姜黃素對膿毒癥大鼠小腸功能保護作用的研究*

張良　王永春　朱文娟（浙江省湖州市第一人民醫院，浙江　湖州　313000）

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姜黃素對膿毒癥大鼠小腸功能保護作用的研究*

張良王永春朱文娟
（浙江省湖州市第一人民醫院，浙江湖州313000）

【摘要】目的探索姜黃素對膿毒癥大鼠小腸功能的保護作用及其機制。方法30只SD大鼠，按照隨機數字表法分為假手術組、膿毒癥組和姜黃素治療組，每組10只。采用改良盲腸結扎穿孔方法建立大鼠膿毒癥模型，假手術組除不結扎刺穿盲腸外，其余操作同膿毒癥組，姜黃素治療組模型建立后1 h腹腔注射姜黃素（二甲亞砜作為溶劑），假手術組及膿毒癥組注射同樣劑量的二甲亞砜。于手術后24 h、48 h處死大鼠，測定小腸黏膜組織的含水量；小腸黏膜組織中三磷酸腺苷（ATP）、二磷酸腺苷（ADP）、單磷酸腺苷（AMP）含量；觀察并比較各組小腸黏膜上皮組織病理改變。結果姜黃素治療組的小腸組織水腫程度較假手術組明顯升高（P＜0.05），較膿毒癥組明顯降低（P＜0.05）；姜黃素治療組的小腸黏膜ATP、ADP含量較膿毒癥組均有明顯升高（P＜0.05）。AMP含量明顯下降（P＜0.05）；小腸黏膜上皮組織病理學提示姜黃素治療組的組織損傷明顯輕于膿毒癥組。結論姜黃素對膿毒癥大鼠小腸組織水腫和能量代謝的抑制狀態具有一定程度的改善作用。

【關鍵詞】姜黃素膿毒癥大鼠小腸功能保護

膿毒癥發病率高，病死率高，病死率可達28%～50%，目前認為膿毒癥是由感染引發的全身炎癥反應綜合征（SIRS），通常認為是由機體過度炎癥反應或炎癥失控所致［1］。近年認識到胃腸道在膿毒癥中的重要性，小腸作為膿毒癥的始動器官［2-3］，更是成為新的治療靶點。膿毒癥時最常累及腸道，造成腸黏膜上皮水腫，上皮細胞膜及細胞間連接斷裂，細胞壞死，上皮從絨毛頂端開始脫落，甚至黏膜全層脫落而形成潰瘍，造成腸道通透性增加、腸屏障功能受損，腸道細菌及其毒素得以吸收進入循環系統而發生細菌移位，使SIRS加劇、失控，嚴重時誘發多器官功能障礙綜合征（MODS），甚至危及患者生命［4］。有研究表明，小腸黏膜對于缺血再灌注、能量代謝障礙尤其易致屏障功能損傷進而通透性增加，細菌過度生長且發生腸道易位、毒素產生增多，從而加重膿毒癥，繼而又進一步加重小腸黏膜的損傷，形成惡性循環。近年發現，姜黃素能起到對組織器官的保護作用，但具體機制尚不明確。本實驗以膿毒癥大鼠為研究對象，觀察大鼠不同時間點的腸組織含水量、小腸黏膜三磷酸腺苷（ATP）、二磷酸腺苷（ADP）、單磷酸腺苷（AMP）含量表達變化，探討姜黃素對膿毒癥大鼠腹腔感染所致腸損傷的保護作用?，F報告如下。

1　材料與方法

1.1動物及分組清潔健康的SD雄性大鼠30只，鼠齡3～4個月，體質量（300±50）g，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供。隨機分為假手術組、膿毒癥組和姜黃素治療組，每組均為10只。

1.2試劑與儀器姜黃素（curcumin）購自美國Sigma公司（批號C7727）；二甲基肼（DMH）（Sigma，D161608），HPLC液相色譜儀購自美國Waters公司；PM－10AD型光學顯微鏡，Olympus Optical Co．LTD產品；JA1203型電子天平，上海精科天平廠產品。

