甘藍型油菜TIP4;1基因的克隆與表達分析

葛風偉,江　一,趙惠新

(新疆特殊環境物種保護與調控生物學實驗室,新疆師范大學 生命科學學院,新疆 烏魯木齊　830054)

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甘藍型油菜TIP4;1基因的克隆與表達分析

葛風偉,江一,趙惠新

(新疆特殊環境物種保護與調控生物學實驗室,新疆師范大學 生命科學學院,新疆 烏魯木齊830054)

摘要：水孔蛋白是位于質膜和液泡膜等生物膜上主要負責水分跨膜運輸的通道蛋白。為了分析甘藍型油菜種子萌發過程水分調控的分子機制,采用RT-PCR法從甘藍型油菜種子中克隆了液泡膜內在蛋白(Tonop last intrinsic proteins,TIPs)TIP4;1基因片段序列,并對甘藍型油菜種子TIP4;1基因在種子萌發過程及干旱、低溫和鹽脅迫下的表達進行了qRT-PCR(Quantitative Real-time PCR)分析。結果表明,TIP4;1基因在干種子中表達水平很低,但是在種子萌發過程中表達量增加。此外,在干旱、低溫及鹽的脅迫處理下,TIP4;1基因的表達上調,結果暗示著該基因可能參與了甘藍型油菜種子萌發和逆境響應過程。隨著研究的深入,水孔蛋白的水分調控機制將進一步被揭示,這對于解決干旱脅迫和鹽脅迫等實際問題具有重大現實意義。

關鍵詞：甘藍型油菜;水孔蛋白;TIPs;萌發;qRT-PCR

植物很多生長發育過程都依賴水分在細胞間的流動,水分對于作物的產量也至關重要[1]。水孔蛋白(Aquaporin,AQP)屬于通道蛋白MIP超家族成員,AQPs可以實現水分等其他小分子溶質的跨膜運輸[2-3]。高等植物的AQPs主要位于質膜和液泡膜上,分別稱之為質膜內在蛋白(Plasmaintrinsicprotein,PIPs)、液泡膜內在蛋白(Tonoplastintrinsicproteins,TIPs)[4-7]。AQPs普遍存在于植物中,在種子萌發、細胞伸長、受精、逆境應答等植物生長發育過程中發揮關鍵作用[8-12]。特別是在種子吸水和早期胚胎發育階段,AQPs是水分跨膜運輸的主要途徑[13]。另外,植物AQPs的表達受到環境條件和植物激素的調節,已知干旱、高溫、低溫、高鹽和營養虧缺等環境脅迫均可調控AQPs的表達[12,14-16]。

迄今有關植物AQPs的研究主要集中在PIPs上。但有研究表明,TIPs的導水性能是PIPs的上千倍,更利于水分的快速轉移,因而其在細胞滲透壓及植物水分代謝的快速調節中可能起著更為重要的作用[17-19]。Sade等[19]研究發現,轉基因番茄(Solanum lycopersicum)株系SlTIP2;2的過量表達可使其液泡膜在鹽脅迫和干旱脅迫下依然具有很高的水通透性,并得以維持液泡對細胞質滲透壓的緩沖作用和提高抗逆性。植物AQPs的發現及其表達與調控研究無疑為人們從分子水平深入探討和闡明植物水分代謝及其調控機制提供了很好的契機。

甘藍型油菜(Brassica napus)屬于十字花科蕓薹屬雙子葉植物,是世界上主要的油料作物。迄今對于植物中水孔蛋白AQPs的研究大都集中在擬南芥、水稻、煙草、玉米等模式植物上,但有關甘藍型油菜水孔蛋白AQPs基因尤其是TIPs亞類基因的克隆和研究甚少。此外,對該基因在甘藍型油菜種子萌發過程中水分調控的分子機制還不清楚。種子萌發的質量直接決定幼苗的形態建成及后期的產量。因此,TIP基因的研究對于理解種子的萌發過程有重要意義。

1材料和方法

1.1試驗材料與試劑

試驗材料為當年新收獲的甘藍型油菜種子。TRIzol總RNA抽提試劑盒、MMLV第一鏈cDNA反轉錄試劑盒購自寶生物公司,DNA凝膠回收試劑盒、PCR擴增試劑盒購自北京天根生化科技有限公司,菌株為E.coliDH5α(新疆特殊環境物種保護與調控生物學實驗室保存),質粒為pMD18-T Vector(Invitrogen),其他試劑均為進口或國產分析純。

