蛋白質與多酚相互作用研究進展

劉夫國，馬翠翠，王迪，高彥祥

(中國農業大學 食品科學與營養工程學院，北京，100083)

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蛋白質與多酚相互作用研究進展

劉夫國，馬翠翠，王迪，高彥祥*

(中國農業大學 食品科學與營養工程學院，北京，100083)

摘要植物多酚因其獨特的化學結構而具有抗腫瘤、抗氧化、抑菌、抗病毒等多種生理功能，在農業、食品、醫藥等領域得到了廣泛應用。多酚可以與蛋白質形成復合物從而導致2種化合物的結構、功能和營養特性的變化。影響蛋白質與多酚非共價相互作用的因素包括溫度、pH、蛋白質的類型和濃度，以及酚類化合物的類型和結構。與非共價相互作用相比，蛋白質與多酚共價相互作用將不可逆地改變2種分子的理化性質和功能特性。文中介紹了蛋白質和多酚之間相互作用的生化機制，討論了用于研究蛋白質與多酚相互作用的方法及所面臨的主要挑戰。同時，指出了分析蛋白質-多酚產物應考慮的主要問題。

關鍵詞蛋白質；多酚；相互作用；機理；功能特性

酚類化合物是植物體內一類最重要的次生代謝產物，具有較強的抗氧化作用，以及明顯的抑菌、抗癌、抗衰老和抑制膽固醇升高等功效。攝取一定量的植物多酚能夠有效地預防和抑制疾病的發生。隨著現代分離提取技術的迅猛發展，大量植物多酚已從植物中分離鑒定出來?？茖W研究表明，多元酚結構具有獨特的理化性質，如能與蛋白質、多糖、生物堿等結合，能與金屬離子絡合，具有還原性，能清除羥自由基等[1]。在食品加工及人體消化過程中，多酚能與多種化合物發生相互作用，其中蛋白質是最主要的化合物。

蛋白質與多酚通過可逆和不可逆的方式發生相互作用?？赡娴膹秃线^程通常涉及非共價相互作用，而大分子和多酚之間形成共價鍵的過程是不可逆的。共價復合物的形成主要源于多酚的氧化和親核加成過程。但是，在多數情況下，共價和非共價相互作用可能同時發生，例如綠原酸與蛋白質的結合[2-3]。本文將重點介紹蛋白質與多酚的相互作用、蛋白質與多酚相互作用的潛在機制及相互作用對蛋白質和多酚性質的影響。

1蛋白質與多酚的結構和性質

蛋白質是生命存在和運動的物質基礎，是高度復雜的聚合物。自然界中，生物體內的蛋白質由20種結構不同的氨基酸組成。蛋白質的結構和功能的不同主要取決于氨基酸的種類、數量、排列順序和肽鏈的空間結構。在食品體系中，蛋白質能夠與其他食品組分復合，例如多糖和多酚等，復合方式包括共價與非共價相互作用，如圖1所示。研究表明，蛋白質與多酚相互作用會引起蛋白質的二級和三級結構發生改變，溶解性降低而熱穩定性可能會提高[4]。

圖1　蛋白質與食品組分間的相互作用示意圖Fig.1　Schematic diagram of interactions between proteins and food ingredients

多酚類化合物是植物中一組化學物質統稱，通常含有羥基基團連接苯環的結構，常見的多酚化合物如圖2所示。多酚可分為兩大類：一類是多酚單體，即非聚合物，包括各種黃酮類化合物、綠原酸類、沒食子酸和鞣花酸，也包括一些接有糖苷基的復合類多酚化合物(如蕓香苷等)；另一類則是由單體聚合而成的低聚體或多聚體，統稱單寧類物質，包括縮合型單寧中原花青素和水解型單寧中沒食子單寧和鞣花單寧等。

圖2　常見多酚化合物的結構Fig.2　Chemical structures of the common polyphenolic compounds

多酚與蛋白質非共價和共價相互作用是2個影響富含多酚食品品質的根本因素。在加工食品中，多酚與大分子非共價相互作用主要源于弱結合，即氫鍵和疏水性相互作用的結果。同時，由于含酚羥基的化學結構，多酚具有高反應活性，它們很容易經過酶和非酶途徑被氧化，形成鄰醌或鄰半醌，與蛋白質的氨基酸側鏈基團發生反應。

