食品中單增李斯特菌的血清分型及脈沖場凝膠電泳分型

張亞紅，王娉，王瑋，陳穎*

1(南京農業大學 食品科技學院，江蘇 南京，210095) 2(中國檢驗檢疫科學研究院 農產品安全研究中心，北京，100176)

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食品中單增李斯特菌的血清分型及脈沖場凝膠電泳分型

張亞紅1,2，王娉2，王瑋1，陳穎1,2*

1(南京農業大學 食品科技學院，江蘇 南京，210095) 2(中國檢驗檢疫科學研究院 農產品安全研究中心，北京，100176)

摘要對進口食品和國內食品中的單增李斯特菌進行血清學分型和分子分型研究，探討不同來源菌株之間的遺傳相關性及不同分型方法之間的聯系。 對分離的單增李斯特菌進行血清學分型和脈沖場凝膠電泳分型。69株單增李斯特菌分為4種血清型，主要血清型為1/2a(3a)型，脈沖場凝膠電泳(pulsed-field gel electrophoresis,PFGE)分型分為55種帶型，主要型別為GX6A12.CN0018。食品中的單增李斯特菌分子型別呈現多態性，進口食品分離株和國內食品分離株之間無相關性。

關鍵詞單增李斯特菌；血清分型；脈沖場凝膠電泳(PFGE)；分子分型

單增李斯特菌(Listeriamonocytogenes)是一種典型的兼性胞內寄生菌[1]，能耐受極端的溫度、pH和鹽濃度[2-3]，是李斯特氏菌屬8個種中唯一對人有致病性的種，孕婦、新生兒、老人及免疫力低下的人為易感人群，并且患者死亡率高(20%～30%)[4]。此外，單增李斯特菌易在加工材料表面粘附并形成生物膜，成熟的生物膜更是對理化因子、殺菌劑、抗生素等具有較強抵抗力[5]。這些生物學特性使單增李斯特菌能夠在自然環境中廣泛存在，并且在食品加工的多個環節均能存活，極易導致食品污染和食物中毒事件的發生。

在全球化時代，隨著現代商業及運輸業的發展，食品及其生產原料實現了跨地域，甚至跨國別的銷售，這也使食品中單增李斯特菌的傳播不再局限于某一個地區、一段相對集中的時間里或同一個污染源引起。因此，建立食品中單增李斯特菌的分型研究可以協助生產者追溯、確定食品中該菌的污染來源，并及時切斷污染源以減少損失，同時，也對進行單增李斯特菌的流行病學研究和單增李斯特菌引起的食源性疾病的溯源和控制有重要意義。

目前，用于單增李斯特菌的分型方法主要有：傳統表型法和分子分型法[6]。血清分型是最常用的表型分析技術，該法簡便易操作，且不同血清型的單增李斯特菌分離株呈現不同的環境適應性和致病力，所以血清分型常用作單增李斯特菌流行病學調查的初級方法，用以輔助說明其他分型結果。脈沖場凝膠電泳(pulsed-field gel electrophoresis，PFGE)分子分型方法是目前國際上較認可的流行病學研究方法之一，已被廣泛應用于多種食源性致病菌的溯源調查和臨床醫學研究，該方法分辨率高，重復性好，結果穩定，易于標準化，被譽為細菌分子分型的“金標準”。

本研究應用血清分型和脈沖場凝膠電泳分型技術對69株進口食品及國內食品中分離的單增李斯特菌進行相關性分析，為進行單增李斯特菌的流行病學研究及單增李斯特菌引起的食源性疾病溯源提供基礎數據。

1材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1菌株

實驗菌株為中國檢驗檢疫科學研究院菌種保藏管理中心保存的69株單增李斯特菌，其中， 6株為單增李斯特菌標準菌株，41株分離自國內食品，20株分離自國外進口食品，還有2株分離地點不詳。菌株信息詳見圖3。英諾克李斯特氏菌(ATCC 33090)作為RT-PCR鑒定陰性對照，沙門氏菌全球參考菌株Braenderup血清型菌株H9812(ATCC BAA-664)作為PFGE參考菌株。

