紅鰭東方鲀（Takifugu rubripes）干擾素調節因子2基因的克隆及原核表達

孫賽紅馬普孫鶴孔德榮李慧仇雪梅姜志強劉海映劉洋劉圣聰孟雪松王秀利

（1. 大連海洋大學 農業部北方海水增養殖重點實驗室，大連 116023；2. 大連海洋大學水產與生命學院，大連 116023；3. 大連海洋大學海洋科技與環境學院，大連 116023；4. 大連天正實業有限公司，大連 116011）

紅鰭東方鲀（Takifugu rubripes）干擾素調節因子2基因的克隆及原核表達

孫賽紅1，2馬普2孫鶴2孔德榮2李慧2仇雪梅2姜志強1劉海映3劉洋2劉圣聰4孟雪松4王秀利1，2

（1. 大連海洋大學 農業部北方海水增養殖重點實驗室，大連 116023；2. 大連海洋大學水產與生命學院，大連 116023；3. 大連海洋大學海洋科技與環境學院，大連 116023；4. 大連天正實業有限公司，大連 116011）

干擾素調節因子（Interferon regulatory factor，IRF）是一種多功能的轉錄因子。采用反轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）和cDNA末端快速擴增（RACE）技術克隆了紅鰭東方鲀干擾素調節因子2（Interferon regulatory factor 2，IRF2）基因的全長cDNA。該基因全長為1 552 bp，其中5'非編碼區（5'-UTR）187 bp，3'非編碼區（3'-UTR）429 bp，編碼區（CDS）為936 bp，共編碼311個氨基酸。將IRF2的編碼區序列連接到原核表達載體pET32a（+），成功構建了重組體pET32a（+）-IRF2。將重組體pET32a（+）-IRF2轉入大腸桿菌感受態細胞BL21（DE3）中，獲得了重組表達IRF2的基因工程菌。經IPTG誘導，pET32a（+）-IRF2在BL21中得到了融合表達。通過對表達產物的純化和Western blotting檢測，結果顯示紅鰭東方鲀IRF2基因在大腸桿菌中的表達效果較高，目的蛋白準確。

紅鰭東方鲀；干擾素調節因子2；cDNA末端快速擴增；原核表達

紅鰭東方鲀（Takifugu rubripes），是一種重要的近海經濟魚類，由于其肉質細膩、味道鮮美深受人們的喜愛。然而，海水環境中存在的病菌和病毒致使魚類的皮膚和黏膜不斷受到侵襲，這些病原微生物侵入魚體后導致魚體發生病變甚至死亡［1］，給紅鰭東方鲀的大規模養殖造成嚴重的經濟損失。

干擾素調節因子（Interferon regulatory factor，IRF）是一類結構上保守的轉錄因子家族，可分為4個亞家族：IRF1亞家族、IRF3亞家族、IRF4亞家族和IRF5亞家族［2］。所有IRF N端均包含一個由115個氨基酸殘基構成的具有螺旋-轉角-螺旋的DNA結合域（DNA binding domain，DBD）。IRF通過DBD結合到特定的DNA基序上［3］，使其在轉錄調控［4］、免疫細胞（如樹突狀細胞、NK細胞和T細胞）的發育［5-7］、細胞因子的信號轉導［8］及抗腫瘤［9］方面起到重要作用。因此對魚類IRF的研究及其在魚類疾病防治等方面的應用意義重大。

本研究利用cDNA末端快速擴增（RACE）技術獲得了紅鰭東方鲀IRF2基因的全長cDNA序列，通過基因重組，轉化到大腸桿菌中表達，得到重組IRF2蛋白，旨在進一步研究重組紅鰭東方鲀干擾素調節因子2蛋白活性及其在紅鰭東方鲀健康養殖上的應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗用健康紅鰭東方鲀采自大連天正實業有限公司，日齡為266 d。采集紅鰭東方鲀腎臟組織，并迅速凍存于液氮中，保存于-80℃超低溫冰箱中備用。