2蛋白質與多酚非共價相互作用

蛋白質與多酚非共價鍵的作用包括疏水相互作用、氫鍵、范德華力等。雖然非共價相互作用很弱(一般小于10 kJ/mol，比通常的共價鍵鍵能小1～2個數量級)，作用范圍為0.3～0.5 nm，但這些分子間弱相互作用力可在一定條件下起協同作用，形成具有一定方向性和選擇性的強作用力[5]。 例如啤酒、葡萄酒、茶飲料、果蔬汁等在銷售期間容易形成混濁，嚴重影響到產品的質量和貨架期，而蛋白質與多酚非共價相互作用即是引起混濁或沉淀最常見、最重要的原因之一[6]。由于多酚分子結構的多樣性及蛋白質分子中存在多種不同功能基團，原則上氫鍵、疏水鍵、共價鍵都可能發生于蛋白質與多酚的相互作用中。至于共價鍵的形成則是一個不可逆變化過程，而許多由冷卻造成的混濁當重新加熱后又會部分或全部溶解，這表明在蛋白質與多酚的相互作用中沒有共價鍵合[6]。

2.1分析方法

為了探究蛋白質-多酚的相互作用和形成復合物的性質，在分子水平上認知蛋白質與多酚體系是非常重要的。蛋白質與多酚的非共價相互作用主要通過3種方法來進行研究：直接研究溶液中蛋白質與多酚形成的復合物；通過多酚來沉淀蛋白質；間接研究蛋白質與多酚相互作用對蛋白質活性(主要是酶)造成的影響[4]。由于蛋白質-多酚的相互作用較為復雜，沒有單一的技術能提供全面的信息，一般通過多種技術進行表征。這些技術包括熒光光譜、圓二色光譜、傅立葉變換紅外(FTIR)光譜、動態光散射(DLS)、等溫滴定量熱法(ITC)、核磁共振、平衡透析法、濁度測定法、蛋白質沉淀法、體積排阻色譜和親和色譜等，表1描述了這些方法的優缺點。

表1　直接用于評價蛋白質-多酚非共價結合方法的對比

2.2非共價相互作用機理及影響因素

蛋白質與多酚的相互作用受到蛋白質和多酚的結構、相對濃度、溶劑組成以及溶液參數(pH、離子強度、溫度等)的影響[7]。所有這些因素可以用來解釋蛋白質與多酚相互作用的機理。溶劑組成對蛋白質和單寧相互作用的影響表明，復合物的形成主要源于氫鍵和疏水相互作用[8]。疏水相互作用被認為是蛋白質與多酚相互作用最主要的驅動力，氫鍵會進一步加強這種作用。疏水相互作用主要是由多酚的芳香環和蛋白質的疏水位點引起的，如脯氨酸殘基的吡咯環。氫鍵主要發生在蛋白質的氫原子受體位點和多酚的羥基基團上；其他的相互作用比如離子鍵主要發生在蛋白質帶正電的基團(如賴氨酸的ε-氨基基團)和多酚帶負電的羥基基團上[4]。

氫鍵和疏水鍵都受溫度的影響，因此，在蛋白質和多酚形成非共價復合物的過程中，溫度是重要因素之一。SASTRY等[9]研究指出，溫度顯著影響葵花籽11S蛋白與綠原酸的結合。當溫度從30 ℃增加到45 ℃，葵花籽11S蛋白與綠原酸的結合能力顯著降低，在55℃下無相互作用力。Prigent等[10]研究了在5 、25和60 ℃條件下牛血清白蛋白(BSA)與綠原酸非共價相互作用，結果表明，隨著溫度的增加，兩者結合能力降低。

pH也是影響蛋白質與多酚非共價相互作用的重要因素之一。在低于蛋白質等電點0.3～3.1時，蛋白質-多酚非共價復合物的溶解度最低[11]。低pH值時，蛋白質有更多的結合位點，蛋白質和多酚的結合程度較大。在pH≤7條件下，綠原酸能夠與BSA、溶菌酶和α-乳清蛋白非共價結合，當pH值較低時，綠原酸與BSA結合量較多[2]。在較高pH值條件下，由于綠原酸被氧化形成自由基或醌類化合物，綠原酸和蛋白質的共價結合能力也較強[3]。