1.1.2主要試劑和溶液

腦心浸液肉湯培養基，北京陸橋技術股份有限公司；DNA提取試劑盒，美國Promega公司；蛋白酶K，美國Calbiochem公司；Tris-HCl，Biosharp公司；EDTA，美國Amresco公司；SeaKem Gold 瓊脂糖，瑞士Lonza公司；XbaⅠ、ApaⅠ限制性內切酶(15 U/mL)，大連寶生物工程有限公司)；5×TBE(上海生工生物工程股份有限公司；SDS，美國Amresco公司；十二烷基肌氨酸鈉，德國Sigma公司；TYPE ONE WATER、瓊脂糖，美國Invitrogen公司；MasterMix，美國AB公司；dNTPs(2.5 mmol/L)、ExTaq酶(5 U/μL)、10×Buffer、溴化乙錠、DL2000 DNA Marker，大連寶生物工程有限公司。

1.1.3儀器

核酸蛋白分析儀(DU640)，德國Beckman公司；實時熒光定量PCR儀(7500)，美國AB公司；PCR擴增儀(Veriti 96 Well Thermal Cycler)，美國AB公司；電泳儀(Model 200/2.0 power supply)，美國BIO-RAD公司；分子凝膠成像儀(VersaDoc)，美國BIO-RAD公司；比濁儀(PhoenlxSpec Nephelometer)，美國BD公司；水浴搖床(WS20)，德國Wiggens公司；微生物培養箱(IS600)，日本Yamato公司；脈沖場凝膠電泳儀(CHEF MAPPER)，美國BIO-RAD公司；水浴鍋(WNB400)，德國Memert公司；凝膠成像系統(VersaDoc)，美國BIO-RAD公司。

1.2實驗方法

1.2.1DNA提取

單增李斯特菌DNA的提取按照Wizard Magnetic DNA Purification System試劑盒說明進行，用DU640核酸蛋白分析儀對DNA 提取液濃度和純度進行測定，根據測定的DNA 提取液濃度配制100 μL質量濃度為20 ng/μL的工作液。工作液作為模板 DNA 于4 ℃保存，備用，剩余DNA原液于-20 ℃保存。

1.2.2單增李斯特菌鑒定

單增李斯特菌鑒定采用SN/T 1870—2007 食品中致病菌檢測方法 實時PCR法[7]，擴增體系(25 μL)：MasterMix 12.5 μL，上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，探針(10 μmol/L)0.5 μL，DNA模板2 μL，滅菌水補齊至25 μL。擴增條件：95°C 10 min，95°C 15s，60°C 1 min，40個循環。

1.2.3血清分型

單增李斯特菌的血清分型參照MICHEL D等[2]建立的多重PCR的方法進行，血清分型引物見表1。多重PCR擴增體系(50 μL)：10×Multi HotStart Buffer(含Mg2+) 5 μL， dNTPs(2.5 mmol/L)4μL，Taq酶(5U/μL)0.5μL，Lmo0737、ORF2819、ORF2110的上下游引物(10 μmol/L)各1μL， Lmo1118引物(10 μmol/L)1.5 μL， prs引物(10 μmol/L)0.5 μL，DNA模板2 μL，滅菌水補齊至50 μL。擴增條件：94 ℃ 10 min、94 ℃ 30 s、53 ℃ 69 s、72 ℃ 69 s、72 ℃ 7 min、35個循環。用2%的瓊脂糖膠塊對PCR產物對進行電泳，EB染色，用Gel Doc 2000獲取圖像，對條帶進行分析，判斷血清型。

