Mutator轉座子介導的玉米甜質突變體側翼序列克隆

成　業,么大軒,劉云婷,胡文靜,段會軍

(河北農業大學,華北作物種質資源研究與利用教育部重點實驗室,河北 保定　071001)

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Mutator轉座子介導的玉米甜質突變體側翼序列克隆

成業,么大軒,劉云婷,胡文靜,段會軍

(河北農業大學,華北作物種質資源研究與利用教育部重點實驗室,河北 保定071001)

摘要：為了探討Mu轉座子使玉米發生甜質突變的分子機理,利用Mu-AFLP方法分離Mutator轉座子插入位點的側翼序列,并根據側翼序列的延伸設計一對特異性引物P1、P2,驗證轉座子插入的真實性,同時對插入位點所在的基因進行生物信息學分析。結果顯示:側翼序列長299 bp,插入位點位于第3染色體,該轉座子的插入屬于真實插入;突變基因全長5 746 bp,共編碼592個氨基酸;所編碼蛋白的理論分子量為67.5 kDa,疏水性氨基酸含量為42.06%,具有10個跨膜結構域,屬于親水性內膜蛋白。該結果為更好地利用Mutator轉座子創制甜玉米新種質奠定了基礎,也對揭示玉米胚乳發育與淀粉合成機制具有重要意義。

關鍵詞：甜玉米;Mutator轉座子;玉米;Mu-AFLP

甜玉米以其豐富的營養及甜、嫩、香等特點成為一種大眾化蔬菜[1-3]。由于甜玉米的遺傳基礎較窄,又沒有像普通玉米那樣有現成的雜種優勢模式可供應用,還需要利用SSR[4]、SNP[5]等分子標記去劃分雜種優勢類群,這給甜玉米的選育[6-7]帶來了困難,甜玉米育種已經遠遠落后生產的需求,因此，創制甜玉米種質資源顯得尤為重要。

Mutator介導法是創造玉米突變體的最有效的技術之一[8]。在玉米突變體庫的構建中有物理、化學、農桿菌介導的T-DNA[9-12]和轉座子插入突變等多種方法,其中Mutator具有較高的誘變頻率、低插入位點偏愛性和基因組內拷貝數多等特點。獲得Mu因子誘導的突變體后,必須通過對Mu插入位點側翼序列的生物信息學分析,才能預測突變基因功能。目前,用于分離Mu插入側翼序列的方法很多,主要包括PCR步移技術[13]、反向PCR技術[14-15]、熱不對稱交錯 PCR技術[16]、AFLP技術[17]等。其中AFLP所需DNA量少,擴增效率高,標記結果穩定可靠,對Mu插入位點側翼序列分離的準確性和反應的效率高,適合于分離Mu介導的玉米突變位點側翼序列。

本研究通過對Mutator轉座子介導的玉米甜質突變體側翼序列克隆及突變基因生物信息學分析,為玉米胚乳發育與淀粉合成機制的進一步研究奠定了基礎。

1材料和方法

1.1供試材料

玉米優良自交系綜31(Z31)為母本與具有原始來源活性的MuDR轉座子的Mu為父本進行雜交構建誘變群體M1,M1自交獲得M2果穗,篩選出Mu轉座子誘導的甜玉米突變體,作為本研究Mu-AFLP技術分離甜玉米突變體目標基因的試材。提取母本Z31、父本Mu和突變體的DNA作為分離Mu插入位點側翼序列的模板。

1.2試驗方法

1.2.1玉米基因組DNA的提取和純化采用液氮研磨,CTAB抽提的方法[18]提取玉米基因組DNA,并放于-20 ℃備用。

1.2.2Mu-AFLP方法分離插入位點側翼序列參照2008年,Wang等[19]的方法,研究分離Mu因子插入位點側翼序列。

1.2.3差異片段的回收、連接、轉化和測序利用6%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測選擇性擴增的差異片段,把Z31、Mu親本和突變體的選擇性擴增結果進行對比,發現突變體的差異片段,回收差異條帶,用選擴體系及PCR程序再次擴增。1.5%瓊脂糖回收檢測后連接到PMG-T載體上,將重組質粒轉化到大腸桿菌,藍白斑篩選陽性克隆,進行菌液PCR鑒定重組子,之后送上海生工有限公司測序。

