基于二次曲線擬合的共焦拉曼光譜探測方法

崔 晗,王 允*,邱麗榮,趙維謙,朱 恪

1. 北京理工大學、精密光電測試儀器及技術北京市重點實驗室、北京 100081 2. 中國科學院物理研究所、北京 100190

基于二次曲線擬合的共焦拉曼光譜探測方法

崔 晗1,王 允1*,邱麗榮1,趙維謙1,朱 恪2

1. 北京理工大學、精密光電測試儀器及技術北京市重點實驗室、北京 100081 2. 中國科學院物理研究所、北京 100190

拉曼光譜技術因其光譜信息豐富、非接觸、無破壞、樣品用量少、高靈敏度等特點、為現代前沿基礎科研領域提供一種有力的分析手段、成為分析科學的研究熱點。激光共焦拉曼技術結合共焦顯微探測和拉曼光譜探測技術、具有空間分辨力高、可層析探測的優勢、在物理化學、材料科學、生物醫學、考古及文物鑒定、刑偵科學等眾多領域應用廣泛?，F有共焦拉曼系統由于在掃描過程中無法對探測點進行定焦、因而在長時間的探測過程中會因環境變化、系統漂移等問題導致系統離焦、從而造成測量結果存在誤差甚至錯誤的問題。本文針對這一問題、在現有共焦拉曼系統的基礎上、提出一種基于二次曲線擬合的共焦拉曼光譜探測方法。該方法利用二次曲線對光譜共焦曲線進行擬合、通過尋找曲線最大值、得到系統焦點、進而在掃描過程中對每個探測點進行焦點定位后、采集該點光譜信息、從而保證掃描過程中系統始終位于焦點位置、消除系統離焦對實驗結果的影響、實現共焦拉曼光譜系統的精確測量。通過仿真分析和實驗結果表明：本文提出的基于二次曲線擬合的共焦拉曼光譜探測方法可以有效消除系統離焦對實驗結果造成的影響、提高系統軸向定焦的準確度、為共焦拉曼光譜技術的進一步應用提供了保證、是一種行之有效的定焦準確、抗漂移強的拉曼光譜測量方法。

共焦拉曼； 二次曲線擬合； 高準確度； 抗漂移

引 言

自1990年Puppels等將共焦顯微技術與拉曼光譜探測技術相結合發明共焦拉曼光譜技術、并成功用于探測單細胞和染色體的形態與組成起[1]、激光共焦拉曼技術因繼承了拉曼光譜技術獨特的“分子指紋”特性和共焦技術的高分辨層析成像特性、而被作為極其重要的光譜探測手段廣泛應用于物理學[2-3]、材料科學[4-5]、醫學[6-7]、生物學[8]、地質學[9-10]、考古及文物鑒定[11]、刑偵科學[12]等領域。

在物理化學、生物醫學等研究領域、分析樣品的化學成分、空間分布、表面物理化學性質時、常以圖像的形式來獲取樣品更多的信息、因此需要將拉曼光譜探測由單點分析的方式拓展到對一定區域范圍內樣品的探測分析、即拉曼光譜成像。然而、在拉曼光譜成像時需要較長的探測時間、常達幾個小時、甚至是幾十小時[8]、才能完成。而在長時間的實驗過程中、例如活體探測、由于生物的運動、致使系統離焦[13]、導致得出錯誤的結果； 另外、儀器在長時間成像過程中受環境溫度、振動、空氣抖動等影響較大、同樣易使系統產生漂移、從而導致樣品被探測位置產生離焦?？梢?、在采集光譜信息的過程中、對系統進行實時定焦是非常必要的。由于現有共焦拉曼光譜探測技術不具備實時焦點跟蹤能力、因而在整個成像過程中、無法補償因樣品探測位置偏移引入的離焦誤差、制約了共焦拉曼光譜成像技術的應用。為此、本文基于二次曲線對光譜共焦曲線進行擬合、尋找曲線極值點、對系統進行精確定焦、改善系統定焦準確性、消除系統離焦對實驗結果的影響。

1 共焦拉曼光譜技術基本原理

共焦成像原理是一種點對點的成像技術、其將點光源、樣品被測點和共焦針孔置于彼此對應的共軛位置上、利用逐點照明和空間針孔調制來去除樣品非焦點平面散射光、與傳統成像方法相比可以提高光學分辨力。

共焦拉曼系統原理如圖1所示、激光經準直擴束并被Notch Filter反射后、經物鏡在物體表面聚焦成光斑、激發出載有樣品信息的拉曼散射光、拉曼散射光沿原光路返回、再透射過Notch Filter將拉曼散射光導入放置于單色儀前面的共焦針孔內、形成點檢測、單色儀只接收來自物鏡焦點處的拉曼散射光、焦點以外的光全被針孔屏蔽。當物體恰好位于焦平面時、單色儀接收到的拉曼散射光能量最大； 當物體偏離焦平面時、拉曼散射光被聚焦于像焦平面前或后的某個位置上、此時單色儀僅接收到部分光譜能量、因此、樣品離焦時容易造成探測信號降低、進而造成掃描成像結果錯誤。