1.3造模方法采用盲腸結扎穿孔（CLP）方法建立大鼠膿毒癥模型。以乙醚間斷吸入法麻醉大鼠；待完全麻醉后，仰臥位固定大鼠，頸部皮膚常規備皮、消毒；于頸外側下頜至心臟的中點作1個約1 cm的橫切口，鈍性分離皮下組織，暴露右側頸外靜脈；沿血管向近心端方向插入留置針約1 cm，將導管從留置針管與頸外靜脈夾孔中把心導管慢慢置入達右心房，結扎固定，導管末端經皮下隧道從頸后中央引出并固定于皮膚；管內注射125 U/mL肝素0．5 mL抗凝，插入置管針封閉導管。然后沿腹白線中段作3 cm切口，探查取出盲腸；用12號針穿刺4個孔，擠出少許糞便于腹腔內，回納盲腸，分層縫合腹腔。假手術組僅在頸部及腹部各做1個切口，不施行CLP。膿毒癥組頸部僅切開，而不放置管針，其余同姜黃素治療組。手術過程中保持大鼠肛溫（37.0±0.5）℃，保持室溫（26.0±1.0）℃。

1.4給藥方法在造模成功后1 h分別給姜黃素治療組按100 mg/kg腹腔注射姜黃素（二甲亞砜作為溶劑），假手術組及膿毒癥組注射同樣劑量的二甲亞砜。1.5觀測指標手術后24 h、48 h每組各剖殺5只大鼠。1）腸組織含水量。稱取腸組織濕質量，然后放入恒溫箱（100.0±2.0）℃干燥，24 h后取出，稱取干質量，計算腸組織含水量。計算公式：腸組織含水量=（腸濕質量－腸干質量）/腸濕質量×100%，以%表示。2）小腸黏膜組織中ATP、ADP、AMP含量測定。距回盲部20 cm處取回腸組織0．5 g，置液氮保存，用高效液相色譜法測定ATP、ADP、AMP含量。3）病理學觀察。取小腸組織常規制作病理切片，蘇木精-伊紅（HE）染色，在光鏡下觀察并照相。小腸組織學結構變化程度判定采用Ozkan標準評分：正常小腸黏膜；小腸黏膜水腫變性，上皮細胞表面與固有層分離；上皮細胞壞死，局限在絨毛尖端；絨毛完全壞死；黏膜全層壞死。

1.6統計學處理應用SPSS13．0統計軟件處理。計量資料以（±s）表示，組間比較采用t檢驗。P＜0．05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1各組大鼠腸組織含水量比較見表1。姜黃素治療組各時間點腸組織含水量與假手術組對比升高（P＜0.05），但比膿毒癥組各時間點大鼠腸組織含水量均降低（P＜0.05）。

表1　各組大鼠腸組織含水量比較（±s）

表1　各組大鼠腸組織含水量比較（±s）

與假手術組相同時間點比較，*P＜0.05；與膿毒癥組相同時間點比較，△P＜0.05。下同。

組別　時間　含水量（%）假手術組　造模結束24 h　71.56±1.24 （n＝5）　造模結束48 h　70.86±1.31膿毒癥組　造模結束24 h　81.36±1.47*（n＝5）　造模結束48 h　82.54±1.84姜黃素治療組　造模結束24 h　78.63±1.39*（n＝5）　造模結束48 h　79.54±1.42△

2.2各時間點小腸黏膜組織中ATP、ADP、AMP含量見表2。小腸黏膜組織中ATP、ADP、AMP含量與假手術組比較，膿毒癥組和姜黃素治療組大鼠小腸黏膜組織中ATP、ADP含量明顯降低（P＜0.05），AMP含量升高（P＜0.05）；姜黃素治療組大鼠小腸黏膜組織中ATP、ADP含量又較膿毒癥組明顯升高（P＜0.05），AMP含量明顯降低（P＜0.05）。

表2　各時間點小腸黏膜組織中ATP、ADP、AMP含量比較（μmoL/g，±s）

表2　各時間點小腸黏膜組織中ATP、ADP、AMP含量比較（μmoL/g，±s）

組別　時間　AMP假手術組　造模結束24 h　1.61±0.21 （n＝10）　造模結束48 h　1.60±0.22膿毒癥組　造模結束24 h　2.56±0.24*ATP　ADP 6.30±0.54　3.90±0.32 6.27±0.60　3.87±0.34 3.66±1.24*2.56±0.26*（n＝10）　造模結束48 h　3.26±0.31*2.46±1.24*2.04±0.24*姜黃素治療組　造模結束24 h　4.57±1.24*3.26±0.27*2.15±0.18*（n＝10）　造模結束48 h　3.86±1.24*△2.58±0.24*△2.82±0.17*△