1.2甘藍型油菜TIP4;1基因的克隆

1.2.1試驗材料培養與總RNA的提取甘藍型油菜種子置于23 ℃恒溫箱中培養。收集吸水萌發后48h的種子,快速冷凍到液氮中,用于總RNA的提取。采用TRIzol法提取RNA,用紫外分光光度法測定RAN的OD值,檢測其純度。

1.2.2引物設計及RT-PCR擴增根據TIPs基因進化保守的特點,利用ClustalX軟件對從NCBI數據庫中搜索到的植物TIPs基因序列進行同源性比較,在保守區域找出保守區段。利用Primer5.0設計1對引物用于RT-PCR分析,上游引物F:5′-AGTCCAATACTGGTCATCCG-3′;下游引物R:5′-GATTTTGAGGGAAGCGGT-3′,引物由華大基因合成。取2μg甘藍型油菜總RAN,根據MMLV第一鏈cDAN反轉錄試劑盒(TaKaRa)合成第一鏈cDNA。以第一鏈cDNA為模板,用合成的特異性引物進行RT-PCR擴增分析。PCR擴增體系:cDNA2μL,F、R(10μmol/L)各1μL,MgCl2(25mmol/L)1.5μL,Taq酶0.5μL,10×PCRBuffer2.5μL,dNTPMixture(2.5mmol/L)2μL,用滅菌超純水定量補足至25μL。PCR反應程序:94 ℃預變性3min;94 ℃ 30s,64 ℃ 45s,72 ℃ 60s,共35個循環;最后72 ℃再延伸10min。獲得的擴增產物用1.0 % 瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。PCR擴增產物按照凝膠回收試劑盒(AxyGEN)說明進行純化回收。

1.2.3重組質粒的構建取2μL回收產物連接到pMD18-T載體,重組質粒構建按照說明書進行。將重組質粒轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞,置于37 ℃ 培養箱過夜培養,藍白斑篩選重組質粒。

1.2.4測序分析挑取單克隆菌落,進行PCR鑒定,并將陽性單克隆送上海英駿生物技術公司測序。測序結果使用Blast算法(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)進行分析。

1.3TIP4;1基因的qRT-PCR分析

1.3.1特異性引物的設計由于TIPs基因家族高度保守性的特點,因此進行qRT-PCR分析時設計特異性的引物顯得非常關鍵。使用Primer5軟件設計基因特異性引物,原則是設計引物時盡量避開這些保守區。為此,首先使用ClustalX軟件對NCBI上搜索到的植物TIPs基因進行核酸序列的同源比對,并找到這些序列的保守區,在設計特異性引物時盡量避開這些保守區。另外,對于設計的每對引物,至少都要保證有一條引物的3′ 末端是高度特異的。設計出1對特異性引物,上游引物:5′-CTCGTGCTTGCTGTATCTT-3′;下游引物:5′-CGGGAGTGACTTATTCGG-3′。為了保證每對引物的特異性,需將每對引物擴增的PCR產物送公司測序。

1.3.2TIP4;1基因在不同組織的表達分析為了分析不同器官中TIPs基因的表達情況,收集了種植于大田的甘藍型油菜植株的根、莖、葉、花和21DAP種子的材料,用于總RNA的提取。

qRT-PCR分析方法如下:使用qRT-PCR特異性引物,以不同組織的cDNA第一鏈為模板,在StepOneReal-timePCRsystem(ABI)上進行qPCR擴增。本試驗以甘藍型油菜的β-actin(序列號No.AF111812)作為內參。qRT-PCR的擴增程序如下(兩步法):95 ℃預變性10min;95 ℃ 15s,60 ℃ 60s,運行40個循環;接下來步驟是60～95 ℃的融解曲線。通過雙標準曲線法分析甘藍型油菜TIPs基因的相對表達量,用“平均值±標準差”來表示基因的相對表達量。每個試驗進行3次生物學重復。

1.3.3種子萌發過程TIP4;1基因的qRT-PCR分析在直徑為9cm的培養皿中鋪2層濾紙,用4mL滅菌去離子水充分浸潤濾紙,挑選完整的甘藍型油菜種子50粒均勻排列在培養皿中(設置3個重復),于23 ℃恒溫箱中培養。分別收集不同吸水時期(0,6,12,24,48,72,96,120h)的種子材料,快速冷凍到液氮中,用于總RNA的提取。qRT-PCR分析方法參見1.3.2。