圖1 共焦拉曼原理圖

因此、根據共焦拉曼成像原理、為獲得足夠強度的拉曼光譜信號、測量時需要對樣品進行準確定焦、而現有共焦拉曼光譜系統依靠圖像清晰度進行定焦、同時無法進行焦點跟蹤、不能補償實際測量中因樣品離焦而造成的影響。

從圖1中可以看出、共焦拉曼光譜軸向曲線呈鐘形分布、峰值點準確對應物鏡焦點、但是實際測量中、受采樣間隔限制、測量數據呈離散化分布、難以精度捕獲峰值點、并且受系統噪聲影響、峰值點附近數據可能發生無規律跳躍、如圖2所示、導致峰值點位置由點H偏移到點M、造成焦點定位錯誤、進而影響共焦拉曼系統的成像質量、因此、針對該問題本文提出基于二次曲線擬合的共焦拉曼光譜探測方法。

圖2 共焦拉曼曲線最大值對比圖

2 算法原理

2.1 基于二次曲線擬合的共焦拉曼光譜探測原理

為解決系統離焦及定焦不準確對測量結果造成的影響、我們擬利用基于曲線擬合的共焦拉曼光譜測量方法進行改善。本文利用現有共焦拉曼技術中的光譜軸向響應曲線、采用對每個探測點進行定焦的方法消除共焦拉曼光譜系統因離焦對結果造成的影響、采用曲線擬合尋找共焦曲線峰值點的方法確定共焦拉曼系統焦點、消除共焦拉曼系統因隨機誤差對測量結果準確性的影響。

圖3 共焦擬合算法原理

共焦擬合算法基于二次曲線擬合、利用共焦曲線最大值兩側邊附近區間內的數據、擬合二次曲線方程、通過尋找二次曲線方程的峰值點確定共焦曲線極值點位置、進而確定系統焦點位置。從共焦系統的軸向響應特性曲線可以看出、其理論特性曲線關于極值點位置左右對稱、并且在極值附近的數據具有二次曲線特性。因而、如圖3共焦擬合算法原理所示、該方法利用共焦曲線靠近極值點附近的數據來進行擬合、而由該數據段擬合得出的共焦特性曲線極值點位置的準確度也得到大幅提高。

本文利用二次曲線對光譜共焦曲線進行擬合、并采用最小二乘法進行回歸方程求解、最小二乘法具有擬合數據與真實數據之間殘差和最小的特點、使得擬合方程更能準確的反應真實數據的分布。

基于二次曲線擬合的拉曼光譜探測方法需要在顯微物鏡上安裝物鏡驅動器(piezoelectric ceramic acutator,PZT)以帶動物鏡進行軸向掃描、利用該方法進行拉曼光譜測量、具體可分為以下五步：

Step1：通過計算機軟件設置掃描層數N、通過確定掃描上下限、及掃描層間隔、得到相應的掃描層數N；

Step2：通過PZT控制物鏡移動、快速探測每層位置的拉曼光譜；

Step3：提取每層光譜光強最大值Imi、獲得光譜共焦曲線I；

Step4：基于二次曲線、對光譜共焦曲線I進行擬合、并獲得系統焦點位置；

Step5：利用PZT驅動物鏡移動到Step4中獲得的焦點位置、并探測焦點位置拉曼光譜。

圖4為基于二次曲線擬合的拉曼光譜探測方法的焦點定位流程圖。

圖4 焦點定位流程圖

2.2 仿真分析

如圖3共焦曲線擬合原理所示、對共焦曲線進行二次曲線擬合時、擬合數據段區間的選取需要兼顧擬合優度、隨著擬合區間的擴大、擬合優度降低、因此、需要根據實際測量曲線和數據量進行優化選擇。本文以共焦拉曼理論軸向響應曲線為對象、采用連續曲線離散化數據作為擬合輸入數組、根據最小二乘擬合算法、以殘差為依據對共焦拉曼系統軸向定焦響應曲線的擬合區間進行仿真分析與優化選取。

本文以共焦曲線最大值附近、以附加1%高斯噪聲的曲線的最大值60%～95%范圍為備選區間、針對于不同的區間、對其進行仿真分析、根據菲涅爾衍射理論、構建共焦拉曼探測系統的標量理論模型、對系統的軸向定焦響應進行仿真計算、得到共焦拉曼探測系統的理論軸向響應函數、并通過光學反向歸一化公式獲得系統擬合的目標函數、以最小二乘法建立遞歸方程判別殘差梯度方向、迭代計算得到最佳擬合曲線、并進行峰值點遍歷定位。