2.3大鼠小腸組織形態改變見圖1～圖3。在光鏡下檢查，膿毒癥組和姜黃素組均有不同程度的小腸黏膜水腫、白細胞浸潤、出血和上皮細胞壞死脫落，其程度隨時間而加重。

圖1　假手術組大鼠小腸黏膜（HE，×200）

圖2　姜黃素組48 h小腸黏膜水腫白細胞浸潤，但較膿毒血癥組減輕（HE，×200）

圖3　膿毒癥組48 h小腸黏膜壞死白細胞浸潤（HE，×200）

3　討論

膿毒癥是指由感染引起的SIRS，它是由于機體對病原微生物及其產物產生的致炎性刺激失控，導致過度炎性反應引起MODS，膿毒癥是急診危重癥患者死亡原因之一。膿毒癥時腸道功能受損的可能機制為：1）應激狀態時全身炎癥反應可導致循環系統功能紊亂，腸道血流灌注相對減少，腸道缺血、缺氧，超過代償極限時可出現腸黏膜病理性氧代謝，隨之出現厭氧代謝、黏膜酸中毒，腸道黏膜屏障受損；2）嚴重膿毒癥、MODS時應激或全身炎癥反應造成分解代謝增加、負氮平衡，由于禁食、全胃腸外營養（TPN）可使腸道缺乏進行自身修復所必需的谷氨酰胺，導致腸黏膜細胞數量減少，進一步加重腸道屏障功能受損；3）在膿毒癥時，特別是膽道、腸道感染后，進入腸道的細菌和內毒素刺激腸壁內的大量淋巴細胞、巨噬細胞及其他炎性細胞分泌大量細胞因子及炎癥介質，炎癥介質導致免疫細胞反應失控損傷腸道屏障功能。炎癥介質種類繁多，相互之間作用復雜，主要的炎癥介質有TNF-α、IL-6、IL-8等，在這些炎性介質中，TNF-α是一種非常重要的炎癥因子和免疫調節因子，在炎癥瀑布反應中起核心作用，是導致炎性介質級聯反應的始發因子；IL-6急性期損傷的誘導物，是炎性反應的促發劑，是細胞因子釋放第二高潮期中的主要因子；IL-8參與細胞因子網絡的級聯反應。炎癥啟動后，在眾多炎性介質中繼發產生，眾炎性介質多相互作用加重瀑布效應。研究表明，TNF-α產生最早，IL-6較TNF-α延遲，約8 h近高峰，而IL-8是過渡到MODS的危險指標。TNF-α由單核巨噬細胞和活化的T淋巴細胞分泌，是引起腸道黏膜損傷重要因子之一，能促進血小板活化因子釋放、生成白三烯和氧自由基、誘導一氧化氮合成，從而產生大量一氧化氮引起細胞損傷，導致腸黏膜水腫、充血、甚至壞死，細胞間緊密連接受損，直接造成腸道黏膜損傷，小腸選擇性吸收及防御屏障功能障礙、腸道菌群失調、腸道內微生態屏障紊亂，而TNF-α又能刺激單核和巨噬細胞分泌IL-6、IL-8、CRP等炎性介質，以及刺激中性粒細胞脫顆粒，釋放各種蛋白酶和其他水解酶及氧自由基、粘附因子、可溶性免疫反應抑制因子等，對機體造成炎性損害進一步加重，最終導致小腸、腦、心、肝、腎等MODS，甚至死亡。

