馴化養殖和攝食水稻禾花而得名。禾花鯉可食率高，高蛋白低脂肪，且富含多種人體必需氨基酸（楊四秀和蔣艾青，2009），是廣西全州縣重要的特色水產養殖品種，也是桂林市十大名牌農產品之一，廣受消費者青睞。近年來，禾花鯉稻田養殖規模越來越大，呈逐年增長趨勢，其養殖區域主要集中在桂北地區的灌陽縣、全州縣、興安縣和桂中地區的融安縣、三江縣等地，因此，確保禾花鯉養殖業的健康發展對促進地方農業經濟發展及加速新農村建設均具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】細菌性疾病是鯉魚養殖過程中的常見病害，主要有嗜水氣單胞菌?。ㄍ鯘芍薜?，1997）、出血?。n英等，2005）、細菌性敗血癥（張玉芬等，2011）、豎鱗?。ㄓ谙?，2011）、肺炎克雷伯氏菌?。ūR玉婷等，2014）和殺鮭氣單胞菌?。ㄍ鹾＞旰屯趵?，2015）等。此外，龔倩等（2010）從患病框鏡鯉中分離出致病性維氏氣單胞菌，溫貴蘭等（2012）從患病甌江彩鯉中分離出簡達氣單胞菌，韓娜娜等（2013）和沈曉靜等（2014）分別從患病錦鯉中分離出摩氏摩根氏菌病和熒光假單胞菌病。近年來，有關禾花鯉的研究主要集中在養殖模式探討，如莫玉軍（2003）、唐春（2004）和黃德文（2009）分別進行了禾花鯉的稻田養殖、池塘養殖和池塘精養技術探索，但鮮見針對禾花鯉病害及其防治的研究報道?！颈狙芯壳腥朦c】2014年6月廣西全州縣某禾花鯉養殖示范基地的禾花鯉發生暴發性死亡，但因缺乏可供參考的防治措施及用藥依據，導致大量死亡，經濟損失嚴重?！緮M解決的關鍵問題】對引起該養殖示范基地禾花鯉暴發性死亡征的病原菌進行分離鑒定，并進行藥物敏感性試驗，旨在明確引起禾花鯉發生暴發性死亡征的病原菌及其耐藥性，為有效防控禾花鯉暴發性死亡征提供科學依據。

1 材料與方法

1. 1 病原菌分離與純化

病樣于2014年6月13日采自廣西全州縣某禾花鯉養殖示范基地，為發病瀕死的禾花鯉。病魚個體重10～15 g，主要癥狀為體表發紅，眼球突出，肛門發紅，腹部膨大。剖檢發現，病魚體腔內有大量淡紅色腹水，腸道發紅，肝胰臟腫大。無菌條件下從病魚的肝臟、腎臟等器官取樣，分別劃線接種于普通營養瓊脂培養基和兔血瓊脂培養基（均購自鄭州安圖生物工程股份有限公司）上，36 ℃培養18～24 h，挑取菌落形態一致的優勢菌株經純化后轉接到斜面培養基，4 ℃保存備用。

1. 2 細菌鑒定

1. 2. 1 生化鑒定 分離菌株的氧化酶試驗結果呈陽性，故選用法國梅里埃公司生產的API 20NE生化鑒定試劑條按說明進行細菌生化鑒定。

1. 2. 2 分子鑒定 按劉杰等（2015）的方法收集菌體，提取細菌基因組DNA后-20 ℃保存備用。16S rRNA基因擴增采用由生工生物工程（上海）股份有限公司合成的細菌通用引物，正、反向引物分別為fD1：（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和rp2（5'-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'）。反應體系25.0 μL：10×PCR緩沖液2.5 μL，10 mmol/L dNTPs 0.5 μL，25 mmol/L MgC12 2.5 μL，10 μmol/L上、下游引物各1.0 μL，Taq DNA聚合酶（5 U）0.3 μL，DNA模板2.0 μL，ddH2O補足至25.0 μL。擴增程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 2 min，進行29個循環；最后72 ℃延伸10 min。PCR反應結束后以1.5%瓊脂糖凝膠電泳（100 V，35 min）進行鑒定，用凝膠成像系統觀察，并根據出現的電泳條帶記錄結果。PCR產物送至華大生物技術有限公司進行序列測定。