1.2.4側翼序列的基因比對將去除載體后的序列在MaizeGDB(http://www.maizegdb.org)上與B73序列進行對比。

1.2.5插入位點真實性驗證在MaizeGDB將側翼序列上下延伸100～200 bp,使用Primer Premier 6.0軟件對該序列設計一對特異引物來進行插入位點的真實性檢測,并分別命名引物為P1、P2(圖1)。

圖1　Mu插入位點的真實性驗證引物設計示意圖

1.2.6ZmEMP70的生物信息學分析利用Mu-AFLP方法得到Mu轉座子插入位點側翼序列,將所獲得的序列在MaizeGDB(http://www.maizegdb.org/)中比對基因組獲得基因的全長。借助NCBI中的ORF Finder(http://www.nvbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi)工具尋找基因完整的ORF并且利用EditSeq軟件對該基因ORF進行分析。利用DNASTAR的Protean對蛋白質所含的氨基酸殘基和理論分子量,以及等電點和組成氨基酸的化學性質進行分析。利用http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/對ZmEMP70編碼的蛋白的二級結構進行分析。利用TMHMM-2.0對ZmEMP70 編碼的蛋白跨膜結構域進行分析。

2結果與分析

2.1插入位點側翼序列分離

預擴增后吸取10 μL進行瓊脂糖凝膠電泳檢測,得到彌散條帶(圖2),再進行下一步選擇性擴增。

1.DL2000 Marker;2.Mu親本;3.Z31親本;4.突變體。

通過選擇性擴增進行檢測,檢測結果見圖3。圖中明顯檢測到了突變體與親本的差異(A、B箭頭)條帶,并通過回收、測序等操作分離得到插入位點側翼序列為299 bp。

Z31.母本;Mu.父本;T.突變體。

2.2插入位點真實性檢測

利用P1、P2和S9、P2這2對引物分別對Mu活性親本、Z31、突變體進行檢測。結果顯示,以P1、P2為引物,Mu親本、Z31和突變體均有擴增條帶;用S9、P2這對引物檢測,Z31與Mu親本在約300 bp處均無帶而突變體有帶(圖4),證實其為真實插入。

1.Z31、2.Mu、3.突變體,是P1、P2擴增引物檢測結果;

2.3生物信息學分析

2.3.1基因定位及基因全長的獲得使用NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)去除載體序列,將去除載體后的序列在MaizeGDB(http://www.maizegdb.org)上與B73序列進行對比,發現該側翼序列與B73第3染色體上的一段區域完全匹配并上下延伸獲得基因全長(圖5)。

圖5　在基因組及染色體上的位置

2.3.2ZmEMP70的克隆及序列分析將側翼序列在MaizeGDB(http://www.maizegdb.org/)上進行比對并延伸得到基因的全長共5 746 bp。借助NCBI中的ORF Finder (http://www.nvbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi)工具尋找完整的基因ORF 1 896 bp,編碼592個氨基酸,5′UTR 117 bp,3′UTR 230 bp。2.3.3ZmEMP70編碼蛋白質的分析將ZmEMP70的1 896 bp的核苷酸序列翻譯成氨基酸序列并利用DNAStar的Protean進行分析,得到該基因編碼的蛋白含有592個氨基酸殘基,理論分子量67.5 kDa,等電點7.814;在pH=7時帶電量為3.317;疏水性氨基酸含量為42.06%,為親水性蛋白;酸性氨基酸含量為7.60%,堿性氨基酸含量為7.49%,極性氨基酸含量為26.69%(表1)。

2.3.4ZmEMP70編碼的蛋白跨膜結構域利用TMHMM-2.0對ZmEMP70編碼的蛋白跨膜結構進行分析,可見該蛋白具有10個跨膜結構域,屬于內膜蛋白(圖6)。

