慢病毒轉染熒光蛋白EYFP-H148Q/I152L細胞模型的構建

肖　遠，許　榮，李秀敏，劉　艷，黎　星，霍　聰，王曉明

(第四軍醫大學第一附屬醫院老年病科，陜西西安　710032)

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◇基礎研究◇

慢病毒轉染熒光蛋白EYFP-H148Q/I152L細胞模型的構建

肖遠，許榮，李秀敏，劉艷，黎星，霍聰，王曉明

(第四軍醫大學第一附屬醫院老年病科，陜西西安710032)

摘要：目的構建穩定表達EYFP熒光蛋白的HeLa細胞作為陰離子(鹵素)通道阻斷劑篩選的細胞模型，為高通量篩選陰離子(鹵素)通道阻斷劑提供條件。方法通過基因重組技術構建表達YFP突變蛋白(EYFP-H148Q/I152L)和puromycin抗性的慢病毒載體。將慢病毒載體和包裝質?；旌衔镛D染包裝細胞293T細胞產生慢病毒顆粒，感染HeLa細胞，進一步利用抗性基因對細胞進行puromycin篩選，純化細胞并擴增至所需細胞量。采用實時定量PCR和Western blot方法檢測目的基因EYFP-H148Q/I152L的表達效率。并驗證EYFP-HeLa穩轉細胞系作為鹵族離子通道阻斷劑篩選模型的活性。結果基因測序驗證了目的基因成功插入慢病毒載體。RT-PCR和Western blot檢測結果顯示，目的基因在HeLa細胞中實現了過表達。熒光顯微鏡下觀察到EYFP-HeLa穩轉細胞株能夠表達特有的EYFP黃色熒光，效率接近100%。碘離子(I-)(低滲)溶液刺激細胞陰離子(鹵素)通道的開放，內流的I-能夠使黃色熒光淬滅。結論構建的EYFP-HeLa細胞系能夠穩定表達EYFP黃色熒光蛋白，對內流入細胞的I-敏感，可以作為理想的陰離子(鹵素)通道阻斷劑的篩選模型。

關鍵詞：陰離子；鹵素；熒光蛋白；陰離子通道阻斷劑；篩選模型；基因重組

氯、碘、溴等陰離子(鹵素)是維持人體細胞內環境及發揮正常功能的重要成分，細胞質膜對水及各種離子的動態平衡，依賴于細胞膜上各種通道蛋白及轉換器的作用。特別是在各種病理性損傷過程中，如發生細胞腫脹等內外液滲透壓的改變時，需通過水及各種離子的轉運機制進行調節[1]，例如，在腸道分泌、神經元電位、維持細胞容積等內環境的穩態中起至關重要的作用[2]。很多疾病的發生都與其調節過程出現問題密切相關。大量研究發現，離子通道阻斷劑具有重要的干預作用，特別是陰離子通道阻斷劑DIDS等可以有效抑制缺血再灌注心肌細胞的損傷[3-4]。而尋找一種具有高效的天然化合物篩查技術尤為迫切而重要。黃色熒光蛋白YFP的突變體因其具有能被碘離子(I-)淬滅的特性，被廣泛用作監測信號，反映細胞的生理活動[5]，使得動態、精確地監測陰離子(鹵素)生理活動成為可能，對于監測細胞生理反應有重要意義。本研究旨在應用基因重組技術構建搭載YFP突變蛋白(EYFP-H148Q/I152L)基因的慢病毒載體，轉染HeLa細胞，擬建立穩定的細胞模型作為陰離子(鹵素)通道阻斷劑的篩查模型，為高通量篩選候選化合物提供實驗模型。

1材料與方法

1.1材料EYFP-H148Q/I152L-GFP質粒為吉林大學所贈，慢病毒載體為GV341、pHelper 1.0和pHelper2.0質粒組成，購自上海吉凱基因化學技術有限公司，大腸桿菌DH5α、293T細胞系及HeLa細胞系均為本實驗室保存。限制性內切酶AgeⅠ、NheⅠ購自NEB公司，DNA Marker、Taq酶購自Fermatas公司，膠回收試劑盒購自北京天根公司，質粒提取試劑盒購自Promega公司，引物合成及DNA測序均由捷瑞生物完成，熒光定量PCR試劑購自TaKaRa公司，FLAG抗體購自Sigma公司。胎牛血清(FBS)、DMEM、胰酶均購自GIBCO公司，DMSO購自Sigma公司。Opti-MEM、Lipofectamine 2000、Trizol購自Invitrogen公司，其他化學試劑為國產分析純。

