沙拉沙星單克隆抗體制備及鑒定

劉儒彪,胡驍飛,張改平,3,王　慧,王方雨,劉　璐,劉　璽,鄧瑞廣,宋照軍

(1.河南科技學院 食品學院，河南 新鄉　453003;2.河南省農業科學院 動物免疫學重點實驗室,河南 鄭州　450002;3.河南農業大學 牧醫工程學院,河南 鄭州　450002)

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沙拉沙星單克隆抗體制備及鑒定

劉儒彪1,胡驍飛2,張改平2,3,王慧1,王方雨2,劉璐1,劉璽1,鄧瑞廣2,宋照軍1

(1.河南科技學院 食品學院，河南 新鄉453003;2.河南省農業科學院 動物免疫學重點實驗室,河南 鄭州450002;3.河南農業大學 牧醫工程學院,河南 鄭州450002)

摘要：為制備敏感性好、親和力高、特異性強的抗沙拉沙星(Sarafloxacin,SARA)單克隆抗體,采用碳二亞胺法合成SARA人工抗原,通過免疫BALB/c小鼠,選擇血清效價高且敏感性好的小鼠,采用雜交瘤細胞技術進行細胞融合,篩選分泌抗SARA單克隆抗體(Monoclonal antibody,mAb)的雜交瘤細胞株;采用體內誘生腹水法制備SARA mAb,通過間接ELISA和間接競爭ELISA對SARA mAb的免疫學特性進行鑒定。結果表明:小鼠經免疫原免疫后,小鼠多抗血清效價均達到1∶128 000。選擇敏感性較好的2號小鼠進行細胞融合,經多次亞克隆后,篩選出1G3、3H3兩株雜交瘤細胞株,其中1G3所產SARA mAb效價較高,為1∶512 000,IC50為6.34 ng/mL,親和常數為8.55×108 L/mol,與諾氟沙星的交叉反應率為1.06%,與其他藥物交叉反應率均低于0.50%。

關鍵詞：沙拉沙星;單克隆抗體;雜交瘤細胞;免疫學特性

沙拉沙星(Sarafloxacin,SARA)又稱6-氟-1-(4-氟苯基)-1,4-二氫-4-氧代-7-(1-哌嗪基)-3-喹啉羧酸,是氟喹諾酮類藥物的一種,屬于第3代喹諾酮類藥物,于1995年上市并得到應用,同時也是美國食品藥品監督管理局(Food and drug administration,FDA)批準用于食用動物的第一個氟喹諾酮類藥物[1-2]。由于其具有良好的殺菌效果,且價格低廉而被廣泛應用，主要用于治療家禽、水產、畜牧等養殖業中，由敏感細菌引起的泌尿系統、呼吸系統、消化系統等感染疾病以及霉形體病[3-5]。

雖然SARA被廣泛用于動物疾病的治療,但其在食品動物中的殘留,會經過人食用動物組織后轉移到人體內并在人體內蓄積,從而增加人體內的病原體對氟喹諾酮類藥物的耐藥性,以致人在生病時服用氟喹諾酮類藥物會降低其藥性,從而影響該類藥物的臨床療效[6-7]。2002年,我國農業部第235號公告《動物性食品中獸藥最高殘留限量》中對SARA在動物性食品中的殘留作了明確限量要求,規定其在雞肌肉、脂肪、肝、腎中的最高殘留限量分別為10，20，80，80 μg/kg,在魚肌肉和皮中的最高殘留限量均為30 μg/kg。目前,對于SARA的殘留檢測方法,主要為高效液相色譜法以及液相色譜與質譜串聯的檢測方法[8-11]。盡管這些檢測方法的精確度和靈敏度都很高,但是由于其設備昂貴且體積大,樣品處理繁瑣費時、成本高且技術復雜,只能限于實驗室內檢測,無法滿足現場大批量快速檢測需求。免疫學檢測方法具有檢測速度快、敏感且一次能檢測大量樣品的特點,能實現現場快速檢測,且成本較低,能夠彌補儀器檢測的不足并已廣泛應用于食品中抗生素殘留的檢測[12-15]。本研究通過雜交瘤細胞技術制備親和力高、強特異、強抗SARA的單克隆抗體,建立SARA免疫學快速檢測方法。