1.2 方法

1.2.1 引物設計及合成 根據NCBI的RefSeq 數據庫中的紅鰭東方鲀干擾素調節因子2（IRF2）的預測序列（GenBank注冊號：XM-003978691.1）（此序列的編碼區不完整，其cDNA 缺少3'末端），利用生物信息學軟件Primer Premier 5.0設計引物（表1）。3'-RACE CDS3用于cDNA第一鏈的合成，IRF2-GSP3/UPM用于3'-RACE 的PCR擴增，IRF2-NGSP3/NUP用于巢式PCR，F-IRF2/R-IRF2用于編碼區（CDS）擴增。引物由生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 本研究所用引物

1.2.2 總 RNA的提取 從-80℃冰箱中取出紅鰭東方鲀腎臟組織約0.1 g，按照RNAiso Plus試劑盒（TaKaRa公司）說明書的方法提取總RNA，1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的質量，-80℃下保存備用。

變速器內的油環、膠圈、銅套、閥芯其實是代表了油路的密封點和容易失效部位，依照這些關鍵點，我們就可以保證變速器內油路的完整性，并以系統科學的流程來找到故障根源。

1.2.3 紅鰭東方鲀IRF2基因的 3'RACE 按照SMARTerTMRACE-Ready cDNA Amplification Kit說明書（北京全式金生物技術有限公司）將提取的總RNA進行反轉錄，合成3'-RACE-Ready cDNA。以此cDNA為模板進行第一輪PCR擴增，擴增條件為：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，62℃退火30 s，72℃延伸2 min，共30個循環；72℃終延伸7 min。以上述PCR產物為模板，進行巢式PCR，擴增條件為：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸2 min，共30個循環；72℃終延伸7 min。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠檢測，在凝膠成像系統中觀察結果并拍照。

1.2.4 PCR產物的回收及測序 PCR產物的回收按照Agarose gel DNA Fragment Recovery Kit ver 2.0（生工生物工程股份有限公司）說明書操作。將回收產物與pMD19-T載體（TaKaRa公司）連接并轉化到E.coli DH5α感受態細胞（TaKaRa公司）內，經氨芐青霉素和藍白斑篩選后隨機挑取3個陽性轉化子進行菌落PCR鑒定，PCR產物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。采用DNAstar軟件對3'端測序結果和已知序列進行拼接，得到紅鰭東方鲀IRF2基因的全長序列。

1.2.5 生物信息學分析 在ExPASy網站（http://web. expasy.org/protparam/）在線進行編碼蛋白的理化性質分析；運用Signal P分析信號肽序列；采用GOR在線工具分析紅鰭東方鲀IRF2蛋白的二級結構；利用clustalx軟件進行多重序列比對分析并采用Mega 5.0軟件構建進化樹。

1.2.6 紅鰭東方鲀IRF2基因原核表達載體的構建 根據IRF2基因ORF序列設計特異引物F-IRF2/ R-IRF2（表1），以3' RACE合成的cDNA為模板進行PCR，擴增條件為：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30個循環；72℃終延伸7 min。產物經1%瓊脂糖凝膠檢測后進行膠回收。將膠回收產物與pMD19-T載體16℃連接4 h，并轉化到E.coli DH5α感受態細胞內，經氨芐青霉素和藍白斑篩選，挑取陽性轉化子擴大培養，提取質粒命名為pMD19-T-IRF2，并送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。以質粒pMD19-T-IRF2為模板，用引物F-IRF2/R-IRF2進行PCR擴增紅鰭東方鲀IRF2編碼區序列。參照Yuan等［14］的原核表達載體構建方法將PCR產物和表達載體pET-32a（+）（本實驗室保存）分別進行NcoⅠ和XhoⅠ雙酶切后用T4 DNA Ligase 連接，轉化至E.coli DH5α感受態細胞內，挑取單菌落擴大培養后提取質粒，質粒經PCR及雙酶切鑒定均為陽性后送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序，測序正確的陽性重組質粒命名為pET32a（+）-IRF2。