1.2目的片段的擴增以吉林大學所贈EYFP-H148Q/I152L-GFP質粒為模板擴增。上游引物：CCAACTTTGTGCCAACCGGTCGCCACCATGGC-

TGAGCAAGGGCGAGGAG，下游引物：AATGCA-

ACTCTGAGCTAGCTCTTGTACAGCTCGTCCA-

TG(斜體部分為酶切位點)，擴增目的片段為762 bp。10 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產物，并按照膠回收試劑盒說明書回收目的片段。

1.3重組慢病毒載體的構建與鑒定將慢病毒載體GV341和回收的目的基因片段分別用限制性內切酶AgeⅠ和NheⅠ進行雙酶切后，電泳回收酶切產物，之后使兩種酶切產物在連接酶的作用下，16 ℃連接過夜。將連接產物轉化DH5α感受態細胞，挑取單克隆的一半菌落進行PCR鑒定后送檢測序。檢測時的上游引物：GGGTCAATAATTTTCAGTG，下游引物：CCTTATAGTCCTTATCATCGTC，陽性目的片段為930 bp。測序正確后擴增選定菌落并大量提取質粒保存備用。

1.4病毒包裝與滴度測定轉染前24 h將293T細胞用胰酶消化后重新接種于15 cm細胞培養皿中，細胞密度為9×107細胞/皿。于37 ℃、50 mL/L CO2條件下培養約24 h至細胞融合達70%～80%時轉染。轉染前2 h更換為無血清培養基，用Opti-MEM稀釋待轉混合質粒(20 μg pGV341-YFP、15 μg pHelper 1.0和10 μg pHelper 2.0)，使總體積為2.5 mL，室溫下溫育5 min。同時在另一管中將100 μL Lipofectamine 2000用2.4 mL Opti-MEM稀釋并置室溫溫育5 min。將上述2管溶液混合后，室溫溫育20 min后加入293T細胞中，混勻，置于37 ℃、50 mL/L CO2細胞培養箱中培養。轉染8 h后換為新鮮培養液繼續培養。48 h后，熒光顯微鏡下可見熒光蛋白表達，用0.45 μm濾器過濾收集上清液，即為病毒液。

將該病毒液進行10倍連續梯度稀釋后，感染293T細胞，感染后48 h加入5 μg/mL puromycin，繼續培養2 d 后，熒光顯微鏡觀察計數EYFP陽性細胞，確定病毒滴度(即帶有熒光的細胞數與病毒原液量之比)。

1.5病毒載體感染和穩轉細胞系的構建

1.5.1病毒感染生長狀態良好處于對數生長期的目的細胞，感染前1 d將目的細胞(細胞數約為5×104)分入6孔板，37 ℃、50 mL/L CO2培養箱培養，待細胞融合度達到約30%，根據細胞感染復數值(multiplicity of infection, MOI)，加入適宜量的病毒感染。12 h后觀察細胞狀態：如果沒有明顯的細胞毒性作用，繼續培養24 h后更換培養基；如果有明顯的細胞毒性作用，立即更換培養基，當天按實驗設計的組別加入慢病毒顆粒進行目的細胞的感染實驗。感染3 d后，熒光顯微鏡下觀察EYFP表達情況，熒光率達80%以上用于篩選構建穩轉細胞系。感染效率低于80%的實驗組，重新進行感染實驗。

1.5.2穩轉細胞系的構建將待篩選細胞接種于6孔板中至融合度約80%，加入puromycin進行空細胞致死最低濃度篩選，置0、0.5、1、2.5、5、10 μg/mL進行篩選，獲取藥物處理48 h細胞全部死亡的最低藥物濃度。