1材料和方法

1.1試劑與溶液

SARA、諾氟沙星(Norfloxacin)、環丙沙星(Ciprofloxacin)、甲硝唑(Metronidazole)、土霉素(Oxytetracycline)、四環素(Tetracycline)、金霉素(Aureomycin)、新霉素(Neomycin)標準品以及3,3′,5,5′-四甲基聯苯胺(TMB)、弗氏完全佐劑(FCA)、弗氏不完全佐劑(FIA)、鼠源單克隆抗體亞型鑒定試劑、牛血清白蛋白(BSA)、雞卵清蛋白(OVA),均購自美國Sigma公司;司帕沙星(Sparfloxacin)標準品,購自中國獸醫藥品監察所;1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS),購自美國Pierce Biotechnology公司;羊抗兔酶標二抗(GaMIgG-HRP),購自美國Abbkine公司;細胞培養基RPMI-1640、HAT、HT和PEG-1500,購自美國Gibco公司;其他試劑均為分析純;試驗用水為超純水;包被液(CBS,0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液)、封閉液(豬血清含量為5%的PBST溶液)、顯色液(TMB磷酸-檸檬酸緩沖液)、終止液(濃度為2 mol/L的H2SO4溶液)、0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS),均為動物免疫學重點實驗室配制。

1.2儀器與設備

恒溫恒濕試驗箱,購自上海一恒科學儀器有限公司;高速冷凍離心機,購自美國Thermo Scientific公司;iMark 450/550酶標儀,購自美國Bio-Rad公司;HI9321 pH計,購自美國Hanna公司;One DropTMOD-1000+分光光度計,購自美國NanoDrop公司;渦旋振蕩器、控溫磁力攪拌器,購自德國IKA公司;AE260電子天平,購自德國Mettler公司;超凈工作臺,購自美國Forma Scientific公司;倒置顯微鏡,購自德國Leica公司;CO2培養箱,購自美國Precision公司。

1.3供試動物與瘤細胞

供試動物為SPF級8周齡雌性BALB/c小鼠,由動物免疫學重點實驗室繁殖飼養。瘤細胞為小鼠骨髓瘤細胞系NS0,由動物免疫學重點實驗室保存。

1.4人工抗原合成及多抗血清鑒定

參照文獻[16-17]報道的方法,采用碳二亞胺(EDC)法制備免疫抗原SARA-BSA和包被抗原SARA-OVA,制備路線見圖1。以20 μg/只的劑量背部皮下多點注射免疫SPF級BALB/c小鼠,免疫4次(每次免疫間隔時間為3周),第4次免疫30 d后對小鼠進行斷尾采血,ELISA測定小鼠多抗血清效價和敏感性,篩選效價高和敏感性好的小鼠進行細胞融合。

圖1　SARA人工抗原制備路線

1.5雜交瘤細胞株的建立

NS0骨髓瘤細胞與BALB/c小鼠脾細胞在PEG1500的作用下融合,將細胞懸液置于37 ℃恒溫培養箱中進行培養,7 d后用HT培養基置換半量細胞液,12～14 d后觀察細胞生長情況,并抽取細胞上清液,ELISA測定其效價和敏感性,篩選各項指標均較高的細胞進行有限稀釋克隆化(部分凍存備用),直至所有克隆鑒定結果一致。

1.6SARA mAb的大量制備

采用體內誘生腹水法制備SARA mAb,取3只8周齡BALB/c小鼠,腹腔注射液體石蠟0.5 mL/只,10 d后將亞克隆后擴大培養的細胞以2×106～5×106個/只注入小鼠腹腔。待小鼠腹部腫瘤明顯腫大時即可采集腹水,3 000 r/min離心15 min,除去細胞及雜質沉淀,上清用飽和硫酸銨鹽析法純化得到SARA mAb。

1.7SARA mAb的免疫學特性鑒定

用間接ELISA測定SARA mAb效價,用間接競爭ELISA測定SARA mAb對SARA的抑制率,橫坐標為SARA標準液各質量濃度的對數值,縱坐標為抑制率(B/B0)(B為SARA標準液各質量濃度的OD450值,B0是SARA標準液質量濃度為0時的OD450值),繪制標準抑制曲線,進行回歸分析,計算SARA mAb對SARA的半數抑制濃度(IC50),并以此來衡量SARA mAb的敏感性[18-21],IC50越小,說明其敏感性越強。