1. 3 分離菌株致病性測定

用于人工回歸感染試驗的禾花鯉購于普通市場，平均體重35.1 g。經過20 d的暫養后隨機抽取5尾進行剖檢觀察，并取其肝臟、脾臟、腎臟、腦組織進行細菌接種，確認魚體健康無病、無細菌感染后用于人工回歸感染。按常規方法將分離菌株進行擴大培養后以無菌生理鹽水洗下菌落并制成菌懸液，以WGZ-2-XJ細菌濁度儀調整菌懸液的細菌濃度。第1次感染試驗時將健康禾花鯉隨機分成試驗組和對照組，每組30尾，采取胸鰭基部注射感染，其中試驗組每尾注射0.2 mL菌懸液，對照組注射相同劑量的無菌生理鹽水。注射后，于同樣環境下按組分開飼養，連續觀察15 d，記錄受試魚的發病癥狀及死亡情況。取第1次感染試驗中發病癥狀與自然發病癥狀相似的瀕死個體，再進行細菌分離與純化，按第1次人工感染試驗的方法進行第2次人工感染試驗。

1. 4 藥敏試驗

試驗用藥敏片共28種，除氟苯尼考、磺胺二甲嘧啶、鹽酸沙拉沙星、磺胺-6-甲氧嘧啶、磺胺對甲氧嘧啶和復方磺胺嘧啶6種由廣西水生動物病害診斷實驗室按于進勛等（2000）的方法自行制備外，其余22種購自杭州天和微生物試劑有限公司。藥敏試驗采用K-B紙片擴散法，其結果按美國NCCLS 2000的標準進行判定。

2 結果與分析

2. 1 分離菌株的形態及培養特性

從發病瀕死禾花鯉的肝臟中分離獲得1株優勢菌株，編號為TH5。該菌株為革蘭氏陰性短桿菌，微溶血。菌落圓形，邊緣光滑，中央凸起，呈肉色、灰白色或略帶淡桃紅色光澤。菌體兩端鈍圓，多數單個排列，無芽孢，無莢膜。

2. 2 細菌鑒定結果

2. 2. 1 生化鑒定結果 根據API 20NE生化鑒定結果（表1），可確定菌株TH5的API陽性代碼值為7176755，

初步鑒定為簡達氣單胞菌（Aeromonas jandaei）。

2. 2. 2 分子鑒定結果 PCR擴增得到分離菌株TH5的16S rRNA基因片段，大小為1410 bp（圖1），與預期結果一致。擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠回收提純后進行測序，將測序結果與GenBank中的16S rRNA基因序列進行同源性比對，以Clustal X進行多重序列比對分析，并用MEGA 6.1構建系統發育進化樹（圖2）。根據構建的系統發育進化樹和比對分析結果可知，分離菌株TH5（GenBank登錄號KU143916）與簡達氣單胞菌標準菌株ATCC 49568（NR 119040）和CDC 0787-80（NR 037013）同聚一簇，其相似度分別為99.9%和99.6%。

2. 3 分離菌株的人工回歸感染試驗結果

經人工注射感染后，試驗組禾花鯉出現鰓絲末端溶解，體表發白且有大量黏液，腹部腫脹，肛門發紅，剖檢發現其肝臟腫大（部分病魚肝臟糜爛），體腔有腹水，膽囊腫大，脾臟腫大等癥狀。經取樣接種，可分離獲得與菌株TH5一致的菌株。對照組禾花鯉攝食、活動基本正常，未出現死魚現象。由表2可以看出，菌株TH5對禾花鯉有較強的致病性，可引起禾花鯉大量死亡，兩次人工回歸感染試驗的平均死亡率達48.33%，表明分離菌株TH5是引起禾花鯉暴發性死亡征的病原菌。

2. 4 藥敏試驗結果

藥敏試驗結果（表3）表明，菌株TH5對復方新諾明、環丙沙星、多粘菌素B、左氟沙星、依諾沙星、氧氟沙星、多西環素、氟苯尼考、磺胺二甲嘧啶、磺胺對甲氧嘧啶和復方磺胺嘧啶高度敏感，對青霉素G、復達欣、先鋒霉素VI、菌必治、新霉素、新生霉素、先鋒必和鹽酸沙拉沙星已產生耐藥性。