將細胞接種在6孔板中，貼壁后進行慢病毒感染，感染第4天，加入puromycin藥物篩選。對篩選后的細胞即時觀察熒光效率，判斷是否獲得感染效率接近100%的細胞。將細胞消化后，接種于96孔板中，保證1個/孔，接種后第2天觀察孔板，標記出具有單個細胞的孔，同時加入puromycin藥物。繼續培養標記孔的細胞4～5 d，待孔板中細胞長至細胞克隆時，挑取多組單個細胞克隆孔板中的細胞進行擴大培養，至48孔板，再逐級放大，中間取12孔板80%融合度的細胞，用Trizol提取總RNA，6孔板的細胞提取蛋白，分別進行RT-PCR和Western blot檢測，選擇檢測合格的單克隆細胞擴增培養至需要的細胞量后凍存。

1.5.3穩轉細胞系的RT-PCR檢測將提取到的總RNA利用反轉錄試劑盒反轉錄得到cDNA，進行定量PCR檢測，以GAPDH為內參。根據Promega公司的M-MLV試劑盒說明書進行操作，首先將1 μL OligodT和2.0 μg總RNA加入無RNA酶H2O中，補H2O至總體積為10 μL，70 ℃處理后置冰浴中使模板和OligodT退火，隨后在該管中繼續加入5×RT buffer 4 μL、10 mol/L dNTPs 2 μL、RNA酶抑制劑16 Units、RNA酶200 Units，補水至20 μL，反轉錄得到cDNA。定量PCR反應體系為20 μL，SYBRpremixexTaq10 μL，引物、cDNA各1 μL，補水至20 μL，按照兩步法進行定量PCR，程序為95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃延伸30 s，共45個循環。通過2-ΔΔCt法計算穩轉細胞株與陰性對照細胞中YFP的相對表達量，定量PCR所需引物見表1。

表1實時定量PCR所需引物

Tab.1Primers needed for RT-PCR

基因引物序列GAPDHF:TGACTTCAACAGCGACACCCAR:CACCCTGTTGCTGTAGCCAAAYFPF:CCGACAAGCAGAAGAACGGR:GAACTCCAGCAGGACCATG

1.5.4穩轉細胞系的Western blot檢測將6孔板中收集到的穩轉HeLa細胞經裂解收取蛋白，以GAPDH為內參，重組慢病毒載體中的FLAG為待檢標簽蛋白，分子質量為29 ku，以48 ku的SURVIVIN-3FLAG-GFP為陽性對照，進行120 g/L聚丙烯酰氨凝膠電泳，蛋白上樣量20 μL，半干轉印法將蛋白轉到PVDF膜上，用含50 g/L脫脂奶粉的TBST室溫封閉2 h，TBST洗膜3次，每次5 min后再加入鼠源FLAG抗體(1∶2 000)4 ℃過夜，TBST洗膜3次后加入HRP標記的山羊抗鼠IgG二抗(1∶2 000)室溫孵育1 h，洗膜后用ECL發光液顯色，X-膠片曝光顯影定影。以預染的蛋白Marker確定蛋白相對分子質量。

1.6EYFP-HeLa穩轉細胞系作為鹵族離子通道阻斷劑篩選模型的活性驗證EYFP-HeLa穩轉細胞系分2組，以等滲NaCl為對照，低滲NaI刺激陰離子(鹵素)，并對熒光強度進行動態檢測。

2結果

2.1慢病毒表達載體的構建與鑒定利用PCR方法從吉林大學所贈質粒模板中擴增得到約750 bp的特異性條帶(目的基因)，與762 bp的目的基因相符(圖1A)。挑取8個重組慢病毒表達載體單克隆進行菌液PCR鑒定，各菌落均檢測到930 bp的特異性條帶(圖1B)，與預期相符。并將3號菌液送檢測序。

圖1目的基因YFP的獲取及慢病毒載體的PCR鑒定

Fig.1 Cloning of YFP CDS sequence and identification oflentiviral vector GV341

A：質粒PCR結果。M：Marker；S：PCR擴增得到YFP基因條帶。B：PCR結果示重組慢病毒菌液YFP突變基因的表達。N：陰性對照ddH2O；N1：空載連續對照；P：陽性對照GAPDH；M：Marker；1～8：含YFP基因菌液1～8組。