多酚和蛋白質的相對濃度也會影響兩者的相互作用。當一種蛋白質和一種多酚以各種比例混合時，可能會出現以下現象：如果蛋白質濃度保持恒定，隨著多酚添加量的增加，混濁形成量先是增加，到達一個最大值后開始下降；同樣，如果多酚添加量保持不變，改變蛋白質濃度，混濁形成量的變化具有類似的趨勢。Siebert等[12]采用模型解釋了這種現象。如圖3所示，假設蛋白質含有固定數目的多酚結合位點，同時多酚含有2個能與蛋白質結合的末端，當末端數目與蛋白質的結合位點數相等時，此時就會形成很大的網狀結構，產生較大的膠體粒子和最強的光散射。當蛋白質含量高于多酚含量，如啤酒體系，每個多酚可以橋連2個蛋白質分子，但是蛋白質不能連接到其他蛋白質上，因此形成蛋白質二聚體結構，產生少量混濁。當多酚含量超過蛋白質含量，如蘋果汁體系，幾乎所有的蛋白質的結合位點都被多酚所占據。因此，只被結合了一個末端的多酚分子很難在另一個蛋白質上找到合適的位點而把2個蛋白質連起來，同樣也只是形成很小的膠體粒子。該模型能夠預測蛋白質與多酚濃度增加時溶液體系濁度的變化。例如，當單寧酸與BSA相互作用時，過度增加BSA的含量，不溶復合物出現溶解現象[13]。

圖3　蛋白質與多酚相對濃度對其相互作用的影響Fig.3　Effect of relative concentration of proteins to polyphenols on their interactions

此外，多酚和蛋白質結構也影響兩者的結合[14]。多酚含有大量的酚羥基使其具有一定的親水性，在水中以膠體形式存在。而低親水性多酚能與蛋白質發生強烈的相互作用，同時多酚分子質量越高，越能有效地沉淀蛋白質。蛋白質與多酚結合取決于蛋白質的分子大小、二級和三級結構、表面疏水性及氨基酸的組成。一般來說，具有高堿性殘基含量、高脯氨酸含量、分子質量較大、疏水性較強，且結構展開的蛋白質更易與多酚發生非共價相互作用[4]。

3蛋白質與多酚共價相互作用

酚類化合物具有較高的反應活性，許多多酚都能夠被氧化成其相應的半醌和醌，它們能夠與親核試劑發生共價反應，如蛋白質的側鏈賴氨酸或半胱氨酸基團[15]。在食品加工中(例如熱處理)，醌的形成是一個重要因素，它可能成為分子相互反應的底物。例如阿魏酸或香豆酸被氧化形成半醌，然后通過自由基可參與非酶反應，包括聚合及分解反應等[16]。反應的先決條件是產生親電物質，進行親核(邁克爾型Michael-type)加成[15]。一般來講，反應的酚類化合物結構越復雜，反應產物越復雜。

由于反應產物難以拆分，因此蛋白質-多酚共價復合物的分析具有一定的挑戰性。目前，多采用理化方法和光譜特征相結合的方法來分析反應產物。

3.1分析方法

研究蛋白質與多酚反應產物時，可采用理化分析或質譜分析。理化分析方法集中于評價修飾的氨基酸，分析酚類化合物結合程度或者評價2種化合物性質的變化。質譜分析常常用于鑒定蛋白質特定的結合位點。目前2種方法仍有一定的局限性，其主要原因在于：(1)反應產物結構復雜；(2)蛋白質以及酚類化合物在反應后仍然能保持一定的活性。