1.3.4逆境脅迫下TIP4;1基因的qRT-PCR分析為了研究種子萌發過程中非生物脅迫對TIP基因表達的影響,設置了干旱、低溫和鹽脅迫3種處理。在PEG干旱脅迫處理中,使種子在20%PEG6000溶液中萌發。分別于PEG處理后的6,12,24,48,72h收集整個種子材料,快速冷凍于液氮中用于總RNA提取。在低溫脅迫處理中,將種子置于12 ℃的低溫下萌發。低溫脅迫取材時間與PEG脅迫處理時間相同,之后將材料快速冷凍于液氮中,用于總RNA的提取。在鹽脅迫處理中,將種子置于150mmol/LNaCl溶液中萌發。分別于NaCl脅迫處理后的6,12,24,48h收集整個種子并冷藏于液氮中,用于總RNA的提取。將種子置于純水中萌發相應的時間(6,12,24,48,72h)作為對照。對于每種處理,均分3次收集材料作為生物學重復。qRT-PCR分析方法參見1.3.2。

2結果與分析

2.1總RNA質量檢測

將甘藍型油菜種子的總RNA樣品進行瓊脂糖凝膠電泳分析(圖1),結果顯示28S、18S和5S條帶整齊清晰,且28S基本為18S亮度的2倍,表明所提總RNA完整性較好,沒有降解。紫外分光光度檢測OD260/280為1.8～2.0。檢測結果表明,總RNA的純度、完整性都比較高,適用于下一步的RT-PCR分析。

2.2甘藍型油菜TIP4;1基因片段的PCR擴增

以反轉錄的第一鏈cDAN為模板,經PCR擴增得到了600bp左右片段(圖2)。該片段與預期目的片段的大小相一致。對此擴增產物進行瓊脂糖凝膠回收,將回收的產物連接到pMD18-T,并轉化大腸桿菌DH5α細胞中進行菌落培養,挑取白斑進行菌落PCR擴增。得到的片段與上述以cDAN為模板得到的擴增產物長度相同,證明PCR擴增的片段已克隆到pMD18-T載體上。

圖1　總RNA的提取

M.DNA分子量(DL2000);1.TIP4;1基因;2.陰性對照。

2.3甘藍型油菜TIP4;1基因的測序及分析

測序結果表明,所獲得基因長度為599bp(圖3),編碼91個氨基酸殘基。Blast比較結果顯示:該片段的核苷酸序列與其他植物TIP4;1基因的核苷酸序列的同源性均為74%～99%,其中同源性最高的是甘藍型油菜,為99%(XM_013837778),與擬南芥的同源性為89%(NM_128141),所以將其命名為TIP4;1。為了獲得更準確的信息,用BlastX繼續同源搜索,因為該程序將核酸序列翻譯成蛋白進行搜庫,所以獲得的信息更準確。BlastX同源搜索結果表明,所克隆的基因具有AQPs超基因家族特有的保守結構域(圖4),因此,推測其為AQPs超基因家族的TIPs亞家族成員。

圖3　甘藍型油菜TIP4;1基因序列

圖4　甘藍型油菜TIP4;1蛋白保守結構域

2.4甘藍型油菜TIP4;1基因表達的qRT-PCR分析

2.4.1甘藍型油菜TIP4;1基因在植株不同器官中的表達為了研究TIP4;1基因的表達模式,采用qRT-PCR方法分析了該基因在甘藍型油菜生殖生長期植株不同器官的表達情況(圖5)。分別以根、莖、葉和花器官的cDNA第一鏈為模板進行qRT-PCR擴增。結果表明,TIP4;1基因在根、莖、葉和花器官都有表達,且在花器官中的表達量最高。

栽種于大田間7月齡植株的上述器官用于總RNA的提取。甘藍型油菜β-actin作為內參基因。相對表達量采用TIP4;1的表達量與β-actin的表達量之比(AQP/ACTIN)來表示?？v軸表示基因的相對表達量“平均值±標準差”。每個試驗進行3次生物學重復。圖6同。

TotalRNAwasextractedfromvarioustissuesof7-monthold

plantsgrowninfield.B.napus β-actinwasusedasaninternalcontrol.

