Mecp2在斑馬魚胚胎神經發育中對NOTCH信號通路的調控

何麗番 高海

（山西農業大學動物科技學院，太谷 030801）

Mecp2在斑馬魚胚胎神經發育中對NOTCH信號通路的調控

何麗番 高海

（山西農業大學動物科技學院，太谷 030801）

旨在探討Mecp2在斑馬魚胚胎神經發育過程中的調控及機制。利用Notch轉基因魚，通過原位雜交技術和激光共聚焦顯微技術發現Mecp2在胚胎發育過程前期廣泛表達，隨后逐漸表達在腦部。在敲低Mecp2的胚胎中，Notch信號的表達明顯降低，注射Mecp2-RNA和胞內NICD-RNA均能夠恢復這種表型，標記神經成熟的神經因子Ngn1、Pax2、Pax3、Eno2、Map和RNA結合蛋白HUC表達下調。在敲低Mecp2后其靶分子轉錄抑制因子Hey2表達下調，敲低Mecp2阻礙了神經細胞的正常分化成熟，結果表明Mecp2能夠通過Notch-Hey2信號通路來調控斑馬魚神經細胞的分化。

Mecp2；斑馬魚；神經發育；Notch信號通路；神經細胞分化

Mecp2基因突變導致瑞氏綜合征［1］（Rett syndrome，RTT），是一種神經系統發育異常性疾病，典型RTT的臨床特征為，出生后6-18個月生長發育基本正常，隨后出現神經發育停滯或倒退。到目前為止，人們尚不清楚Mecp2在細胞中的功能。Bird［2］推測其在保護或維持細胞功能完整性起作用。Mecp2基因敲除小鼠可正常出生，但壽命較短，會出現一些RTT的癥狀［3，4］。Notch信號通路在神經細胞分化過程中扮演著重要角色，維持著神經細胞增殖、分化、凋亡之間的平衡，對細胞分化命運起決定性作用。Notch信號的產生是通過相鄰細胞的Notch配體與受體相互作用，Notch蛋白經過3次剪切，由胞內段（NICD）釋放入胞質，并進入細胞核與轉錄因子CSL結合，形成NICD/CSL轉錄激活復合體，從而激活Hey、Hers、Hes等堿性-螺旋-環-螺旋轉錄抑制因子家族的靶基因，發揮生物學作用［5-8］。本實驗選用斑馬魚作為研究對象，探討Mecp2在斑馬魚胚胎發育過程中對Notch通路中的調控作用。

1 材料與方法

1.1 材料

表達質粒：pGEX-4T-1載體。斑馬魚：實驗用斑馬魚野生型品系為TL與AB。轉基因斑馬魚品系NotchTg（Tp1bglob：hmgb1-mCherry），Tg（neurod：EGFP）。Mecp2-MO（morpholino oligo）：GeneTools公司，5'-TCTGCGGCGGCCATTTTTATTTAAA-3'。Mecp2原位雜交探針序列：F：5'-CGGGATCCGGCAGGGGAAGCCCG-3'，R：5'-GTTGAATTCATTTTCCTGGA CTCTTTTCTATGACGCG-3'。

Mecp2抗體：中國醫學科學院藥用植物研究所胡克平實驗室惠贈［9］。

1.2 方法

1.2.1 斑馬魚的飼養 斑馬魚生長于28.5℃環境下，以豐年蝦為食，循環水使用紫外滅菌水，水鹽度維持在450-500 μs/cm，pH值為7左右。在每晚喂食后與熄燈前，將雌魚和雄魚放于同一交配盒中，并用隔板將雌雄魚分開，放入約1/3的系統循環水。待第2天亮燈后，移除擋板，雌雄魚分別產下卵細胞和精子，并在水中受精。胚胎使用E3培養液，以保證胚胎的生理平衡。用于原位雜交的斑馬魚胚胎在受精后24 h左右換入含有0.0045% PTU（Sigma P7629）的1 × E3水溶液，以防止胚胎色素的生成。1.2.2 斑馬魚胚胎的顯微注射 顯微注射采用氣壓注射儀，用普通氮氣驅動，壓力設為0.3 PSI，從而防止液體回流。使用無齒鑷在體視鏡下將針頭折斷，盡量斷成斜切面，以便于注射。