3.1.1理化分析方法

評價蛋白質反應程度最簡單的方法是分析反應前后氨基酸側鏈的變化。因此可以通過分析氨基酸組成，或通過簡單的比色法來完成。例如采用三硝基苯磺酸測定游離氨基的變化。研究表明，與不同植物多酚共價結合后，乳清蛋白的游離氨基含量顯著下降[17]。同時可以通過熒光法來分析巰基含量的變化。與游離氨基基團的分析類似，蛋白質與多酚共價反應會導致游離巰基基團下降[18]。熒光測量也可用于色氨酸修飾的變化。在295 nm處激發的色氨酸是唯一吸收熒光的芳香族氨基酸，通?？稍?20 nm和390 nm之間發射熒光。因此采用熒光測定可以表征色氨酸基團的熒光淬滅。為了證實形成的鍵是共價鍵，常在含8 mol/L尿素的條件下測定色氨酸熒光的變化(排除非共價相互作用)。

同時，可以通過測定多酚含量來分析多酚與蛋白質的共價結合，常用的方法有：(1)通過福林酚法測定結合的酚酸含量；(2)通過堿水解獲得酚酸底物。另外可以利用紫外可見吸收光譜表征蛋白質-多酚復合物來確定結合的多酚[19]。

蛋白質與多酚生成共價復合物會改變蛋白質的理化和功能特性，因此共價反應的結果可以通過蛋白質性質的變化來進行評價。蛋白質與多酚共價結合后，親水-疏水性和溶解性會發生改變，并且這些變化會影響蛋白質的功能性質(例如乳化性、起泡性)[18]。蛋白質結構的變化可通過采用熒光探針來研究蛋白質的表面疏水性，蛋白質表面疏水性增加與溶解度的降低通常呈良好的相關性[15]。

這些理化分析方法可以反映蛋白質在共價相互作用中被修飾的程度，但存在較大的缺點是具有不同氨基酸側鏈的蛋白質和蛋白質-多酚共價復合物的結構尚未被系統地表征。

3.1.2質譜分析方法

分析蛋白質-多酚共價復合物的主要目的在于檢測特定的反應產物并鑒定相應的結合位點。通常，質譜技術具有一定的優勢。研究表明，添加不同分子后，基質輔助激光解吸/電離飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)能夠揭示不同分子質量的變化[20]。在一定程度上，通過使用蛋白酶對蛋白質進行水解，通過比對修飾的和未修飾肽的指紋圖譜，可以鑒定蛋白質的反應位點[21]。研究表明，在反應產物中，未修飾的蛋白質仍然占主導地位，因此樣本的純化成為產物分析不可缺少的部分[15]。然而，MALDI-TOF-MS和色譜為基礎的表面增強激光解吸/電離飛行時間質譜(SELDI-TOF-MS)也有其局限性。它們的分辨率取決于蛋白質是否被修飾以及修飾程度。多數情況下只有少量的與蛋白質復合物具有較大差異的反應產物被成功鑒定。

3.1.3其他分析方法

目前，熒光猝滅、多光譜方法、電泳、電噴霧質譜、高性能親和層析和NMR光譜等已被用來表征蛋白質-多酚共價相互作用[4, 22]。然而，鑒定多酚在蛋白質序列中的特定的結合位點和相應的構象仍然具有一定的挑戰性。高性能薄層色譜(HPTLC)作為一種新型的分析方法，在多酚-蛋白質相互作用表征方面具有一定的應用潛力。一維HPTLC和二維HPTLC已經成功地應用于肽圖譜的測定[23]，其分離機理不僅取決于電荷，同樣取決于蛋白質的親水/疏水性，因此可通過種類繁多的吸附劑、溶劑和色譜技術來進行優化[15]。

3.2共價相互作用的復雜性及反應機理

如前所述，在與氨基酸反應之前，酚類化合物可能被氧化并反應到一定程度。同時，當多酚與蛋白質反應后，酚類化合物仍保持活性，因此具有再次被氧化的可能性，并進一步與蛋白質分子產生第二個結合位點。這種蛋白質交聯會生成高相對分子質量的蛋白質復合物。因此，反應混合物可能包含3種類型的反應產物：簡單的反應產物，其中酚類化合物被結合到特定的氨基酸側鏈；混合的反應產物，由結合的低聚物及底物組成；復雜的交聯蛋白質及其衍生物等。