為獲得最優化的擬合結果、本文針對數據擬合曲線的選取進行仿真分析、對擬合優度和擬合區間進行了優化選擇。從表1中可以看出、擬合區間越接近極值附近、其殘差越小、二次曲線特性越好。在所給范圍內、擬合區間為最大值95%時、該段數據的殘差最小、二次曲線特性最好、但是該區間范圍較小、擬合數據過少、因此、為兼顧擬合區間與擬合優度、選取區間82.5%為擬合區間。為使擬合數據充足、在82.5%區間附近2.5%范圍內進行擴大選取、發現該數據段內、保證殘差不變時的最大擬合區間為最大值的81.5%處。因而、本文在均衡殘差與擬合區間范圍后、選取最大值81.5%以上的數據為曲線擬合時的擬合數據。

表1 擬合區間與殘差值

基于以上仿真分析、對光譜強度共焦曲線進行二次曲線擬合求解系統焦點位置的具體步驟如下。

Step1: 選取光譜強度共焦曲線強度最大值81.5%以上的數據點為二次曲線擬合區間；

Step2: 對選取的數據段利用二次曲線方程進行擬合、得到二次曲線擬合方程IQ(z)；

Step4: 被測點的焦點O位置即為z=z0處。

3 結果與討論

采用單晶硅為實驗樣品、進行以下幾組實驗測試?，F有共焦拉曼光譜技術與基于二次曲線擬合的共焦拉曼光譜技術受系統離焦影響的大?。簩悠贩謩e置于物鏡焦點位置、離焦0.1～5 μm 范圍內(其中、0.1～1 μm離焦范圍內離焦采集間隔為0.1、2～5 μm離焦范圍內離焦采集間隔1 μm)、并分別采用現有共焦拉曼光譜技術和基于二次曲線擬合的拉曼光譜探測方法進行拉曼光譜探測、觀察光譜信號強度變化。其中、激發光源為532nm、激光器穩定性為±2%(8hrs ±1.5 ℃)、顯微物鏡放大倍率為100倍、數值孔徑為0.9、光譜CCD暗噪聲為0.000 6e-/s/pixel。圖5和圖6所示為兩種方法在拉曼頻移為520.7 cm-1時、光譜強度信號變化。

圖5為采用現有共焦拉曼光譜技術進行光譜強度變化測試的實驗結果、從圖5中可以看出、當系統離焦0～1 μm時、光譜強度由100%減弱到56%； 當系統離焦1～2 μm時、光譜強度衰減到27%、光強衰減速率減??； 當系統離焦3～5 μm時、光譜強度由15%衰減到6%、光譜強度趨于平緩； 在系統離焦5 μm時、光譜強度僅為焦點位置光譜強度的6%、衰減明顯。以上實驗結果表明采用現有共焦拉曼光譜技術進行光譜測量時、受系統離焦影響嚴重、光譜光強衰減較大。

圖5 共焦拉曼光譜技術離焦實驗結果

圖6 基于二次曲線擬合的共焦拉曼光譜技術離焦實驗結果

圖6為采用基于二次曲線擬合的共焦拉曼光譜技術進行光譜強度變化測試的實驗結果、從圖6中可以看出、由于采用二次曲線擬合的方法精確尋找焦點位置、對被測樣品進行實時定焦、保證系統始終位于焦點位置、因而、在實驗中設定的5μm離焦范圍內、光譜強度變化可以忽略、幾乎保持不變。

從圖5所示的結果中可以看出、現有共焦拉曼技術在沒有實時定焦的情況下、隨著系統離焦量的增大、光譜強度衰減逐漸減弱、最終趨于平緩。但是、在實際的實驗測試中、受系統漂移、環境變化等影響、產生1 μm以內的系統離焦非常常見、而從上述實驗結果中可以看出、1 μm離焦量范圍內、光譜光強變化非常劇烈、從而嚴重影響了實際測試結果的準確性。從圖6所示的結果中可以看出、本文提出的基于二次曲線擬合的共焦拉曼光譜探測方法、保證了系統始終位于焦點位置、在5 μm離焦范圍內光譜光強幾乎保持不變、因而、可以有效改善系統離焦對實驗結果的影響、同時利用光譜強度共焦曲線進行二次擬合、提高了焦點定位的準確度。

4 結 論

基于現有共焦拉曼技術、結合實際需求、提出了一種基于二次曲線擬合的共焦拉曼光譜探測方法、該方法對每個探測點進行定焦探測、消除了系統離焦對實驗結果造成的影響、同時、利用二次曲線對光譜共焦曲線進行二次擬合提高了共焦拉曼系統定焦準確度。實驗結果表明該方法具有定焦準確、抗漂移明顯的效果、隨著拉曼光譜應用需求的深入、對系統性能的要求也不斷增加、基于二次曲線擬合的共焦拉曼光譜探測方法將在生物、材料等領域形成廣泛應用。

[1] Puppels G J,De Mul F F M,Otto C,et al. Nature,1990,347(6290): 301.