ThetranscriptlevelsofTIP4;1genecomparedtoACTIN(AQP/ACTIN)

wereplottedastherelativeexpressionlevel.Theverticalcolumnindicates

therelativetranscriptlevel.Thevaluesaremeans±SDofthree

biologicalreplicates.ThesameasFig.6.

圖5TIP4;1基因在根、莖、葉、

花和受精21d的種子中的相對表達

Fig.5TherelativeexpressionlevelsofTIP4;1inroots,

stems,leaves,flowersand21DPAseedsbyqRT-PCR

2.4.2甘藍型油菜TIP4;1基因在種子萌發過程中的表達為了進一步研究TIP4;1基因的表達模式,采用qRT-PCR分析其在甘藍型油菜種子萌發過程及幼苗階段的表達(圖6)。分別以吸水0,6,12,24,48,72,96,120h的種子為材料提取總RNA,之后以反轉錄的cDNA第一鏈為模板進行qRT-PCR分析。通過種子萌發試驗,發現干種子吸水12h,萌發率達到56%;吸水24h,所有的種子已經完成了萌發。定量分析結果表明,TIP4;1基因在干種子中不表達,但吸水6h后檢測到該基因的表達,且在吸水后12h達到最大水平,之后在幼苗階段(24～120h)維持相對高的轉錄本水平。

圖6　TIP4;1基因在種子萌發過程與幼苗階段的表達情況

2.4.3干旱、低溫和鹽脅迫對TIP4;1基因表達的影響為了進一步研究逆境脅迫對TIP4;1基因表達的影響,分別用20%PEG6000和12 ℃低溫處理種子6,12,24,48,72h;用150mmol/LNaCl處理種子6,12,24,48h,之后按上述各處理時間分別提取總RNA。種子在正常情況下(21 ℃)萌發作為脅迫處理的對照。

結果顯示(表1),TIP4;1基因的轉錄水平在PEG處理12h之內快速下降到對照的十分之一。在PEG處理24h后,TIP4;1基因的轉錄水平出現明顯上調,是對照的2倍,但之后快速下降到對照的二分之一。低溫脅迫處理后,TIP4;1基因的表達出現上調趨勢,表達量最高可達對照的1.6倍。在150mmol/LNaCl的脅迫處理下,TIP4;1基因的表達快速上調,可達對照的1.4倍。脅迫處理24h后,TIP4;1基因的表達再次上調,是對照的3倍。

3結論與討論

植物AQPs主要位于質膜和液泡膜上,分別稱之為質膜內在蛋白PIPs和液泡膜內在蛋白TIPs。根據C端和N端的特征,將分布于液泡膜上的TIPs分為TIP1～TIP5 5個亞類。植物中第一個水孔蛋白γ-TIP是由Maurel等[20]從擬南芥中分離出來,該基因在爪蟾卵母細胞中的異源表達證明它具有水分運輸特征,屬于植物水孔蛋白中的TIPs。如今,許多模式植物整套水孔蛋白基因已經被成功克隆和鑒定,而對于最重要的油料作物之一甘藍型油菜來說,由于缺乏詳細的基因組數據信息,其大部分水孔蛋白AQPs的序列信息至今仍然未知?；谝陨戏治?從甘藍型油菜種子中克隆1個TIP4;1基因,Blast比較分析表明該基因屬于AQPs基因家族的TIPs亞家族成員。

植物水孔蛋白AQPs有組織或器官表達的特異性[21]。近年來,有研究表明擬南芥AQPs基因主要在根和花中表達,而在葉中無特異性表達[22]。2014年Ge等[23]的研究表明,BnPIP2;5、BnPIP2;7、BnPIP2;2和BnPIP2基因的轉錄本更豐富地在花中積累。本研究中,TIP4;1基因在根、莖、葉和花器官都有表達,且在花器官中的表達量最高,但其在花器官中的作用有待于進一步研究。

表1　甘藍型油菜TIP4;1基因在干旱、低溫和鹽脅迫處理后的相對表達

注:處理時間如下:20 % PEG 6000處理和12 ℃低溫處理種子時間均是6,12,24,48,72 h;150 mmol/L NaCl處理種子時間是6,12,24,48 h。TIP4;1基因在正常情況下吸水相對應時間的表達量作為對照。相對表達量為TIP4;1基因在脅迫處理下的表達與對照(正常情況)下表達的比值,“平均值±標準差”。每個試驗進行3次生物學重復。

Note:Timegradienttreatments:seedsweredealtwith20%PEGor12 ℃coldfor6,12,24,48,72hrespectively;150mmol/LNaClfor6,12,24,48h.ExpressionlevelsofTIP4;1inseedsgerminatedundernon-stressedconditionatcorrespondingtimepointswereusedasacontrol.Therelativevaluesaretreated/controlratio(fold).Valuesaremeans±SDof3replicates.