2.2病毒滴度測定倍比稀釋后的病毒加puromycin繼續感染細胞2 d后，在熒光倒置顯微鏡下觀察EYFP陽性細胞的數量，計算所得病毒載體的病毒滴度為2E+8 TU/mL。

2.3穩轉HeLa細胞株的建立及RT-PCR和Western blot檢測結果

2.3.1穩轉HeLa細胞系中EYFP熒光效率穩轉HeLa細胞系中EYFP熒光陽性率接近100%(圖2)。

2.3.2穩轉HeLa細胞系的RT-PCR和Western blot檢測結果2-ΔΔCt法計算得出穩轉HeLa細胞組較未轉染陰性對照組中YFP mRNA表達水平提高了4 363.599倍；Western blot結果顯示，6孔板中的穩轉HeLa細胞蛋白樣品可檢測到標志重組慢病毒載體的大小為29 ku的目的條帶(圖3)。

圖2穩轉EYFP-HeLa細胞的熒光鑒定

Fig.2 The fluorescence detection of transfected EYFP-HeLa cell line (×200)

A：明場；B：熒光激發；C：A、B重合。

圖3EYFP基因的表達(A)及EYFP熒光蛋白(B)的鑒定結果

Fig.3 YFP expression of YFP-HeLa cell line detected by RT-PCR (A) and Western blot (B)

CON：對照組；SAMP：感染慢病毒載體的HeLa細胞。與CON組比較，*P<0.01；GAPDH：內參；P：陽性對照 SURVIVIN-3FLAG-GFP，48 ku；1～7：7組YFP-HeLa細胞，在1～3、5、6、7組檢測到標志重組慢病毒載體，大小為29 ku。

2.4EYFP-HeLa穩轉細胞系作為鹵族離子通道阻斷劑篩選模型的活性驗證EYFP-HeLa穩轉細胞系低滲NaI刺激陰離子(鹵素)通道開放，熒光淬滅，低滲NaI較等滲NaCl熒光讀值隨時間明顯下降(P<0.05。圖4)。

3討論

陰離子通道廣泛存在于哺乳動物的細胞膜上，其在維持組織細胞的內環境穩定，調節細胞的容積、細胞膜電位、細胞增殖、細胞周期及細胞凋亡中起著重要作用[6-9]。

課題組前期在staurosporine、缺血再灌注及衣霉素分別通過線粒體、受體及內質網應激等途徑構建的心肌細胞凋亡模型上，發現Cl-通道參與了細胞的凋亡過程，應用特異性阻斷劑DCPIB和非特異性阻斷劑DIDS能有效抑制細胞凋亡性死亡，特別是在體心臟中能夠減少梗死面積、改善心臟功能、抑制心律失常的發生，達到保護受損心臟的作用[10-15]。MIZOGUCHI等[16]也在大鼠心臟進行異體異位移植過程中證實了上述的心臟保護作用。上述證據證明，心肌細胞膜上陰離子通道對維護細胞膜穩定、減少細胞損傷具有重要的保護作用。

氯離子作為細胞內最主要的陰離子，其相關的通道阻斷劑也僅僅是作為工具藥應用于實驗室，能否在眾多化合物中尋找出具有氯離子阻斷作用的成分？如何實現在大量化合物中篩查出具有目的功能的化合物呢？本研究的主要目的是構建穩定成熟的離子通道阻斷劑的方法。

我國具有豐富的中草藥資源，隨著現代中藥研究的進展，許多重要天然中藥單體化合物從分子結構、藥理學及毒理學被清楚地闡明[17]。同時，已有多種單體化合物從傳統天然化合物中提取得到，并證實作為通道阻斷劑發揮著抗凋亡、抗缺血再灌注等心肌保護作用[18-20]。然而，目前常用于離子通道藥物篩選的方法如膜片鉗技術，由于操作較難，成本高、耗時、耗工，僅適用于少量化合物特異活性功能的證實，對于化合物的大批量初次篩選無法實現[21]。而高通量篩選技術的出現解決了這一難題，且我國豐富的傳統天然化合物庫也滿足該技術對樣本量的要求。在此基礎上，如何構建一種用于高通量篩選的低成本、操作便捷、信號檢測快速靈敏的實驗模型對于大批量化合物的篩選至關重要。

