硝磺草酮降解菌HZ-2制劑固定化載體材料性能的比較

張晶晶， 楊孟然， 劉　婕， 蔣剛彪， 鐘國華

(1 華南農業大學 農學院，廣東 廣州 510642； 2 華南農業大學 材料與能源學院，廣東 廣州510642)

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硝磺草酮降解菌HZ-2制劑固定化載體材料性能的比較

張晶晶1， 楊孟然1， 劉婕1， 蔣剛彪2， 鐘國華1

(1 華南農業大學 農學院，廣東 廣州 510642； 2 華南農業大學 材料與能源學院，廣東 廣州510642)

摘要：【目的】研究改性蔗渣MSB、MSB-Mo、MSB-Cl對硝磺草酮降解菌HZ-2的降解能力的影響?！痉椒ā恳赃@3種改性蔗渣和活性炭為固定化載體，對固定化后菌制劑的降解性能進行研究?！窘Y果】降解菌制劑培養48 h后，D600 nm均較高，表明MSB、MSB-Mo、MSB-Cl及活性炭均具備較強的固菌能力；培養3 d 后，以改性蔗渣為載體的固菌制劑對LB培養基中硝磺草酮的降解率高于85%，顯著優于活性炭，其中改性蔗渣MSB-Mo效果突出，降解率達96.35%。添加葡萄糖輔料7 d后，這3種改性蔗渣對土壤中硝磺草酮的降解率均高于99%?！窘Y論】改性蔗渣MSB-Mo是固定降解菌株的最佳新型生物載體材料。

關鍵詞：硝磺草酮； 改性蔗渣； 載體材料； 降解能力

硝磺草酮(甲基磺草酮)，化學名稱為2-[4-(甲基磺?；?-2-硝基苯?；鵠-3-環己二酮，是一類能夠抑制羥基苯基丙酮酸酯雙氧化酶(HPPD),使雜草產生白化癥狀的新型三酮類除草劑，適用于苗前與苗后[1]。硝磺草酮是在玉米田上單獨使用或與阿特拉津和氯乙酰胺混用的廣譜性除草劑，對環境友好[2]。但是隨著硝磺草酮使用量和施用頻數增加，對環境的潛在影響逐步體現[3]。因此，研究硝磺草酮的生物修復技術，對農產品安全生產和環境保護具有重要的前瞻意義。

微生物分解除草劑在農藥降解中占很大比重[4],生物修復高效、安全、花費少、應用范圍廣[5],但菌株田間使用率低和田間不確定因素多，降解菌制劑開發力度小、難度大。微生物的固定化技術可以將優勢菌種固定，使其保持較高的活性，而且可以反復、連續利用，從而提高降解效率[6-8]，具有單位體積內微生物細胞密度高、反應迅速、穩定性高、耐毒害能力強等優點[9]。目前，蔗渣已成功運用于造紙工業、乙醇、氫氣和木糖醇生產、食用菌栽培、高性能吸附材料開發等[10]。蔗渣在生產乙醇和木糖醇的過程中，是將目標微生物或細胞固定在蔗渣上，然后通過化學反應生產目標產物[11]。已有研究[12]表明利用蔗渣和海綿作為載體的固定化微生物除油效果良好。選用蔗渣作為農藥殘留降解菌制劑的載體材料，制作方便、資源豐富、成本低廉、商業化前景廣闊，具有不可小覷的發展潛力。本文篩選并評價了MSB、MSB-Mo、MSB-Cl及活性炭對降解菌HZ-2的固菌能力，以期為固定化微生物技術在農藥降解方面的應用提供理論依據。

1材料與方法

1.1材料

供試菌株:以硝磺草酮為碳源的菌株HZ-2，由華南農業大學昆蟲毒理研究室從農藥廠廢水處理池活性污泥中篩選而得。根據其生理生化特性和16S rDNA序列同源性分析，將該菌株鑒定為短小芽孢桿菌Bacilluspumilus[13]。