種子萌發過程植物組織的含水量發生了極大變化,TIPs在種子萌發過程起著重要作用。擬南芥的TIP蛋白AtTIP1;2和AtTIP2;1在種子萌發階段大量表達,Li等[24]證實了其對液泡滲透調節發揮著重要作用。Maurel[25]發現γ-TIP在種子萌發及幼苗期表達,證實其參與了種子萌發過程細胞的滲透調節和幼苗初期細胞的伸長。本研究發現,在干種子中未檢測到TIP4;1基因的表達,而在種子萌發過程和早期幼苗階段其表達出現上調。尤其在胚根出現的前幾個小時(12h內),TIP4;1基因的表達增強,在吸水12h后達到最大表達量,這與胚根出現的時間恰巧一致。TIP4;1基因在吸水的種子中高表達可能與種子萌發初期階段水分的跨膜轉運及促進水分向不斷膨脹的組織供給有關。此外,種子吸水24h后TIP4;1基因表達上調,這意味著除了參與種子的萌發過程,該基因可能同時也參與了幼苗初期階段的發育過程。TIP4;1基因在不同器官和種子萌發過程中的表達模式說明其表達是受發育調控的。

研究表明,水孔蛋白AQPs在植物的水分平衡中起著重要作用[22,26-27],環境刺激也在不同水平上調控TIPs的表達[28]。植物AQPs基因在擬南芥等植物中對逆境(低溫、干旱、鹽脅迫)表現出上調或者下調[26,29-31]。受到干旱脅迫,擬南芥AQPs基因的表達上調[22],本研究還表明,在干旱脅迫24h后，TIP4;1基因的表達是對照的2倍。植物在干旱脅迫下需要保持細胞內一定的水分來維持正常的生理功能,這就需要在一些細胞和組織中提高水孔蛋白AQPs的表達[32]。水孔蛋白的上調表達使細胞膜對水分子的通透性加強,可以增加細胞對水分的獲取。在低溫脅迫下,擬南芥的水孔蛋白AQPs的表達也受到一定的影響[21]。Ge等[23]發現,冷脅迫處理6h后甘藍型油菜的BnTIP2基因表達量迅速增加到對照的46倍,本研究結果也得到類似結論。TIP4;1基因在冷脅迫下的表達持續上調,在處理72h后表達量達到對照的1.6倍。研究表明,植物對鹽脅迫最敏感的響應是根的導水性受到抑制[33]。10mmol/LNaCl處理下,野生型擬南芥根的導水性快速下降;而水孔蛋白PIP2;5基因過量表達的擬南芥,其根的導水性不受影響[34]。Sutka等[33]認為,細胞導水性的抑制作用是通過水孔蛋白的表達和活性來實現的[34]。在轉錄水平上,鹽脅迫也影響大多數AQPs基因的表達。本研究中,鹽脅迫初期(6h內),甘藍型油菜TIP4;1基因的表達上調。隨后經過短暫的表達量下降之后,在吸水24h后該基因的表達再次上調并達到最大(對照的3倍)。綜上所述,在非生物因素逆境脅迫下,TIP4;1基因的這種上調或者下調表達,可能在脅迫處理的初期階段為減少水分的散失起到一定作用,同時加速處理后期的水分吸收過程,以此來保持甘藍型油菜在逆境條件下的水分平衡[26]。

參考文獻：

[1]MuellerND,GerberJS,JohnstonM,etal.Closingyieldgapsthroughnutrientandwatermanagement[J].Nature,2012,490(7419):254-257.

[2]Mori I C,Rhee J,Shibasaka M,et al.CO2transport by PIP2 aquaporins of barley[J].Plant & Cell Physiology,2014,55(2):251-257.

[3] Bienert G P,Chaumont F.Plant aquaporins:roles in water homeostasis,nutrition,and signaling processes [J].Signaling & Communication in Plants,2011,7:3-36.