1.2.3 斑馬魚胚胎免疫熒光染色 胚胎發育到所需時間，置于4% PFA在4℃過夜。PBST洗滌3次后，用30%蔗糖溶液置換。放入OCT包埋劑中，置于-80℃中冷卻樣品。將切片加入到預冷的丙酮于-20℃處理10 min。加入封閉液，室溫孵育1 h。加入一抗，4℃過夜，洗滌，再加入二抗，用含有DAPI的封片劑封片，避光保存。胚胎成像使用 Zeiss 700激光共聚焦顯微鏡的20倍水鏡，并用Imaris7.0（Bitplane）軟件處理拍攝的3D圖像。

1.2.4 斑馬魚胚胎原位雜交 制備 RNA探針，用雜交液將RNA探針稀釋10倍作為儲存液-80℃凍存。胚胎收集與固定，每管加入1 mL多聚甲醛固定，4℃過夜。次日進行胚胎脫水，依次用25%甲醇的PBS溶液3-5 min、50%甲醇的PBS溶液3-5 min、75%甲醇的水溶液3-5 min、100%甲醇處理并在-20℃放置至少2 h，也可存放-20℃。經過胚胎復水，洗滌，蛋白酶K處理，預雜交，雜交，封閉，洗滌，染色，雜交后胚胎信號采集等過程。

2 結果

2.1 Mecp2在斑馬魚神經發育過程中的表達

原位雜交結果顯示，Mecp2在斑馬魚胚胎發育過程中，隨時空變化，在腦部呈現高表達，Mecp2從單細胞到24 h表達廣泛（圖1-A-D），48 h Mecp2在斑馬魚頭部高表達（圖1-E），且主要在細胞核表達，通過免疫熒光和蛋白印跡再次證實敲低Mecp2的胚胎中Mecp2蛋白表達明顯減少，同時也證明Mecp2-MO特異性顯著［9］。

2.2 注射Mecp2-MO斑馬魚表型變化

將Mecp2-MO稀釋成2 mmol/L 貯存液，注射時4倍稀釋，每胚注射2.3 nL。注射斑馬魚Mecp2-MO（圖2-D），28 h側觀相比野生型（圖2-C），個體變小，頭部結構紋理不清晰，眼睛輪廓變小，尾部彎曲等各種表型變化；背觀頭部（圖2-F），28 h相比野生型（圖2-E），前腦、中腦、后腦結構紋理模糊；15 d后，注射斑馬魚Mecp2-MO的魚（圖2-B），有部分死亡，存活下來大部分畸形，貌似正常的相比野生型（圖2-A），發育遲緩。

2.3 注射Mecp2-MO后NOTCH信號的表達變化

實驗結果顯示，敲低Mecp2（圖3-B、D、F）相對野生型（圖3-A、C、E），觀察發現NOTCH轉基因魚胚胎頭部（前腦、中腦、后腦）和軀干部表達明顯下調，共注射Mecp2-RNA（鼠源，圖4-D）和Mecp2-MO后能夠使Mecp2-MO敲低的表型得到恢復，但單一注射RNA-Mecp2（鼠源，圖4-C）與野生型Tg（Tp1bglob：hmgb1-mCherry）轉基因魚胚胎相比較，其前腦、中腦表達明顯下調，但其后腦的表達變化不明顯。觀察到同時注射NICD-RNA和Mecp2-MO也能夠使Mecp2-MO敲低的表型得到恢復（圖4-H），但只注射NICD-RNA（圖4-G）與野生型（圖4-E）NOTCH轉基因魚胚胎相比較，頭部表達顯著提高。