LB液體培養基：蛋白胨10 g·L-1，酵母提取物5 g·L-1，氯化鈉10 g·L-1；固體培養基為液體培養基添加15 g·L-1的瓊脂。

改性蔗渣MSB、MSB-Mo及MSB-Cl由華南農業大學材料與能源學院蔣剛彪教授課題組提供，具體改性方法見文獻[14]?；钚蕴?0和100目，購自上海海諾炭業有限公司。

藥劑：硝磺草酮標準品，純度98%(w)，由廣東省佛山市盈輝作物科學有限公司提供。

1.2方法

1.2.1降解菌的培養與降解菌制劑的制備將菌株HZ-2接種于LB固體培養基平板上，30 ℃ 恒溫培養36 h，挑取生長良好的單菌落，無菌操作條件下接種到LB液體培養基中，于30 ℃ 、180 r·min-1搖床培養，4 800 r·min-1離心10 min收集菌體，用無菌水洗滌后稀釋成不同濃度的菌懸液。取0.1 g載體材料，加入108cfu·mL-1菌液2 mL后密封，30 ℃、180 r·min-1震蕩培養，掛膜24 h后離心，無菌水沖洗沉淀，20 ℃真空烘至近干。多次制備密封待用。

1.2.2載體中降解菌的生長動態測定將固有降解菌的載體材料0.1 g置于50 mL LB液體培養基中，用同等質量的載體材料處理及108cfu·mL-1菌液2 mL處理為對照，30 ℃ 、180 r·min-1振蕩培養，測定培養0、24、48 h后的D600 nm。

1.2.3硝磺草酮在LB培養基中添加回收率的測定取滅菌新鮮LB培養基50 mL，添加硝磺草酮母液，使其最終質量濃度分別為1、5、10 mg·L-1,3個重復。加二氯甲烷30 mL后超聲20 min，混合液移入分液漏斗，用30 mL二氯甲烷分2次沖洗，沖洗液一并移入分液漏斗，搖勻，劇烈振蕩3～5 min，靜置分層，下層經20 g無水硫酸鈉過濾至圓底燒瓶，重復萃取3次，濾液并入燒瓶，45 ℃濃縮至近干，用乙腈分3次洗滌圓底燒瓶并定容至10 mL，最后取2 mL 經 0.45 μm 有機濾膜過濾至進樣瓶，HPLC法檢測。

1.2.4降解菌制劑活性的初步測定將固菌制劑0.1 g 置于50 mL LB液體培養基中，培養基中初始硝磺草酮50 mg·L-1，震蕩培養3 d后，離心取上清液，HPLC法檢測。

HPLC檢測參照文獻[13]：HP-1100型高效液相色譜工作站(Agilent，美國)，C18反相柱(Kromasil C18 4.6 mm×150 mm, 5 μm, 100 A)，流動相為V(甲醇)∶V(w為0.05%的磷酸溶液)=55∶45，流速1 mL·min-1，柱溫30 ℃，檢測波長268 nm，進樣量10 μL。

1.2.5硝磺草酮在土壤中添加回收率的測定取20 g土壤于250 mL三角瓶，添加硝磺草酮母液，使其最終濃度為1、5、10 mg·kg-1,3個重復，加入60 mLV(蒸餾水)∶V(乙腈) =1∶5的混合溶液超聲30 min，過濾至裝有5 g氯化鈉的具塞量筒，震蕩分層，取上清液25 mL于圓底燒瓶，55 ℃濃縮至近干，用乙腈分3次洗滌圓底燒瓶并定容至10 mL，最后取2 mL 溶液經 0.45 μm有機濾膜過濾至進樣瓶，待HPLC法檢測。

1.2.6降解菌制劑在土壤中的活性測定取10 g滅菌土壤于150 mL三角瓶，添加硝磺草酮母液，使其最終濃度為100 mg·kg-1。加入0.1 g降解菌制劑和10 mL無菌水后震蕩均勻，以直接加入菌液的土壤處理為對照，封閉震蕩培養5 d。HPLC法測定土壤中硝磺草酮的殘留量，計算降解率。

1.2.7添加葡萄糖對制劑降解活性的影響在每0.1 g降解菌制劑中添加5 mg葡萄糖，加入10 g滅菌土壤置于150 mL三角瓶，加入10 mL無菌水后震蕩均勻，使土壤硝磺草酮終濃度為50 mg·kg-1，封閉震蕩培養，測定3、5、7 d后土壤中硝磺草酮的殘留量，計算降解率。