[4]Chaumont F,Barrieu F,Jung R,et al.Plasma membrane intrinsic proteins from maize cluster in two sequence subgroups with differential aquaporin activity[J].Plant Physiology,2000,122(4):1025-1034.

[5]Johanson U,Gustavsson S.A new subfamily of major intrinsic proteins in plants[J].Molecular Biology and Evolution,2002,19(4):456-461.

[6]Chaumont F,Tyerman S D.Aquaporins:highly regulated channels controlling plant water relations[J].Plant Physiology,2014,164(4):1600-1618.

[7]Li G,Santoni V,Maurel C.Plant aquaporins:roles in plant physiology[J].Biochimica et Biophysica acta,2014,1840(5):1574-1582.

[8]Bouton S,Viau L,Lelièvre E,et al.A gene encoding a protein with a proline-rich domain (MtPPRD1),revealed by suppressive subtractive hybridization (SSH),is specifically expressed in theMedicagotruncatulaembryo axis during germination[J].Journal of Experimental Botany,2005,56(413):825-832.

[9]Liu D Q,Tu L L,Li W,et al.Characterization and expression of plasma and tonoplast membrane aquaporins in elongating cotton fibers[J].Plant Cell Reports,2008,27(8):1385-1394.

[10]Alleva K,Marquez M,Villarreal N,et al.Cloning,functional characterization,and co-expression studies of a novel aquaporin (FaPIP2;1) of strawberry fruit[J].Journal of Experimental Botany,2010,61(14):3935-3945.

[11]Katsuhara M,Rhee J Y,Sugimoto G,et al.Early response in water relations influenced by NaCl reflects tolerance or sensitivity of barley plants to salinity stress via aquaporins[J].Soil Science and Plant Nutrition,2011,57(1):50-60.

[12] Kudoyarova G R,Kholodova V P,Veselov D S.Current state of the problem of water relations in plants under water deficit [J].Russ J Plant Physiol,2013,60(2):165-175.

[13] Maurel C,Chrispeels M J.Aquaporins,A molecular entry into plant water relations [J].Plant Physiol,2001,125:135-138.

[14] 于秋菊,吳锜,林忠平.植物水孔蛋白研究進展 [J].北京大學學報:自然科學版,2002,38:855-866.

[15]Hussain S S,Iqbal M T,Arif M A,et al.Beyond osmolytes and transcription factors:drought tolerance in plants via protective proteins and aquaporins[J].Biologia Plantarum,2011,55(3):401-413.

[16]Ben Baaziz K,Lopez D,Bouzid S,et al.Early gene expression in the walnut tree occurring during stimulation of leaf hydraulic conductance by irradiance[J].Biologia Plantarum,2012,56(4):657-666.

[17]Forrest K L,Bhave M.Major intrinsic proteins (MIPs) in plants:a complex gene family with major impacts on plant phenotype[J].Functional & Integrative Genomics,2007,7(4):263-289.

[18]Li G W,Peng Y H,Yu X,et al.Transport functions and expression analysis of vacuolar membrane aquaporins in response to various stresses in rice[J].Journal of Plant Physiology,2008,165(18):1879-1888.

[19]Sade N,Vinocur B J,Diber A,et al.Improving plant stress tolerance and yield production:is the tonoplast aquaporin SlTIP2;2 a key to isohydric to anisohydric conversion? [J].The New Phytologist,2009,181(3):651-661.

[20]Maurel C,Reizer J,Schroeder J I,et al.The vacuolar membrane protein gamma-TIP creates water specific channels inXenopusoocytes[J].The EMBO Journal,1993,12(6):2241-2247.

[21]Takahashi H,Rai M,Kitagawa T,et al.Differential localization of tonoplast intrinsic proteins on the membrane of protein body type II and aleurone grain in rice seeds[J].Bioscience Biotechnology and Biochemistry,2004,68(8):1728-1736.

[22]Alexandersson E,Fraysse L,Sj?vall-Larsen S,et al.Whole gene family expression and drought stress regulation of aquaporins[J].Plant Molecular Biology,2005,59(3):469-484.

[23]Ge F W,Tao P,Zhang Y,et al.Characterization ofAQPgene expressions in Brassica napus during seed germination and in response to abiotic stresses[J].Biologia Plantarum,2014,58(2):274-282.