1.2.7 紅鰭東方鲀IRF2基因原核表達載體的誘導表達 測序鑒定正確的重組質粒pET32a（+）-IRF2轉化至BL21（DE3）感受態細胞（本實驗室保存），37℃培養過夜，按1∶100轉接至100 mL LB培養基（含Amp）震蕩培養。參考方珍珍等［15］原核表達載體的誘導方法，當菌液OD600為0.6左右時以1.0 mmol/L IPTG 37℃誘導4 h，取1 mL菌液離心棄上清，沉淀用100 μL PBS重懸，加入25 μL上樣緩沖液煮沸10 min，SDS-PAGE電泳；鑒定目的蛋白的表達情況。

1.2.8 目的融合蛋白的分離純化及Western blotting鑒定 將100 mL經IPTG誘導后的菌液6 000 r/min離心10 min，棄上清，用50 mL PBS重懸菌體；然后對其超聲波破碎（750 W工作9 s，間歇9 s），12 000 r/min離心20 min，取上清；將上清過ProteinIsoTMNi-NTA Resin（全式金生物技術有限公司）純化目的融合蛋白；將收集的洗脫液轉入透析袋內，于PBS中4℃透析過夜；最后參照潘秋麗等［16］的方法將透析產物進行SDS-PAGE凝膠電泳檢測。

參照張家林等［17］的Western blotting方法，將純化的融合蛋白經SDS-PAGE，100 mA下2 h轉印至NC膜上。然后將NC膜置于封閉液中浸泡30 min，加入His-tag抗體（天根生化科技有限公司）孵育1 h，加入羊抗鼠IgG-HRP（天根生化科技有限公司）孵育30 min。以上各步驟之間用PBS緩沖液清洗3次，每次10 min。加入顯色液顯色（約10 min），至目標條帶出現后用超純水清洗終止顯色。

2 結果

2.1 RNA提取結果

提取得到紅鰭東方鲀腎臟總RNA后，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，見圖1?？俁NA 28S RNA和18S RNA條帶清晰，經紫外可見分光光度計檢測，總RNA滿足實驗要求。

圖1 紅鰭東方鲀腎臟總RNA

2.2 3'RACE擴增結果

巢式PCR產物經1%瓊脂糖電泳（圖2），得到了3條清晰條帶，大小約為1 000 bp、600 bp和400 bp，其中400 bp左右的條帶與預期大小不符，將1 000 bp和600 bp左右的兩條帶分別切膠回收、克隆與測序，600 bp左右的條帶與已知序列可拼接上，長度為581 bp。

2.3 紅鰭東方鲀IRF2基因的序列分析

將3' RACE擴增序列與已知部分序列（ GenBank注冊號：XM-003978691.1）進行拼接得到IRF2的全長cDNA。該基因的cDNA為1 552 bp，其中5'非編碼區為187 bp，3'非編碼區為429 bp（包含24 bp的Poly A尾），編碼區共936 bp，編碼311個氨基酸，見圖3。已將克隆的紅鰭東方鲀IRF2的cDNA序列遞交到GenBank數據庫，序列注冊號為：KF853391。對應的IRF2編碼蛋白（GenBank注冊號為：AHI85770）的分子量為35.5 kD，等電點為6.56。信號肽預測結果顯示無信號肽。

采用GOR在線工具分析TrIRF2氨基酸序列的蛋白二級結構（圖4），主要由無規則卷曲、α-螺旋和β折疊3種二級結構原件組成，其中無規則卷曲所占的比例最高，為56.91%（177個氨基酸），延伸鏈（反平行的折疊形態）占30.87%（96個氨基酸），α-螺旋最少，僅占12.22%（38個氨基酸）。