2結果與分析

2.1載體材料的固菌增殖能力的初步評價

將降解菌HZ-2分別固定于改性蔗渣(MSB、MSB-Mo及MSB-Cl)以及活性炭(40和100目)5種載體材料中，分別測定培養0、24、48 h后的D600 nm(菌液稀釋20倍)(表1)。結果表明，開始培養時，D600 nm差異較大，這可能是由于各種載體材料吸光度不同；培養24 h后，5種供試載體材料D600 nm均顯著提高；培養48 h后， 5種材料固菌后D600 nm均較高，說明這些材料均具備較強的固菌能力，降解菌均得到了進一步的增殖，改性蔗渣MSB-Mo、MSB-Cl的固菌能力稍強于其他載體材料。

表1供試載體材料固菌后的D600 nm

Tab.1D600 nmof tested carrier material after immobilizing bacteria

固菌材料0h24h48hMSB0.037d0.290cd0.400deMSB-Mo0.095a0.350b0.470abMSB-Cl0.085b0.400a0.485a活性炭40目0.038d0.316bc0.373e活性炭100目0.056c0.339bc0.423cdCK0.021e0.330bc0.430bcd

1)同列數據中后凡具有一個相同字母者，表示差異不顯著(P>0.05，DMRT法)。

2.2硝磺草酮在LB培養基和土壤中的添加回收率

硝磺草酮在LB培養基中的添加質量濃度為1、5和10 mg·L-1時，添加回收率分別為108.24%、91.96%和91.79%，變異系數分別為1.74%、2.84%和0.60%,均小于5.00%；硝磺草酮在土壤中的添加濃度為1、5、10 mg·kg-1時，添加回收率分別為82.32%、82.74%和88.75%，變異系數分別為0.96%、3.75%和1.62%,均小于5.00%，符合殘留檢測要求，表明試驗所采用的LB培養基和土壤中提取硝磺草酮的方法穩定可靠。

2.3降解菌制劑對LB培養基和土壤中硝磺草酮的降解能力

改性蔗渣固菌制劑對硝磺草酮的降解效果明顯，降解率均大于85%?；钚蕴坎牧现苿┙到饴曙@著低于改性蔗渣材料，這可能與蔗渣的結構特點有關。蔗渣富含纖維素、疏松多孔，對降解菌有良好的固定能力；而且蔗渣本身具有強烈的吸附作用，能吸附土壤中的重金屬[15]。

在這3種改性蔗渣材料中， MSB-Mo、MSB-Cl效果突出，降解率分別達96.35%和93.22%，顯著高于MSB的89.78%，更顯著優于活性炭載體處理組(40目為64.05%和100目為43.22%)的降解率。其中，MSB-Mo相較于MSB-Cl效果更好，故后續其他試驗未再研究活性炭的處理效果，而以3種改性蔗渣材料作為研究對象。

降解菌制劑對土壤中硝磺草酮的降解能力見圖1。結果表明，處理5 d后，各處理降解率均不足30%，不能滿足實際生產的要求。在LB培養基和土壤條件下硝磺草酮降解率差異較大的原因，可能是載體材料未能提供足夠的營養物質，降解菌不能及時繁殖，降解菌數量不足而導致降解率低下。

柱子上凡具有一個相同字母者,表示差異不顯著(P>0.05,DMRT法)。

圖1載體固菌制劑對土壤硝磺草酮的降解作用

Fig.1Degradation of mesotrione in soil by immobilized microbial preparations

2.4葡萄糖對改性蔗渣載體固菌制劑降解活性的影響

在上述載體固菌制劑中添加葡萄糖，使制劑初步具備菌株基本營養條件，為其在土壤中定植、生長、抵御其他微生物的營養競爭等提供可能。從圖2中可以看出，處理3 d后，硝磺草酮降解率達50%以上，處理7 d后，改性蔗渣MSB、MSB-Mo和MSB-Cl為載體的降解菌制劑對土壤硝磺草酮的降解率分別為99.22%、99.49%和99.41%，說明添加葡萄糖能提高改性蔗渣作為載體的降解菌制劑的降解能力。結合降解菌制劑對LB培養基中硝磺草酮的降解能力影響的結果，改性蔗渣MSB-Mo是固定降解菌株的最佳載體材料。