制備蛋白質-多酚共價復合物的方法主要包括堿法[18]、酶法[3]和自由基法[24]。堿法和酶法的應用較早，通常是在氧氣存在的條件下，通過堿處理或者酶催化的方法誘導多酚氧化形成醌，再與蛋白質的親核側鏈形成共價產物。這些親和基團包括賴氨酸側鏈的ε氨基基團，巰基基團，或色氨酸的吲哚基團等。IEMMA的研究團隊提出了多酚與蛋白質接枝的羥基自由基誘導法[24]。通過雙氧水和抗壞血酸進行氧化還原反應產生羥自由基，然后該自由基進攻蛋白質側鏈的敏感氨基酸殘基，產生活性中間產物，該物質隨后同小分子的多酚形成共價鍵。由于自由基法在室溫下進行，反應程序簡單，不會產生有毒副產物，近年來廣泛用于合成蛋白質-多酚共價復合物[25-29]。YOU等[25]分別采用堿法和自由基法制備卵轉鐵蛋白-兒茶素共價復合物，研究表明，與卵轉鐵蛋白相比，通過堿法和自由基制備的共價復合物具有更高的分子質量(圖4)。通過串聯質譜技術研究發現，兒茶素主要與卵轉鐵蛋白的賴氨酸和谷氨酸殘基發生了共價復合反應。

共價復合物1: 通過自由基法制備的卵轉鐵蛋白-兒茶素共價復合物；共價復合物2: 通過堿法制備的卵轉鐵蛋白-兒茶素共價復合物圖4　卵轉鐵蛋白和卵轉鐵蛋白-兒茶素共價復合物的基質輔助激光解吸/電離飛行時間質譜Fig.4　MALDI-TOF-MS of ovotransferrin and ovotransferrin-catechin conjugates.

4相互作用對蛋白質性質的影響

4.1對蛋白質結構和功能性質的影響

目前，有關蛋白質影響多酚的相關機理仍不明確，但有關多酚對蛋白質結構的影響研究較為深入。蛋白質與多酚相互作用會引起蛋白質結構的改變，導致蛋白質的疏水-親水性的相應變化以及溶解度的改變。這些變化將會影響蛋白質的功能性質(例如乳化性、起泡性等)。HASNI等[30]采用傅里葉變換紅外光譜、紫外可見光譜、圓二色光譜、熒光光譜法和分子模擬技術，在分子水平上研究了α-酪蛋白和β-酪蛋白與茶多酚的相互作用。研究表明，茶多酚主要通過疏水相互作用與α-酪蛋白和β-酪蛋白結合。由于β-酪蛋白具有更強的疏水性，因此，其與茶多酚結合得更緊密。多酚減少了酪蛋白的α-螺旋和β-折疊結構，增加了無規則卷曲，酪蛋白的構象改變。RAWEL等[31]研究了大豆蛋白和多酚(如綠原酸、咖啡酸和沒食子酸)之間的相互作用，發現這些蛋白質和多酚的結合使復合物的分子質量增加。綠原酸-BSA共價復合物的圓二色光譜表明，BSA經共價修飾后，蛋白質的α-螺旋下降，無規則卷曲結構增加[32]。

蛋白質在食品體系中有多種功能特性，例如溶解性、持水能力、凝膠作用、乳化性等。酚類化合物與蛋白質的反應可能會引起蛋白質交聯。這種相互作用也改變了蛋白質分子的凈電荷，從而影響了蛋白質的溶解性。PRIGENT等[2]研究表明，當pH≥8.0時，由于綠原酸氧化形成醌類化合物，綠原酸的存在會使溶菌酶的溶解性下降。當肌紅蛋白與酚類化合物混合后，其溶解性也發生變化[33]。由于這些相互作用，蛋白質的二級結構和三級結構發生了改變，影響了蛋白質分子的表面性能，使它們具有親水性。親水/疏水性的改變不僅影響了蛋白質的溶解性，也會影響乳化性、凝膠作用和起泡性等其他功能特性。