表1　單增李斯特菌血清分型引物

1.2.4PFGE分子分型

按照美國疾病預防控制中心單增李斯特菌的PFGE標準操作方法進行[8]。用Bionumerics 6.6 軟件對結果進行數據處理，讀取數據后用沙門菌Braenderup血清型全球參考菌株H9812校準后進行聚類分析，采用非加權平均法(UPGMA)進行分析。相似性系數計算用Dice表示，在0～100%之間，0表示完全不相關，100%相同的為同一帶型，出現不同條帶即判定為不同PFGE帶型[9]。帶型命名參照PulseNet的標準命名原則進行。

2結果與討論

2.1食品中單增李斯特菌鑒定分析

利用SN/T 1870—2007 中的引物探針，對69株IQCC保存的單增李斯特菌進行實時熒光PCR鑒定，當Ct值≥40，判定結果為陰性，Ct值≤35，判定為陽性，若Ct值>35，而<40，重做樣本，重做結果Ct值≥40者為陰性，否則為陽性。實驗結果表明所有菌株實時熒光PCR鑒定均為陽性，部分菌株實時熒光鑒定結果見圖1。另外，69株單增李斯特菌保存在菌種庫前已經過生化鑒定或16s測序，且均為陽性。因此，結合保存前鑒定結果和本研究的實時熒光PCR鑒定結果，所選的69株菌株全部為單增李斯特菌，可用于后續研究。

圖1　部分單增李斯特菌實時熒光結果Fig.1　RT-PCR results for partial L.monocytogenes

2.2食品中單增李斯特菌血清分型分析

單增李斯特菌血清分型采用的是Michel Doumith等[2]建立的多重PCR方法，部分菌株血清分型凝膠電泳結果見圖2。MICHEL等[2]將單增李斯特菌分為4類血清型：(1/2a，3a)、(1/2c，3c)、(1/2b，3b)、(4b，4d，4e)。但是，分離自食品和臨床的單增李斯特菌至少95%以上的菌株是1/2a、1/2c、1/2b和4b[2]，因此，認為Michel Doumith等[2]建立的單增李斯特菌血清分型多重PCR方法將單增李斯特菌主要分為1/2a、1/2c、1/2b和4b 這4種血清型。

1-2：42206；3-4：42209；5-6：42218；7-8：42210；9-10：42214；11-12：42215；13-14：42217；15-16：ATCC 19115；17-18：CMCC 54003；19-20：CMCC 54004；21-22：空白對照圖2　部分單增李斯特菌血清分型凝膠電泳圖Fig.2　Serotype results for partial L. monocytogenes

69株單增李斯特菌血清分型結果見圖3。參考菌株ATCC 13932和ATCC 19115為4b(4d，4e)型，ATCC 15313、CMCC 54002、CMCC 54003和CMCC 54004為1/2a(3a)型；41株國內分離菌株分屬3個血清型，1/2a(3a)型(21/41，51.2%)、1/2c(3c)型(11/41，26.8%)和1/2b(3b)型(9/41，22.0%)，沒有4b(4d，4e)型；20株國外分離菌株同樣分屬3個血清型，1/2a(3a)型(14/20，70%)、1/2b(3b)型(3/20，15%)和4b(4d，4e)型(3/20，15%)，沒有1/2c(3c)型。國內分離菌株和國外分離菌株的主要血清型結果類似，1/2a(3a)型最多，與國內外的相關報道結果一致[10-12]。單增李斯特菌對人致病的主要為血清型為4b、1/2a和1/2b，3者約占本病的90%[13]，并且腦膜炎患者的4b型分離率(26%)顯著高于一般患者(16%)[14]。實驗中3株4b(4d，4e)型均來自進境食品，張惠媛同樣沒有在國內食品中檢測到4b(4d，4e)型血清型菌株，只在進口食品分離株中檢測到[15]，3株4b型菌株分別來自泰國、越南和韓國，應加強對該3個 國家4b(4d，4e)型菌株的防控。另外，結合PFGE分型結果可以看出， 11株1/2c(3c)血清型菌株的PFGE帶型聚類效果較好，有較高相似度(79.9%)，這與張耀祺、張蘭榮和狄慧玲的研究結果一致[16-18]，而1/2a(3a)、1/2b(3b) 和4b(4d，4e)型菌株的PFGE型別較分散，菌株同源性較差。