3 討論

目前，關于鯉魚細菌性疾病已有大量報道，其病原菌主要有嗜水氣單胞菌（A. hydrophila）（王澤洲等，1997；張玉芬等，2011）、溫和氣單胞菌（A. sobria）（韓英等，2005）、豚鼠氣單胞菌（A. caviae）（韓英等，2005）、維氏氣單胞菌（A. veronii）（龔倩等，2010）、熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）（于翔，2011；沈曉靜等，2014；周陽等，2015）、鯰愛德華氏菌（Edwardsiella ictaluri）（于翔，2011）、摩氏摩根氏菌（Morganella morganii）（韓娜娜等，2013）、肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）（盧玉婷等，2014）和殺鮭氣單胞菌（A. salmonicida）（王海娟和王利，2015）等。本研究從患暴發性死亡征禾花鯉魚病樣中分離獲得的病原菌為簡達氣單胞菌，與溫貴蘭等（2012）從彩鯉中分離獲得的病原菌種類相同?？梢?，引起鯉魚病害的病原菌種類呈多樣性，除了淡水養殖中常見的嗜水氣單胞菌和溫和氣單胞菌外，近年來又分離出多種新的病原菌，給禾花鯉細菌性疾病的診治帶來極大困難。

簡達氣單胞菌隸屬于氣單胞菌屬（Aeromonas），在《伯杰細菌鑒定手冊》（1984年版）中被稱為溫和氣單胞菌。Carnahan等于1991年確定了簡達氣單胞菌的分類地位。簡達氣單胞菌可引起人類腹瀉（王曉萍等，1997）和水牛猝死癥（方福明等，2008），近年來發現該菌在淡水魚養殖池塘中也有分布（王一娟，2010），可感染引起養殖魚類發病死亡（溫貴蘭等，2012；楊寧等，2015），表明簡達氣單胞菌是一種人—畜—魚共患的病原菌。本研究以×108 CFU/mL的簡達氣單胞菌懸液對健康禾花鯉進行人工感染試驗，其平均致死率為48.33%，明顯低于該菌對羅非魚的致病力（楊寧等，2015）。另外，本研究中簡達氣單胞菌的溶血性與從甌江彩鯉中分離到的菌株（溫貴蘭等，2012）也不同。從禾花鯉和甌江彩鯉中分離獲得的簡達氣單胞菌在溶血性和致病力方面存在明顯差異，其是否與菌株所攜帶的毒力基因有關尚待進一步探究。

本研究的藥敏試驗結果表明，菌株TH5對復方新諾明、環丙沙星、多粘菌素B等11種藥物高度敏感，對青霉素G、復達欣、先鋒霉素VI等8種藥物已產生耐藥性。這與從甌江彩鯉中分離獲得的菌株HX201006-2（溫貴蘭等，2012）、羅非魚上分離獲得的菌株NL05（楊寧等，2015）均不相同，究其原因可能與不同養殖戶的用藥習慣有關。致病性嗜水氣單胞菌和溫和氣單胞菌連續低濃度接觸某種藥物時可對該藥物產生很強的耐藥性（黃鈞等，2013；黃新財等，2013）。因此，在生產用藥過程中應避免經常使用同一類藥物，且要做到科學精準用藥，避免因亂用和濫用藥物而導致病原菌產生耐藥性。

4 結論

引起廣西全州縣養殖禾花鯉暴發性死亡征的病原菌是簡達氣單胞菌，生產中可選用復方新諾明、環丙沙星、多粘菌素B等藥物進行防治。

參考文獻：

方福明，周家學，曠天揚，王永賢，張文東，張應國. 2008. 一起水牛猝死癥的病因調查與防制[J]. 中國畜牧獸醫，35（2）：104-106.

Fang F M，Zhou J X，Kuang T Y，Wang Y X，Zhang W D，Zhang Y G. 2008. Etiological research，prevention and cure for cases of buffalos sudden death[J]. China Animal Husbandry and Veterinary Medicine，35（2）：104-106.

龔倩，高淑琴，單曉楓，郭偉生，孟慶峰，王偉利，錢愛東. 2010. 框鏡鯉致病性維氏氣單胞菌的分離鑒定[J]. 中國預防獸醫學報，32（12）：981-983.

Gong Q，Gao S Q，Shan X F，Guo W S，Meng Q F，Wang W L，Qian A D. 2010. Isolation and identification of pathogenic Aeromonas veronii from Cyprinus carpio[J]. Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine，32（12）：981-983.

韓娜娜，劉萬建，耿偉光，黃倢，史成銀. 2013. 錦鯉摩氏摩根氏菌的分離鑒定與藥敏性研究[J]. 中國預防獸醫學報，35（9）：729-732.

Han N N，Liu W J，Geng W G，Huang J，Shi C Y. 2013. Isolation，identification of a pathogenic Morganella morganii from ornamental koi（Cyprinus carpio koi）[J]. Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine，35（9）：729-732.