[2] WU Rong-lin、SHAO Zheng-zheng、CHANG Sheng-li(吳熔琳,邵錚錚,常勝利). Spectroscopy and Spectral Analysis(光譜學與光譜分析),2014,34(4): 982.

[3] Ninet S,Datchi F,Dumas P,et al. Physical Review B,2014,89(17): 174103.

[4] Jonathan J Schaefer,Ma Chaoxiong,Joel M Harris. Analytical Chemistry,2012、3,84(21): 9505.

[5] Mo Ramirez,Wisdom J,Li H,et al. Optics Express,2008,16(9): 5965.

[6] Nabiev I,Chourpa I,Manfait M. Journal of Raman Spectroscopy,1994,25(1): 13.

[7] Day J C,Stone N. Applied Spectroscopy,2013,67(3): 349.

[8] Notburga Gierlinger,Tobias Keplinger,Michael Harrington. Nature Protocols,2012,7(9): 1694.

[9] Sabine Szunerits,Michel Mermoux,Alexandre Crisci,et al. The Journal of Physical Chemistry B,2006,110(47): 23888.

[10] Hope G A,Woods R,Munce C G. Minerals Engineering,2001,14(12): 1565.

[11] Vandenabeele P,Edwards H G,Moens L. Chemical Reviews,2007,107(3): 675.

[12] Stewart S P,Bell S E J,McAuley D,et al. Forensic Science International,2012,216: e5.

[13] Christopher L Arrasmith,Chetan A Patil,David L Dickensheets,et al. A. Proc. of SPIE,2009,7169: 71690N1.

(Received Dec. 4,2015; accepted Apr. 22,2016)

*Corresponding author

Aug. 27,2015; accepted Dec. 11,2015)

Confocal Raman Spectroscopy Method Based on Quadratic Curve Fitting

CUI Han1,WANG Yun1*,QIU Li-rong1,ZHAO Wei-qian1,ZHU Ke2

1. Beijing Key Lab for Precision Optoelectronic Measurement Instrument and Technology,School of Optoelectronics,Beijing Institute of Technology,Beijing 100081,China 2. Institute of Physics,Chinese Academy of Sciences,Beijing 100190,China

Raman spectroscopy plays an improtant role in analytical science because of its unique characteristics,such as non-contact and non-destructive detecting,fewer sample consumption,high sensitivity and other characteristics,and it provides a powerful analytical tool for the modern basic research fields. Because of the combination of confocal microscopy technology and Raman spectroscopy technology,confocal Raman microscopy has the advantage of both high resolution spectroscopy and chromatography detection,which inherits from confocal microscopy and raman spectroscopy. As a result,it is widely used in many fields,such as physical chemistry,materials science,biomedical,archaeological,cultural identification,and forensic science. But with the environmental changing,the system drifting or other issues,during the long detection process,the system turns to defocusing. As a result,during the hole scanning process,the system can not be focused on every detection point,and then it would lead to a mistake. Eventurally,conventional confocal Raman system could obtain the presence of measurement error even erroneous results in the long process. In this paper,on the basis of conventional confocal Raman system,a confocal Raman spectroscopy method based on quadratic curve fitting is proposed to solve this problem. Based on the principle that the maxium of the concal curve corresponding the system foucs,the steps to find system foucus as follows: fist,usesing quadratic curve to fit confocal curve; second,finding the maxium of the confocal curve; and last obtaining the system foucs. With this method,during the scanning process,every point should be focused,therefore,the effect of defocusing is eliminated efficiently,and accurate measurements of confocal Raman spectroscopy system is achieved.Through simulation and experimental results show that: the proposed method that confocal Raman spectroscopy method based on quadratic curve fitting can effectively eliminate the influence of system defocus on experimental result,and effectively improve the axial system of fixed focus accuracy,which could provide a guarantee for further application of confocal Raman spectroscopy. This anti-drift method is effective and accurate in focusing with great potential to be applied in broader areas.

Confocal Raman; Quadratic curve fit; High accuracy; Anti-drift

2015-12-04、

2016-04-22

國家自然科學基金項目(61475020),國家自然科學基金重點基金項目(51535002)和國家重大科學儀器設備開發專項(NIP)課題項目(2011YQ04013601,2011YQ04013607)資助

崔 晗、1990年生、北京理工大學光電學院博士研究生 e-mail: cuih1990@gmail.com *通訊聯系人 e-mail: alotrabbits@163.com

O433.1

A

10.3964/j.issn.1000-0593(2016)12-3958-05