表1　ZmEMP70編碼的氨基酸組成分析

圖6　ZmEMP70所編碼蛋白的跨膜結構域

3討論

Mutator轉座子具有較高的突變頻率、較低的插入專一性、基因組拷貝數多等特點,因此，能夠在較少的群體內產生覆蓋全基因組的大量突變體[20-23],圍繞Mu轉座子,國內外構建了不少突變體庫,如斯坦福大學的RescueMu突變體庫[24],冷泉港實驗室的MTMdB突變體庫[25],華中農業大學實驗室等單位構建的Mu突變體庫[26]。通過Mu突變體庫己經成功分離克隆了諸多基因。利用Mu突變體庫篩選甜玉米突變體進行研究,將加速甜玉米新種質的創制。并有助于對玉米胚乳發育與淀粉合成機制的認識。本研究報道的甜玉米突變體,即是來自于Mu誘導的玉米突變體庫。

通過插入真實性檢測證明Mu轉座子插入到玉米基因組,該插入使得基因結構改變而失活。普通玉米發生突變而變甜涉及復雜的生化過程,玉米的可溶性糖含量可能與胚乳發育機制、淀粉的生物合成等有關。推測該基因能影響玉米胚乳的發育,但該基因的具體功能以及作用機理尚未明確,有望通過RNAi技術[27-29]對該基因進行進一步研究,從而更好地從分子水平控制玉米淀粉的合成。

本研究利用玉米轉座子Mutator插入突變的方法獲得甜玉米,由于Mutator轉座子屬于玉米的內源轉座子,所以不會對生態環境和食品安全構成威脅。然而,通過轉基因技術也可以有目的地創制甜玉米新種質,但當前學術界對轉基因食品安全性仍然存在很大爭議,并沒有一個確切的定論。就各國政府而言,各國對轉基因食品均抱有比較謹慎的態度。就我國而言,還是比較保守的,對于含有的任何轉基因成分,所有市售食品都必須明確標注。同時,大規模種植轉基因甜玉米品種還要防止基因污染,以免給生態環境帶來不良影響。因此,利用玉米內源Mu轉座子轉座而誘導甜玉米的方法更為安全。

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Cloning Flanking Sequences Sweet Corn Mutant of Maize Inserted byMutatorTransposon

CHENG Ye,YAO Daxuan,LIU Yunting,HU Wenjing,DUAN Huijun

(Agricultural University of Hebei,North China Key Laboratory for Crop Germplasm Resources of Education Ministry,Baoding071001,China)

Abstract：In order to investigate the molecular mechanism of Mu gene transfer in sweet corn mutant,the flanking sequence of the insertion site of Mutator gene was isolated by Mu-AFLP method,and the authenticity of transposon insertions was verified by a pair of specific primers P1 and P2 designed according to the extension of the flanking sequences.Meanwhile the genetic biological information of the insertion site was analyzed.The results showed that the flanking sequence was 299 bp,which was located on the third chromosome.The full length of the mutant gene was 5 746 bp,encoding 592 amino acid.The theoretical molecular weight of the encoding protein was 67.5 kDa,the hydrophobic amino acid content was 42.06%,which had 10 transmembrane.It belonged to hydrophilic membrane protein.This result laid a foundation for the better use of Mutator to create new germplasm of sweet corn and it was very important for the development of endosperm and starch synthesis in maize.

Key words:Sweet corn;Mutator transposons;Maize;Mu-AFLP

doi:10.7668/hbnxb.2016.02.006

中圖分類號：Q785

文獻標識碼：A

文章編號：1000-7091(2016)02-0028-04

作者簡介：成業(1992-),女,河北邢臺人,主要從事作物分子設計育種研究。通訊作者：段會軍(1965-),男,河北保定人,教授,博士,主要從事作物分子設計育種研究。

基金項目：國家“十二五”科技支撐計劃項目“糧食豐產科技工程”課題(2011BAD16B08;2012BAD04BO6;2013BAD07B05);河北農業大學創新創業項目

收稿日期：2016-02-11