通過Blast 比對發現所獲得的紅鰭東方鲀IRF2氨基酸序列與其他物種IRF2氨基酸序列有較高相似性（表2），其中與鱖魚的相似度最高，達到79%，與烏鱧、斜帶石斑魚等的相似性也均在60%以上。采用Neighborhood-Joining 法構建進化樹，結果（圖5）顯示紅鰭東方鲀IRF2與鮸魚IRF2聚為一支，說明二者親緣關系最近。

2.4 紅鰭東方鲀IRF2基因原核表達載體pET32a（+）-IRF2的鑒定

對重組質粒pET32a（+）-IRF2進行雙酶切鑒定，結果（圖6）顯示，酶切片段長度為957 bp，與預期結果一致，表明成功構建了pET32a（+）-IRF2原核表達載體。將含有目的基因的ORF序列片段的重組質粒進行測序，測序分析表明，IRF2基因已正確連接到pET32a（+）。

2.5 紅鰭東方鲀IRF2基因在大腸桿菌BL21（DE3）中的誘導表達

與pET32a（+）空載相比，重組質粒pET32a（+）-IRF2在BL21（DE3）中表達的蛋白圖譜明顯多出一條特異的誘導表達條帶（圖7），大小在53.8 kD左右，說明在BL21（DE3）中表達出IRF2融合蛋白。另外，在未誘導的BL21（DE3）菌株里也有少量目的蛋白的表達，這可能是由于pET表達系統中存在目的蛋白的本底表達造成的。除去融合標簽蛋白，可推算出實際誘導表達的紅鰭東方鲀IRF2蛋白的分子量為35.5 kD，與理論值一致。

2.6 融合蛋白的純化和Western blot分析結果

利用重組蛋白內含有的His標簽，對目的融合蛋白進行純化，純化后的蛋白經透析過夜后，進行SDS-PAGE凝膠電泳檢測，所得條帶比預期目的條帶（53.8 kD）稍微偏高（圖8），這可能是由于His標簽中的堿性氨基酸導致蛋白在電泳過程中移動較慢產生的誤差。

圖4 紅鰭東方鲀IRF2的二級結構預測

表2 部分物種與紅鰭東方鲀IRF2氨基酸序列的相似性

圖 5 紅鰭東方鲀IRF2系統進化樹

圖6 重組質粒pET32a（+）-IRF2的雙酶切鑒定

將純化得到的的IRF2融合蛋白轉印到NC膜上經過與抗體發生特異性反應，得到一條與預期的融合蛋白大小相符的特異條帶（圖9），由此可推斷已成功表達出紅鰭東方鲀IRF2蛋白。

圖7 表達蛋白的SDS-PAGE分析

圖8 純化的IRF2融合蛋白的SDS-PAGE分析

圖9 Western blot 分析結果

3 討論

本研究克隆得到的紅鰭東方鲀IRF2全長cDNA為1 552 bp，其編碼區共936 bp，編碼311個氨基酸，與鱖魚［10］IRF2（編碼299個氨基酸）的相似度最高，達79%。而虹鱒魚［11］IRF2的ORF長1 035 bp，編碼344個氨基酸。大西洋鮭［12］IRF2氨基酸長度為343個氨基酸，含有DBD和IAD2兩個結構域。經過多重序列比對分析發現，紅鰭東方鲀IRF2與其他物種一樣，在其N末端具有一個DNA結合域（DBD）和一個IRF結合域2（IAD2）；在其C末端具有一個轉錄抑制域（TRD），這3個區域非常保守，這與陳曉玲等［18］克隆的褐牙鲆IRF2的序列特征一致。