4.2對蛋白質消化特性的影響

在胃腸道中，多酚與蛋白質的相互作用將影響蛋白質的消化率，導致其營養質量下降，這主要歸因于必需氨基酸的破壞及對蛋白酶的抑制作用。同時，飲食中蛋白質與多酚的結合將形成可溶或不可溶的復合物，影響它們的生物利用度。體外實驗表明，多酚修飾會使胃腸道酶對溶菌酶衍生物的消化產生不利影響[20]。然而，由于蛋白質構象的差異，每種蛋白質具有不同的消化特性。

多酚共價修飾會影響蛋白質及酶的生物活性，導致蛋白質的營養價值降低。大鼠生長和氮平衡實驗表明蛋白質與綠原酸共價結合會影響β-乳球蛋白的營養特性[34]。此外，酚類化合物性質可能也會受到影響，例如，因以化學鍵的形式連接到蛋白質上，酚類化合物的抗氧化活性下降[35]。

有研究指出，由于濃縮單寧的存在，蛋白質在體內和體外的消化率有所下降。蛋白質與單寧類物質相互作用會形成不易消化的蛋白質-單寧復合物[14]。研究表明，高粱濃縮單寧能與高粱醇溶蛋白形成復合物，降低蛋白質的消化率[36]。綜上所述，分析蛋白質在一定條件下(如食品加工、消費、消化)被多酚修飾的程度至關重要，因為這將影響到蛋白質的消化吸收特性。

5研究展望

目前除了對多酚的植物學和營養學方面有較為全面的研究，多酚與植物、食品甚至人體中成分的相互作用的研究仍很稀缺。蛋白質和酚類化合物的相互作用是一個復雜的現象，從蛋白質與多酚相互作用的幾種可能性來說，共價反應產物似乎是最重要的部分，因為它們不可逆地影響蛋白質和多酚的性質。多酚與蛋白質共價反應后，反應產物在很大程度上保持了植物多酚的化學性質，同時賦予蛋白質分子許多新的性能，明顯拓寬了植物多酚和蛋白質的應用領域。因此應加強蛋白質與多酚復合物的性質研究，開發新型功能材料。同時，應詳細研究蛋白質與多酚相互作用的最適條件以改善食品加工過程，最大限度地提高食品的營養和功能特性。

近年來分析技術得到了快速發展，但仍然難以運用傳統蛋白質化學技術來確定蛋白質與多酚相互作用的結合位點。因此新技術的開發應不僅關注蛋白質結構變化，同時也應考慮到參與反應的多酚的性質。采用傳統蛋白質化學技術和光譜聯用技術，例如實現高性能薄層色譜與質譜的組合，可能會激發新的研究蛋白質與多酚共價復合物的方法。

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Recent research progress on interactions between polyphenols and proteins

LIU Fu-guo, MA Cui-cui, WANG Di, GAO Yan-xiang*

(College of FoodScience and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China)

ABSTRACTBecause of its unique chemical structure, plant polyphenol has a variety of physiological functions, such as anti-tumor, anti-oxidation, anti-bacterial, anti-viral, et al. Polyphenols have been widely used in the fields of agriculture, food and medicine. Polyphenols can make complexes with proteins which leading the changes in the structure, functional and nutritional properties of the two compounds. Polyphenol-protein interactions depend on several factors, such as temperature, pH, structure and concentration of proteins, as well as the type and structure of the phenolic compounds. Compared with the non-covalent interactions, covalent interactions between protein and polyphenols will irreversibly alter the physicochemical properties and functional characteristics of the two molecules. This article described the biochemical mechanisms of interaction between proteins and polyphenols, discussed methods for the study of the interactions and the main challenges faced. Meanwhile, it also pointed out the main issues to be considered when analyzing the complexes. This article gives a better understanding of the functional consequences of these interactions on food/biological systems.

Key wordsproteins; polyphenols; interactions; mechanism; functional properties

收稿日期：2015-07-31，改回日期：2015-08-28

基金項目：國家自然科學基金資助項目(No. 31371835)

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201602048

第一作者：博士研究生(高彥祥教授為通訊作者，E-mail：gyxcau@126.com)。