[24]Li L J,Ren F,Wei P C,et al.Identification of AtSM34,a novel tonoplast intrinsic protein-interacting polypeptide expressed in response to osmotic stress in germinating seedlings[J].Chinese Science Bulletin,2011,56(33):3518-3530.

[25]Maurel C.Aquaporins and water permeability of plant membranes [J].Ann Rev Plant Physiol,1997:399-429.

[26]Jang J Y,Kim D G,Kim Y O,et al.An expression analysis of a gene family encoding plasma membrane aquaporins in response to abiotic stresses inArabidopsisthaliana[J].Plant Molecular Biology,2004,54(5):713-725.

[27]Chevalier A S,Chaumont F.Trafficking of plant plasma membrane aquaporins:multiple regulation levels and complex sorting signals[J].Plant & Cell Physiology,2015,56(5):819-829.

[28]Hachez C,Zelazny E,Chaumont F.Modulating the expression of aquaporin genes in planta:A key to understand their physiological functions?[J].Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes,2006,1758(8):1142-1156.

[29]Li J,Ban L,Wen H,et al.An aquaporin protein is associated with drought stress tolerance[J].Biochemical and Biophysical Research Communications,2015,459(2):208-213.

[30] de Andradead L M,Nobilea P M,Ribeiroe R V,et al.Characterization of PIP2 aquaporins in Saccharum hybrids [J].Plant Gene,2016,5:31-37.

[31] Dinga L,Gaoa C,Lia Y,et al.The enhanced drought tolerance of rice plants under ammonium is related to aquaporin (AQP) [J].Plant Science,2015,234:14-21.

[32]Zhang J,Li D D,Zou D,et al.A cotton gene encoding a plasma membrane aquaporin is involved in seedling development and in response to drought stress[J].Acta Biochimica et Biophysica Sinica,2013,45(2):104-114.

[33]Sutka M,Li G,Boudet J,et al.Natural variation of root hydraulics inArabidopsisgrown in normal and salt-stressed conditions[J].Plant Physiology,2011,155(3):1264-1276.

[34]Lee S H,Zwiazek J J.Regulation of aquaporin-mediated water transport inArabidopsisroots exposed to NaCl[J].Plant & Cell Physiology,2015,56(4):750-758.

CloningandExpressionAnalysisofTIP4;1GenefromBrassica napus

GE Fengwei,JIANG Yi,ZHAO Huixin

(Xinjiang Key Laboratory of Special Species Conservation and Regulatory Biology,College of Life Science,Xinjiang Normal University,Urumqi830054,China)

Abstract：Aquaporins are channel proteins,which located in biological membranes including plasma membrane and tonoplast.It can highly facilitate water transportation across biological membranes.To investigate molecular mechanism of water regulation during seed germination,a tonoplast intrinsic proteins(TIPs)gene fragment TIP4;1 was isolated from Brassica napus seed by RT-PCR.The expression of TIP4;1 gene during seed germination and stresses treatment was analyzed by quantitative Real-time PCR(qRT-PCR).The transcription levels of TIP4;1 was analyzed during germination,and these results showed TIP4;1 expression levels was scarcely detected in dry seed,but was up-regulated during germination as well as early young seedlings.In addition,expression of TIP4;1 in response to abiotic stress was investigated,and results showed that TIP4;1 gene expression was upregulated under drought,cold and salt stress,suggesting that TIP4;1 may be involved in Brassica napus seed germination and stress response process.Aquaporin regulation mechanism would be further revealed in future,which had realistic significance for solving drought and salt stress problems.

Key words:Brassica napus;AQPs;TIPs;Seed germination;qRT-PCR

doi:10.7668/hbnxb.2016.02.007

中圖分類號：Q78

文獻標識碼：A

文章編號：1000-7091(2016)02-0032-06

作者簡介：葛風偉(1976-),女,江蘇新沂人,講師,博士,主要從事植物逆境分子生物學研究。通訊作者：趙惠新(1975-),女,新疆奇臺人,副教授,博士,碩士生導師,主要從事植物逆境分子生物學研究。

基金項目：新疆維吾爾自治區重點實驗室“新疆特殊環境物種保護與調控生物學實驗室”項目(XJDX1414-2015-07);新疆師范大學博士科研啟動基金項目(XJNUBS1541)；新疆維吾爾自治區自然科學基金項目(2013211A024)

收稿日期：2016-02-10