大腸桿菌因其遺傳背景清楚、表達量高和價格低廉等優點，現已有多種以大腸桿菌為表達系統的重組蛋白應用于生產。有關IRFs的體外重組表達，崔鵬飛等［19］將雞IRF7基因與pET30a連接，在BL21（DE3）中融合表達該蛋白，并將純化的重組蛋白chIRF7免疫小鼠，制備出鼠抗chIRF7蛋白多克隆抗體。尹經逵等［20］克隆了斜帶石斑魚Epinephelus coioides的IRF1基因，并通過原核表達的方法得到了以可溶性蛋白和包涵體兩種形式存在的重組蛋白。張躍等［21］構建了牙鲆Paralichthys olivaceus IRF的表達載體pBVfIRF22，在大腸桿菌中誘導表達后得到一條分子量約12 kD的特異蛋白。本研究在克隆到紅鰭東方鲀IRF2基因并對其進行生物信息學分析的基礎上，進行了紅鰭東方鲀IRF2基因的重組表達。誘導表達的重組蛋白以可溶性形式存在，避免了對蛋白的變性、復性，便于今后對蛋白活性的研究。在進行SDS-PAGE凝膠電泳檢測時發現目的條帶條帶比預期大小稍微偏高，這可能是由于His標簽中的堿性氨基酸導致蛋白在電泳過程中移動較慢產生的誤差［22］。采用His標簽抗體對誘導表達的蛋白進行的Western blotting檢測表明重組載體按照正確的翻譯框架翻譯并表達出His標簽和目的蛋白，進一步證明了目的蛋白的準確性。

4 結論

本研究克隆了紅鰭東方鲀干擾素調節因子2（IRF2）基因，編碼區全長為936 bp，共編碼311個氨基酸。構建的重組表達載體pET32a（+）-IRF2經轉化和誘導后在大腸桿菌BL21中得以表達。Western blotting分析證明，利用Ni柱分離和純化得到的融合蛋白即為重組的紅鰭東方鲀IRF2。

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（責任編輯 李楠）

Cloning and Prokaryotic Expression of Interferon Regulatory Factor 2 from Takifugu rubripes

Interferon Regulatory Factor（IRF）is a transcription factor with multifunctions. The full length cDNA of Takifugu rubripes interferon regulatory factor 2（IRF2）was cloned by RT-PCR and rapid amplification of cDNA ends（RACE）. The full-length cDNA of the gene was 1 552 bp，including a 187 bp 5' non-coding region，a 429 bp 3' non-coding region，and 936 bp coding region，and it encoded 311 amino acids. The recombinant pET32a（+）-IRF2 was constructed by ligating code sequence of IRF2 with prokaryotic expression vector pET32a（+）. Then，the recombinant genetic engineering bacteria with expressed IRF2 were obtained by transforming pET32a（+）-IRF2 into competent cell Escherichia coli BL21（DE3）. pET32a（+）-IRF2 was expressed in BL21 under the induction of IPTG. The results from the detection of the purified products by Western blotting showed that the expression of the IRF2 gene in E. coli was high，and the target protein was accurate.

Takifugu rubripes；interferon regulatory factor 2；rapid amplification of cDNA end；prokaryotic expression

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.05.014

2015-05-25

國家海洋公益性行業科研專項經費項目（201405003-2），大連市科技計劃項目（2014B11NC091）

孫賽紅，女，碩士，E-mail：sun.saihong@163.com

王秀利，男，博士，教授，研究方向：海洋動物功能基因；E-mail：xiuliwang417@sina.com

SUN Sai-hong1，2MA Pu2SUN He2KONG De-rong2Li Hui2QIU Xue-mei2JIANG Zhi-qiang1LIU Hai-ying3LIU Yang2LIU Sheng-cong4MENG Xue-song4WANG Xiu-li1，2

（1. Key Laboratory of Mariculture ＆Stock Enhancement in North China’s Sea，Ministry of Agriculture，Dalian Ocean University，Dalian 116023；2. College of Fisheries and Life Science，Dalian Ocean University，Dalian 116023；3.College of Marine Science and Environment，Dalian Ocean University，Dalian 116023；4. Dalian Tianzheng Industrial Co. Ltd.，Dalian 116011）