韓英，劉敏，姜艷平. 2005. 鯉魚出血病病原的研究和藥敏試驗[J]. 東北農業大學學報，36（5）：593-597.

Han Y，Liu M，Jiang Y P. 2005. Study on the pathogens of bleeding disease in Cyprinus carpio haematopterus Temminck et Schlegel and drug sensitivity test[J]. Journal of Northeast Agricultural University，36（5）：593-597.

黃德文. 2009. 池塘精養禾花鯉效益高[J]. 漁業致富指南，（17）：40.

Huang D W. 2009. Intensive ponds of Procypris merus get high benefit[J]. Fishery Guide to be Rich，（17）：40.

黃鈞，彭民毅，羅華平，胡大勝，黃艷華，溫華成，施金谷，彭亞. 2013. 黃顙魚源溫和氣單胞菌對氟苯尼考耐藥性獲得與消失速率研究[J]. 西南農業學報，26（3）：1278-1281.

Huang J，Peng M Y，Luo H P，Hu D S，Huang Y H，Wen H C，Shi J G，Peng Y. 2013. Gaining and disappearing rates in drug resistance of florfenicol with Aeromonas sobria by yellow Catfish（Pelteobagrus fulvidraco）[J]. Southwest China Journal of Agricultural University，26（3）：1278-1281.

黃新財，彭民毅，黃鈞，胡大勝，彭亞，黃艷華，施金谷，溫華成，韋貴花. 2013. 黃顙魚源嗜水氣單胞菌對鹽酸沙拉沙星耐藥性獲得與消失速率的測定[J]. 南方農業學報，44（10）：1731-1734.

Huang X C，Peng M Y，Huang J，Hu D S，Peng Y，Huang Y H，Shi J G，Wen H C，Wei G H. 2013. Acquisition and vanishing rate of drug resistance of Aeromonas hydrophila in Pelteobagrus fulvidraco against sarafloxacin hydrochloride[J].

Journal of Southern Agriculture，44（10）：1731-1734.

劉杰，龍宜楠，黃鈞，胡大勝，彭亞，梁靜真，韓書煜，植淇業，劉斌. 2015. 黃顙魚暴發性流行病病原的分離鑒定及其3種毒力基因檢測[J]. 淡水漁業，45（3）：1-6.

Liu J，Long Y N，Huang J，Hu D S，Peng Y，Liang J Z，Han S Y，Zhi Q Y，Liu B. 2015. Isolation，identification and virulence genes detection of bacterial pathogen from Pelteobagrus fulvidraco Richardson with fulminant epidemic[J]. Freshwater Fisheries，45（3）：1-6.

盧玉婷，鄭丹丹，胡揚揚，張雅斌，張培軍，李月紅，冷東澤. 2014. 鯉魚肺炎克雷伯氏菌分離與鑒定[J]. 中國獸藥雜志，48（9）：9-13.

Lu Y T，Zheng D D，Hu Y Y，Zhang Y B，Zhang P J，Li Y H，Leng D Z. 2014. Isolation and identification of Klebslella pneumoniae from carp[J]. Chinese Journal of Veterinary Drug，48（9）：9-13.

莫玉軍. 2003. 禾花鯉池塘養殖技術[J]. 中國水產，（6）：46.

Mo Y J. 2003. Pond-culture technique of Procypris merus[J]. China Fisheries，（6）：46.

沈曉靜，胡秀彩，蘭云，李雪，朱愛華，張培，呂愛軍. 2014. 錦鯉熒光假單胞菌的分離鑒定及藥敏試驗[J]. 水產科學， 33（7）：443-446.

Shen X J，Hu X C，Lan Y，Li X，Zhu A H，Zhang P，Lü A J. 2014. Drug susceptibility，isolation and identification of pathogenic bacterium Pseudomonas fluorescens from koi carp（Cyprinus carpio）[J]. Fisheries Science，33（7）：443-446.

唐春. 2004. 禾花鯉稻田養殖技術[J]. 科學養魚，（1）：16-17.

Tang C. 2004. Aquaculture technique of Procypris merus in paddy field[J]. Scientific Fish Farming，（1）：16-17.

王海娟，王利. 2015. 鯉魚殺鮭氣單胞菌的分離鑒定及耐藥性分析[J]. 中國畜牧獸醫，42（1）：192-196.

Wang H J，Wang L. 2015. Identification and antibiotic resistance analysis of Aeromonas salmonicida isolated from Cyprinus carpio[J]. China Animal Husbandry and Veterinary Medicine，42（1）：192-196.