采用間接ELISA對SARA mAb的亞型進行鑒定。具體步驟按照鼠源單克隆抗體亞型鑒定試劑的說明書進行操作。參照Beatty等[22]所述的方法測定SARA mAb的親和常數Ka。親和常數計算公式Ka=(n-1)/2(n[Ab′]t-[Ab]t)(其中n=[Ag]t/[Ag′]t,[Ag]t、[Ag′]t分別為2個不同的包被原濃度,[Ab]t、[Ab′]t分別為各包被原濃度下50%OD值時所對應的SARA mAb濃度)。

以SARA的同類藥物諾氟沙星、環丙沙星、司帕沙星,以及新霉素、四環素、金霉素、土霉素、甲硝唑等其他藥物作為競爭物,測定SARA mAb對其競爭物的IC50,計算其交叉反應率(Cross reactivity,CR),并以交叉反應率的大小來判定SARA mAb的特異性,交叉反應率越高,其特異性越低。

2結果與分析

2.1多抗血清效價測定

由ELISA檢測結果可知,被免疫的6只小鼠獲得了較好的免疫效果,小鼠多抗血清效價均在1∶128 000以上(圖2),2號小鼠多抗血清效價最高,達到了1∶25 600。

圖2　小鼠多抗血清效價

2.2抗SARA單克隆抗體(SARA mAb)雜交瘤細胞株的建立

選擇2號小鼠進行融合,通過間接ELISA檢測融合的6塊細胞培養板中有189個陽性孔,陽性率為32.8%。選取其中6孔強陽性進行多次亞克隆,通過間接競爭ELISA測定IC50,最終篩選出2株效價高、敏感性強的雜交瘤細胞,分別命名為1G3和3H3,經過多次凍存與復蘇后,仍能夠穩定分泌抗體。

2.3SARA mAb免疫特性的鑒定

2.3.1效價測定雜交瘤細胞上清和腹水效價測定結果見表1。2株雜交瘤細胞分泌的SARA mAb均具有較高的效價,采用體內誘生腹水法制備SARA mAb,經檢測1G3株效價較高,可以達到1∶512 000。

表1　SARA mAb效價測定

2.3.2敏感性鑒定間接競爭ELISA測定2株細胞產生的SARA mAb抑制效價,其中1G3株產生SARA mAb抑制效果較好,標準曲線如圖3所示,線性回歸方程為y=-0.446 8x+0.858 3,R2=0.991 1,IC50為6.34 ng/mL,表明SARA mAb對SARA具有很強的敏感性。

2.3.3亞型鑒定 通過鼠源單克隆抗體亞型檢測試劑鑒定,2株雜交瘤細胞所產SARA mAb的亞型均為IgG1型。

2.3.4親和常數測定 間接ELISA測定不同包被濃度下SARA mAb的親和常數曲線(圖4),以曲線上部接近水平線段的OD值為100%,計算出50%OD值對應的SARA mAb濃度,經計算,親和常數Ka=8.55×108L/mol。本試驗采用Beatty飽和法測定Ka,該方法簡便易行,不需復雜的技術和設備。根據Goding[23]的結論,高親和力抗體的親和常數通常為107～1012L/mol,所以本試驗制備的SARA mAb親和力較高,適用于免疫學檢測方法的建立。

圖3　SARA mAb間接競爭ELISA抑制曲線

圖4　親和常數測定曲線

2.3.5特異性鑒定間接競爭ELISA對SARA mAb特異性的鑒定結果如表2所示,SARA mAb與諾氟沙星交叉反應率為1.06%,SARA mAb與其他競爭物的IC50均大于1.5×103,交叉反應率均小于0.5%。說明SARA mAb對SARA特異性好,交叉反應率低。