圖1 Mecp2在斑馬魚胚胎發育過程中的時空表達

圖2 注射Mecp2-MO后斑馬魚的表型變化

圖3 Mecp2對NOTCH信號表達影響

2.4 敲低Mecp2的胚胎，對神經因子表達影響

注射Mecp2-MO后，胚胎免疫熒光顯示（圖5-A-F），在敲低Mecp2的胚胎中標記分化成熟神經細胞的蛋白Huc的表達與野生型胚胎相比明顯減少。標記神經細胞分化成熟的神經因子Neurod Tg（neurod：GFP）相比野生型neurod的表達明顯減少（圖6-C），注射NICD-RNA后，相比野生型Neurod的表達并沒有明顯的變化（圖6-B），但共同注射NICD-RNA和Mecp2-MO后，其表型可恢復到正常狀態（圖6-D）。原位雜交結果顯示，敲低Mecp2的胚胎中相關神經因子Ngn1、Pax2、Pax3、Eno2、Map（圖7-B、D、F、H、J）表達與野生型（圖7-A、C、E、G、I）相比較明顯減少。以上這些實驗結果表明，敲低Mecp2雖然沒有造成斑馬魚腦部發育出現明顯的缺陷，但是神經細胞分化成熟過程受到影響，神經細胞處于分化不完全或遲緩的狀態。

2.5 注射Mecp2-MO后轉錄抑制因子Hey2的表達變化

原位雜交結果顯示，Hey家族成員hey2，在敲低Mecp2的胚胎中的表達與野生型胚胎（圖8-A）相比也明顯降低（圖8-B），背部神經管消失。注射NICD-RNA（圖8-C）與野生型相比，沒有明顯變化，當共同注射NICD-RNA+Mecp2-MO時發現背部神經管能部分得到恢復（圖8-D），有一定比例胚胎的表達回到了正常水平。實驗表明敲低Mecp2胚胎中，Hey2的表達也降低，抑制Mecp2的低表達相應hey2的表達也得到提高。

圖4 Mecp2-RNA-和NICD-RNA能夠rescue敲低Mecp2-Tg（Tp1bglob∶hmgb1-mCherry）轉基因魚的表型

3 討論

有研究表明［10，11］，Notch信號通路對于神經細胞發育至關重要。在斑馬魚突變體mind bomb（mib）中，Notch信號通路活性減弱，標記分化成熟神經細胞的基因如huc表達明顯增加。Notch信號對于激活許多Hairy and Enhancer-of-split［H/E（Spl）］基因是必需的，這些基因通過抑制神經發育相關的基因轉錄從而影響了神經細胞正常的分化成熟過程。本實驗發現，抑制Mecp2的胚胎中Notch信號本身減弱，以及NICD（Notch intracellular domain）直接的靶基因hey2，在斑馬魚腦部的表達與野生型胚胎相比都明顯降低（圖3-B、D），這些實驗結果說明，敲低Mecp2后Notch信號通路活性減弱。

圖5 敲低Mecp2對RNA結合蛋白HUC表達的影響

圖6 Mecp2對Neurod Tg（Neurod：GFP）信號表達的影響

實驗結果顯示，敲低Mecp2后（圖3-B），觀察到Tg（Tp1bglob：hmgb1-mCherry）轉基因魚胚胎頭部前腦、中腦、后腦表達明顯下調，共注射Mecp2-RNA（鼠源，圖3-C）和Mecp2-MO后能夠使Mecp2-MO敲低的表型得到恢復，但注射 Mecp2-RNA（鼠源，圖4-C）與野生型Notch轉基因魚胚胎相比較，其前腦、中腦表達明顯下調，但其后腦的表達變化不明顯。同時也觀察到，同時共注射RNA-NICD和Mecp2-MO也能夠使Mecp2-MO敲低的表型得到恢復（圖4-H），但只注射NICD-RNA（圖4-G）與野生型Notch轉基因魚胚胎相比較，頭部表達顯著提高。注射Mecp2-RNA和NICD-RNA都能夠恢復Mecp2-MO敲低的表型，說明Mecp2在神經發育過程中起非常重要的作用，并對Notch信號通路具有調控作用。從而激活HEY家族堿性-螺旋-環-螺旋（Basichelix-loop-helix，bHLH）轉錄抑制因子家族的靶基因，發揮生物學作用。