2.3食品中單增李斯特菌PFGE分型分析

69株單增李斯特菌基因組DNA被ApaⅠ酶切后，產生了10～16個條帶，條帶大小在49～450 kb之間。經BioNumerics 6.5軟件分析，69株單增李斯特菌相似度在31.2%～100%之間，共被分為55種PFGE帶型，PFGE聚類圖譜見圖3。單增李斯特菌的PFGE型別較分散，呈現同一帶型情況較少， GX6A12.CN0018型包含5株菌，GX6A12.CN0005型包含4株菌，GX6A12.CN0017型包含3株菌，GX6A12.CN0007、GX6A12.CN0013、GX6A12.CN0025、GX6A12.CN0030、GX6A12.CN0050型均包含2株菌，其余菌株各成一個帶型，這可能和樣品來源比較廣泛有關，實驗菌株共涉及12個進口國家和國內6個省。

PFGE分型結果結合菌株分離信息可以看出，北京地區的優勢PFGE帶型為GX6A12.CN0005(5株)和GX6A12.CN0018(3株)，太平洋群島的優勢PFGE帶型為GX6A12.CN0017(3株)，其他地區菌株太少，無法看出優勢帶型。另外，從PFGE分型結果中還發現GX6A12.CN0018、GX6A12.CN0025 和GX6A12.CN0050帶型的菌株分離來源不單一，如GX6A12.CN0018帶型中的5株實驗菌株，3株分離自中國北京，1株分離自太平洋島，另外1株分離自丹麥，表明不同來源的菌株存在很近的親緣關系，這也預示著隨著食品銷售的全球化，污染菌株也可能在全球范圍內流動。

圖3　單增李斯特菌PFGE聚類圖Fig.3　PFGE profile of L.monocytogenes

3結論

本研究初步建立了12個進口國家食品和國內食品中的單增李斯特菌的血清分型和PFGE分子分型數據庫，對追溯食品中單增李斯特菌來源，進行單增李斯特菌的流行病學研究和單增李斯特菌引起的食源性疾病的溯源和控制提供了基礎數據，同時，還可以協助實驗室進一步確認所檢出單增李斯特菌的來源，排除實驗室污染的可能，為食品中單增李斯特菌的檢測結果提供確鑿的實驗證據。

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Serotype and PFGE type ofListeriamonocytogenesisolated from foods

ZHANG Ya-hong1,2, WANG Ping2,WANG Wei1, CHEN Ying1,2*

1(College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)2(Agro-Product Safety Research Center, Chinese Academy of Inspection and Quarantine, Beijing 100176， China)

ABSTRACTThe serotypes and molecular typing of Listeria monocytogenes in imported food and domestic food were studied. The relativity of the genetic correlation among the strains from different sources and the relationship of different typing methods were discussed. The strains were characterized by serotyping and PFGE typing. The 69 strains belonged to 4 serotypes and 55 PFGE patterns. The predominant serotypes were 1/2a and the major PFGE pattern was GX6A12.CN0018. Listeria monocytogenes strains showed polymorphism in molecular type and there was no correlation between the imported food and the domestic food isolates.

Key wordsListeria monocytogenes； serotypes； pulsed-field gel electrophoresis(PFGE)；serotype

收稿日期：2015-07-29，改回日期：2015-10-21

基金項目：“十二五”農村領域國家科技計劃(2013BAD19B05，2012BAD29B07-2)

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201602004

第一作者：碩士研究生(陳穎為通訊作者,E-mail:chenyingcaiq@163.com)。