相同時間、不同柱子上凡具有一個相同字母者，表示差異不顯著(P>0.05,DMRT法)。

圖2添加葡萄糖后改性蔗渣固菌制劑對土壤硝磺草酮的降解作用

Fig.2Degradation of mesotrione in soil by modified bagasse as immobilized microbial preparations after adding glucose

3討論與結論

固定化是一種常用的技術手段，固定化微生物技術可以提高微生物密度、加快微生物生化反應速率和提高微生物對環境的耐受力[16]。載體的種類是決定固定化微生物性能的關鍵因素之一[17]。從本研究來看，改性蔗渣對硝磺草酮的降解率顯著優于活性炭。天然疏松多孔的蔗渣不僅能作為微生物的附著載體提供微生物生長所需的營養物質，而且還能充當疏松劑提高土壤的透氣性，可用于微生物的固定。國內外已有研究[18-20]將蔗渣載體應用于微生物發酵、生產丁醇以及降解苯酚等，但鮮見其應用于農藥降解殘留的研究。本研究結果表明，改性蔗渣MSB、MSB-Mo、MSB-Cl固菌后與50 mg·L-1硝磺草酮在LB培養基中共培養3 d，對硝磺草酮的降解率均高于80%，顯著優于活性炭；葡萄糖的適量添加可顯著加強載體固菌制劑降解土壤硝磺草酮的效果，改性蔗渣MSB、MSB-Mo、MSB-Cl載體制劑按照質量比5%的比例添加葡萄糖，7 d后對土壤中起始50 mg·kg-1硝磺草酮的降解率均高于99%。這些結果可為將蔗渣開發成環境污染物降解制劑的載體材料提供重要參考。今后將進一步深入研究其作用機制和應用技術等。

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【責任編輯霍歡】

Pexformance comparison of different carrier materials for immobilization of mesotrione-degrading strain HZ-2

ZHANG Jingjing1,YANG Mengran1,LIU Jie1,JIANG Gangbiao2,ZHONG Guohua1

(1 College of Agriculture, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China;2 College of Materials and Energy, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China)

Abstract：【Objective】 To evaluate the effect of modified bagasse (MSB, MSB-Mo and MSB-CI) on the immobilization of mesotrione-degrading bacteria strain HZ-2.【Method】Three types of modified bagasse and activated carbon were selected as the carrier candidates for the bacterial immobilization， and the degradation abilities of immobilized composites were examined.【Result】After 48 hours culture, the high D600 nmvalues indicated that modified bagasse(MSB, MSB-Mo and MSB-CI) and activated carbon had strong abilities to immobilize bacteria. More than 85% of mesotrione in LB medium was degraded using modified bagasse as a carrier after 3 days of culture, which was higher than the results of activated carbon. MSB-Mo composite had the best degradation performance with a degradation rate of 96.35%.Moreover,mesotrione in soil was degraded over 99% after 7 days by adding glucose as support nutrient to the modified bagasse. 【Conclusion】 Modified bagassse MSB-Mo is the most available carrier material, which demonstrates the highest potential of being a new biological carrier material for immobilization of mesotrione-degrading bacteria strain.

Key words：mesotrione; modified bagasse; carrier material; degradation ability

中圖分類號：S482.2

文獻標志碼：A

文章編號：1001- 411X(2016)03- 0086- 04

基金項目：廣東省科技計劃項目(2014B020206003)

作者簡介：張晶晶(1993—)，女，碩士研究生，E-mail：784224089@qq.com；通信作者：鐘國華(1973—)，男，教授，博士，E-mail: guohuazhong@scau.edu.cn

收稿日期：2015- 07- 05優先出版時間：2016-04-15

優先出版網址：http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1110.s.20160415.1554.010.html

張晶晶， 楊孟然， 劉婕，等.硝磺草酮降解菌HZ-2制劑固定化載體材料性能的比較[J].華南農業大學學報，2016,37(3):86- 89.