圖7 Mecp2對Ngn1、Pax2、Pax3、Eno2、Map不同神經因子表達的影響

圖8 Mecp2對Hey2表達的影響

本實驗研究發現斑馬魚Mecp2存在母源表達，發育早期廣泛表達，從胚胎受精后24 h表達開始增加，隨著發育的進程逐漸集中在腦部，到受精后48 h表達集中于頭部（圖1）。敲低Mecp2影響斑馬魚神經細胞的分化成熟；從而實現對神經細胞分化成熟的精細調控。敲低Mecp2的斑馬魚胚胎腦部發育正常但是總體積變小，能夠正確分隔成為前腦、中腦和后腦；神經細胞的增殖正常；標記神經細胞的基因如ngn1、pax2、pax3、neurod、map2、eno2和蛋白Huc的表達明顯減少（圖7）。Mecp2基因敲除小鼠神經細胞增殖正常，樹突分支復雜度降低，電生理活性降低［12］；最新研究表明，敲除Mecp2后小鼠神經細胞胞核以及胞體變小，單個神經細胞的RNA轉錄和蛋白質合成都減少［13］；但抑制Mecp2表達的斑馬魚神經細胞增殖也正常；樹突分支復雜度和電生理活性本實驗沒有分析；運動神經元的胞體大小需統計定量才能得出結論；標志成熟神經細胞的基因如map2的表達也明顯減少。因此認為，Mecp2對于不同物種神經系統發育的影響還是存在一定差異的。這種功能上的差異可能是因為Mecp2在不同物種發育過程中表達的時空差異造成的。

在實驗中也發現敲低Mecp2后，觀察到Tg（Tp1bglob：hmgb1-mCherry）轉基因魚胚胎頭部前腦、中腦、后腦表達明顯下調，共注射RNA-Mecp2和Mecp2-MO后能夠使Mecp2-MO敲低的表型得到恢復，共注射RNA-NICD和Mecp2-MO也能夠使Mecp2-MO敲低的表型得到恢復，說明Mecp2或其復合物在notch信號通路中起抑制作用。之前的文獻報道，Mecp2能夠與轉錄活化因子cAMP 反應元件結合蛋白1（CREB1）相互作用，介導基因啟動子區的活化［14］。Mecp2還能夠和Y盒結合蛋白1（YB-1）［15］，PRPF3（pre-mRNA processing factor 3）［16］相互作用，調節基因mRNA的剪切，找到的Mecp2結合蛋白具有明確的轉錄激活功能和mRNA剪切功能，將進一步驗證結合蛋白在神經細胞發育中的功能，但hey2如何調控notch信號通路活性的，尚不清楚，這是下一步需要認真研究的問題。

4 結論

Mecp2在胚胎神經發育前期廣泛表達，敲除Mecp2能延緩胚胎神經細胞發育，Mecp2能夠通過Notch-Hey2信號通路來調控斑馬魚神經細胞的分化。

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（責任編輯 李楠）

The Regulation of Mecp2 on Notch Signaling Pathway During Early Neural Development of Zebrafish Embryos

HE Li-fan GAO Hai
（College of Animal Science and Veterinary Medicine，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801）

This study aims to explore the regulation role and mechanism of Mecp2 during early neural development of zebrafish embryos. By the techniques of confocal laser scanning microscopy and in situ hybridization，and using Notch transgenic fish，it was found that Mecp2 widely expressed in the early embryonic development，then gradually expressed in the brain. In the embryos with Mcep2 knockdown，the expression of Notch signal decreased，and both the injection of Mcep2-RNA and intracellular INCD-RNA restored the phenotype. The expression of neural factors of Ngn1，Pax2，Pax3，Eno2，and Map labelling for neural maturation as well as HUC binding with RNA were downregulated. After Mecp2 knocked down，the expression of transcriptional repressor Hey2 downregulated because the knockdown hindered the differentiation and maturation of neural cells. Our study showed that Mecp2 regulated the differentiation of nerve cells of zebrafish through Notch-Hey2 signaling pathways.

Mecp2；zebrafish；neurodevelopmental；Notch signaling pathway；neural cell differentiation

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.04.031

2015-09-17

國家自然科學基金項目（2011CB504700）

何麗番，女，碩士研究生，研究方向：分子信號轉導調控；E-mail：helifan89@163.com

高海，博士，副教授，研究方向：蛋白功能及信號轉導；E-mail：scaugh@163.com