圖4 EYFP-HeLa細胞系對I-低滲的活性功能驗證Fig.4VerificationofactivityofEYFP-HeLacelllineonI-(lowpermeability)solutionA:NaIHypo刺激離子通道開放,I-內流熒光淬滅程度與NaCliso組比較的熒光強度結果;B:動態數據分析,兩組之間比較,P<0.05。

2012年，STOTZ等[22]報道熒光蛋白EYFP-H148Q/I152L可用于陰離子通道的研究，發現該突變的黃色熒光蛋白能夠在鹵素離子的刺激下發生淬滅反應，從而反映離子通道的開閉情況。該研究技術也在多個陰離子(鹵素離子)通道的研究中廣泛應用[2,5,23-24]，為我們利用基因重組技術構建EYFP-H148Q/I152L-HeLa細胞模型提供了重要的依據及方法。本研究通過基因測序驗證了目的基因成功插入慢病毒載體，應用RT-PCR和Western blot檢測目的基因在HeLa細胞中表達良好，熒光顯微鏡下穩轉細胞株EYFP黃色熒光效率接近100%，而I-低滲溶液刺激細胞陰離子通道開放后，內流的I-能夠使黃色熒光淬滅。結果顯示，構建的熒光蛋白EYFP-H148Q/I152L-HeLa細胞模型，通過檢測該細胞在低滲I-溶液刺激下發生熒光淬滅的特性，可用于大規模篩選抑制熒光淬滅的陰離子通道阻斷劑。

該模型構建方便，相關技術成熟；成本較低；檢測信號靈敏、動態、可視。通過檢測熒光信號使得便捷快速篩選天然化合物成為可能，對初篩結果的穩定性、可靠性具有重要意義，從模型上保證了初篩結果的可信。

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(編輯國榮)

收稿日期：2015-11-27修回日期：2016-02-19

基金項目：軍隊保健計劃課題(No.13BJZ34)及衛生部行業基金(No.201302008)資助

通訊作者：王曉明. E-mail: xmwang@fmmu.edu.cn

中圖分類號：R965.1

文獻標志碼：A

DOI:10.7652/jdyxb201604003

The cell model establishment through lentivirus transfecting fluorescent protein EYFP-H148Q/I152L

XIAO Yuan, XU Rong, LI Xiu-min, LIU Yan, LI Xing, HUO Cong, WANG Xiao-ming

(Department of Geriatrics, Xijing Hospital of Fourth Military Medical University, Xi’an 710032, China)

ABSTRACT:ObjectiveTo establish the HeLa cell line that can stably express EYFP fluorescent protein as the model for anion channel blocker (halide ion) screening, which lays the foundation for high throughput screening of anion channel blocker (halide ion). MethodsThrough gene recombination technology, a new lentivirus vector which can express mutant protein YFP (EYFP-H148Q/I152L) and puromycin resistance, was built. The mixture of lentivirus vector and packaging plasmid was transfected into 293T cells to produce lentivirus particles. After infection of HeLa cells by the lentivirus particles, puromycin was used to screen the cells as YFP-positive HeLa cell line. Then cell amplification was carried out after purification and efficiency of EYFP-H148Q/I152L was further detected by Real-time quantitative PCR (RT-PCR) and Western blot. We then verified the activity of EYFP-HeLa transfected cell line as a screening model of anion channel blocker. ResultsGene sequencing verified that EYFP-H148Q/I152L was successfully inserted into lentivirus vectors. RT-PCR and Western blot results showed that the target gene was overexpressed in HeLa cells. The specific yellow fluorescence of EYFP of HeLa cells could be observed under fluorescence microscope with the efficiency of nearly 100%. I- (low permeability) solution stimulated the opening of anion (halogen) channels, and the yellow fluorescence was quenched by I- flow into cells. ConclusionThe EYFP-HeLa cell line can stably express EYFP yellow fluorescent protein and is sensitive to the internal flow of I-. Therefore, it can be used as an ideal screening model of anion channel blocker (halide ion).

KEY WORDS:anion; halide ion; fluorescence protein; anion channel blocker; screening model; gene recombination

Supported by the Health Care Plan of the Army (No.13BJZ34) and the Industry Fund of Ministry of Health (No.201302008)

優先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20160608.0911.006.html(2016-06-08)