王澤洲，張道永，林毅，楊曉梅，劉萬鈞，胡景韶. 1997. 網箱鯉魚嗜水氣單胞菌病研究[J]. 中國獸醫學報，17（3）：304-305.

Wang Z Z，Zhang D Y，Lin Y，Yang X M，Liu W J，Hu J S. 1997. Study on the Aeromonas hydrophila infection in the carp[J]. Chinese Journal of Veterinary Science，17（3）：304-305.

王曉萍，陳拱立，郭維植. 1997. 從腹瀉患者中檢出簡達和舒伯特氣單胞菌[J]. 海峽預防醫學雜志，3（1）：26-27.

Wang X P， Chen G L， Guo W Z. 1997. Aeromonas jandaei and A. schubertii were found from diarrhea patient[J]. Strail Journal of Preventive Medicine， 3（1）：26-27.

王一娟. 2010. 江蘇地區大宗淡水魚養殖池塘氣單胞菌分離、鑒定和遺傳多樣性研究[D]. 南京：南京農業大學.

Wang Y J. 2010. Studies on isolation， identification and genetic diversity of Aeromonas from conventional freshwater fish ponds in Jiangsu province[D]. Nanjing：Nanjing Agricultural University.

溫貴蘭，袁子嬋，張毅，程振濤，周碧君，吳學祥，龔新勇. 2012. 甌江彩鯉簡達氣單胞菌的16S rDNA分子鑒定與藥敏分析[J]. 黑龍江畜牧獸醫，（12）：78-80.

Wen G L，Yuan Z C，Zhang Y，Cheng Z T，Zhou B J，Wu X X，Gong X Y. 2012. 16S rDNA molecular identification and drug sensitive analysis of Aeromonas jandaei from Oujiang color common carp[J]. Heilongjiang Animal Science and Ve-

terinary Medicine，（12）：78-80.

楊寧，姜芳燕，黃海，焦健. 2015. 羅非魚（Tilapia nilotica）簡達氣單胞菌病的病原分離鑒定及藥敏試驗[J]. 漁業科學進展，36（4）：83-88.

Yang N，Jiang F Y，Huang H，Jiao J. 2015. Isolation，identification and drug sensitive test of Aeromonas jandaei from tilapia （Tilapia nilotica）[J]. Progress in Fishery Sciences，36（4）：83-88.

楊四秀，蔣艾青. 2009. 禾花鯉含肉率與肌肉營養成分分析[J]. 水生態學雜志，2（2）：154-157.

Yang S X，Jiang A Q. 2009. Analysis on the flesh rate and the muscle nutrition component in Procypris merus[J]. Journal of Hydroecology，2（2）：154-157.

于進勛，潘德成，張鳳玲，姚新玲，管向陽. 2000. 獸醫臨床上藥敏試驗紙片的制作及應用[J]. 遼寧畜牧獸醫，（6）：15-16.

Yu J X，Pan D C，Zhang F L，Yao X L，Guan X Y. 2000. Manufacture and application of drug sensitive test paper in clinical veterinary[J]. Liaoning Journal of Animal Husbandry and Veterinary Medicine，（6）：15-16.

于翔. 2011. 鯉魚豎鱗病病原的研究[J]. 河北漁業，（7）：1-4.

Yu X. 2011. Pathogen causing vertical scale disease of carp[J]. Hebei Fisheries，（7）：1-4.

張玉芬，張秀軍，亢喜剛. 2011. 鯉魚細菌性敗血癥的病原菌鑒定及疫苗研制[J]. 醫學動物防制，27（1）：44-46.

Zhang Y F，Zhang X J，Kang X G. 2011. Pathogen identification and vaccine production of bacterial septicem in carp[J]. Journal of Medical Pest Control，27（1）：44-46.

周陽，莊國慶，林鋒，蔣廷亞，袁少飛，高力，施海峰. 2015. 錦鯉致病性假單胞菌的分離鑒定及生物學特性研究[J]. 西南農業學報，28（4）：1830-1833.

Zhou Y，Zhuang G Q，Lin F，Jiang T Y，Yuan S F，Gao L，Shi H F. 2015. Isolation and biological characterization of Pseudomonas sp. from Cyprinus carpio koi[J]. Southwest China Journal of Agricultural Sciences，28（4）：1830-1833.

Carnahan A M，Fanning G R，Joseph S W. 1991. Aeromonas jandaei（formerly genospecies DNA group 9 A. sobria），a new sucrose-negative species isolated from clinical specimens[J]. Journal of Clinical Microbiology，29（3）：560-564.

（責任編輯 蘭宗寶）