表2　交叉反應率測定

3結論與討論

在細胞融合過程中,融合劑的選擇很重要,正常情況下細胞融合效果與PEG的分子質量及其濃度呈正比,但PEG的分子質量越大、濃度越高,對細胞的毒性越大。另外,PEG的pH值和滴加PEG的速度也會對細胞融合產生影響[24]。本研究采用PEG1500作為融合劑,pH值在8.0～8.2,滴加1 mL PEG,時間為1 min(前15 s加入0.3 mL,30 s加入0.4 mL PEG,后15 s 加入0.3 mL PEG)。反應1.5 min后向離心瓶加入15 mL預熱的GNK溶液進行終止反應,(加入時間分別為1 mL/30 s、3 mL/30 s、11 mL/30 s),細胞融合效果最佳。

脾細胞與瘤細胞的融合是一個隨機結合過程,融合后的細胞可能會以多種形態存在,需將非目的融合細胞的細胞除去。HAT選擇性培養基是在基礎培養基上加入氨基蝶呤、次黃嘌呤、胸腺嘧啶核苷等,其中氨基蝶呤能阻止細胞DNA的合成,且瘤細胞本身又不能進行自身繁殖。因此,在HAT選擇性培養基上進行細胞培養時,只有脾細胞與瘤細胞融合后的細胞才能正常存活,即目的融合細胞。采用有限稀釋法對篩選出的目的融合細胞進行亞克隆,間接ELISA和間接競爭ELISA鑒定抗體,多次亞克隆至篩選出能穩定分泌效價高、特異性好的抗體的雜交瘤細胞株[25]。

本研究利用已獲得免疫反應的小鼠,通過雜交瘤細胞融合技術篩選出了2株敏感性高、特異性強的雜交瘤細胞株,采用體內誘生法制備腹水,經純化、鑒定后,獲得了效價高、敏感性好、親和力高、特異性好的SARA mAb,可用于SARA殘留免疫分析方法的建立和SARA殘留檢測產品的開發。

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Preparation and Identification of Monoclonal Antibody for Sarafloxacin

LIU Rubiao1,HU Xiaofei2,ZHANG Gaiping2,3,WANG Hui1,WANG Fangyu2,LIU Lu1,LIU Xi1,DENG Ruiguang2,SONG Zhaojun1

(1.College of Food Science and Technology,Henan Institute of Science and Technology,Xinxiang453003,China;2.Henan Key Laboratory of Animal Immunology,Henan Academy of Agricultural Sciences,Zhengzhou450002,China;3.College of Animal Science and Veterinary Medicine,Henan Agricultural University,Zhengzhou450002,China)

Abstract：In order to preparation of sarafloxacin(SARA)monoclonal antibody with good sensitivity,high affinity and strong specificity,synthesized SARA artificial antigen by carbodiimide method.It was used to immunize BALB/c mice.The mice which possessed high serum titer and good sensitivity were selected for cell fusing through cell hybridoma technique.Then to filtrate the hybridoma cell strain which secreted SARA monoclonal antibody(mAb).Prepared SARA mAb by inducing ascites in vivo,and identificated the immunity characteristics of SARA mAb via indirect ELISA and indirect competitive ELISA.The result indicated that after mice were immune by immunogen,their serum antibody titer were all up to 1∶128 000.Number 2 mouse with good sensitivity was chosen for cell fusion.After multiple sub cloning,1G3 and 3H3 hybridoma cell strain were filtered.The titer of SARA mAb from 1G3 was 1∶512 000,IC50was 6.34 ng/mL,affinity constant was 8.55×108 L/mol,cross-reactivity with norfloxacin was 1.06%,cross-reactivity with other drugs were below 0.50%,higher than that of 3H3.

Key words:Sarafloxacin;Monoclonal antibody;Hybridoma cell;Immunological characteristics

doi:10.7668/hbnxb.2016.02.015

中圖分類號：S859.84

文獻標識碼：A

文章編號：1000-7091(2016)02-0087-05

作者簡介：劉儒彪(1987-),男,河南商丘人,在讀碩士,主要從事農產品深加工技術研究。通訊作者：宋照軍(1973-),男,河南新鄉人,副教授,主要從事肉品加工與質量安全控制研究。鄧瑞廣(1960-),男,河南平頂山人,研究員,碩士,主要從事動物疫病及食品安全免疫學檢測技術研究。

基金項目：2015年河南省科技攻關項目(152102310094);河南省高?？萍紕撔聢F隊支持計劃項目(13IRTSTHN006)

收稿日期：2016-02-26