姜黃素具有抗炎、抗氧化、抗凝、降血脂及抗動脈粥樣硬化、抗腫瘤等多方面的作用［5-11］。Memist等［12］研究結果認為膿毒癥大鼠經姜黃素預處理后，其肝、腎及小腸組織變性壞死程度較未處理組明顯減輕，證實姜黃素對膿毒癥臟器有保護作用。相關研究［13-14］證實姜黃素能夠顯著降低細菌膿毒癥小鼠血清AST、ALT、TNF-α和一氧化氮含量，提示姜黃素具有明顯的肝臟保護作用，提高存活率。梁小仲等［15］研究證實嚴重腹腔感染可明顯上調膿毒癥大鼠肺組織高遷移率族蛋白B1（HMGB1）mRNA和HMGB1蛋白表達水平。姜黃素可能通過抑制肺組織HMGB1，下調膿毒癥大鼠肺組織髓過氧化物酶（MPO）活性，減輕肺組織中性粒細胞浸潤，減緩脂多糖誘導的肺損傷程度，提高膿毒癥大鼠的生存率。姜云龍等［16］在最近的研究中發現姜黃素可明顯減輕膿毒癥狀態下脾臟淋巴細胞凋亡，且這一作用可能是通過拮抗線粒體凋亡途徑實現的，同時他認為姜黃素的強效抗氧化特性，可以使過多的自由基直接作用于細胞導致細胞死亡，而姜黃素可通過清除活性氧自由基，抑制氧自由基產生進而影響胞內氧化還原狀態，改善機體的免疫功［17-19］，從而起到對細胞的保護作用。

小腸黏膜組織中ATP、ADP、AMP含量反應了腸黏膜的活性，此次研究中，發現姜黃素通過提高腸黏膜中ATP、ADP含量，降低AMP含量，對腸道起到保護作用，而劉蓮等［20］研究發現姜黃素具有明顯促進動物胃腸運動作用，但具體的通道目前仍不明確，需進一步研究。

本次研究表明，姜黃素能有效減輕重癥膿毒癥大鼠的病情，對膿毒癥大鼠腸道功能起到保護作用，但本實驗中筆者也發現單純使用姜黃素并不能完全控制膿毒癥大鼠腸道功能的損害，這進一步提示我們膿毒癥大鼠腸道功能的損傷是一個復雜的過程，需要進一步深入的研究。在當前對膿毒癥發生機制尚不完全清晰、難于提出有效治療建議的情況下，應用姜黃素處理膿毒癥大鼠，可以減輕大鼠小腸黏膜組織的水腫程度，改善腸道能量代謝，從而對膿毒癥時腸黏膜功能損害等起到一定的抑制作用，保護腸道的屏障功能，從而改善膿毒癥預后，為膿毒癥的治療提供新的思路。

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The Study on the Protective Effect of Curcumin on Small Intestinal Function in Septic Rats

ZHANG Lang，WANG Yongchun，ZHU Wenjuan.The Department of General Surgery of the First People′S Hospital of Huzhou，Zhejiang，Huzhou 313000，China.

【Abstract】Objective：To study the protective effect and mechanism of curcumin on small intestinal function in septic rats.Methods：30 SD rats were randomly divided into the sham group，sepsis group，and curcumin group.Septic models were induced with cecal ligation and puncture（CLP）.In the sham group，the abdomen was opened without CLP.In curcumin group，curcumin was intravenously injected curcumin in abdomina after CLP.Five rats of the each group were sacrificed at 24 h and 48 h respectively after CLP.Moisture capacity levels of ADP，ATP and AMP of the small intestinal mucosa were measured.Pathological changes of small intestinal mucosa were observed.Results：The levels of tissue edema in the small intestinal mucosa of curcumin group were significantly higher than those of the sham group（P＜0.05），while significantly lower than the sepsis group（P＜0.05）.Compared with the septic group，the levels of ATP and ADP in the small intestinal mucosa of curcumin group were significantly higher（P＜0.05）；and the level of AMP of the small intestinal mucosa of curcumin group was much lower（P＜0.05）；severer pathological changes were found in the sepsis group than that in curcumin group.Conclusion：In some degree，curcumin may improve edema of small intestine and Inhibition of energy metabolism in rats with sepsis.

【Key words】Curcumin；Sepsis；Rats；Small intestinal function；Protective

中圖分類號：R285.5

文獻標志碼：A

文章編號：1004-745X（2016）04-0627-04

doi：10.3969/j.issn.1004-745X.2016.04.018

*基金項目：浙江省湖州市科技局項目（2013GY13）

收稿日期（2015-12-02）