人工飼料對蘋果蠹蛾顆粒體病毒產量的影響

劉國鋒，樊江斌，吳正偉，梁召俊，王　敦

(西北農林科技大學 植保資源與利用教育部重點實驗室，陜西楊凌　712100)

人工飼料對蘋果蠹蛾顆粒體病毒產量的影響

劉國鋒，樊江斌，吳正偉，梁召俊，王敦

(西北農林科技大學 植保資源與利用教育部重點實驗室，陜西楊凌712100)

優化增殖蘋果蠹蛾顆粒體病毒張掖株(CypoGV-ZY)的飼料配方，為實現經濟高效的病毒生產奠定技術基礎。采用喂毒法，研究蘋果蠹蛾人工飼料中蘋果粉、酵母、小麥面粉、玉米粉4種主要營養成分不同配比對蘋果蠹蛾幼蟲生長及對CypoGV產量的影響。結果表明:添加酵母的飼料配方，幼蟲體質量和病毒產量均顯著提高；其中取食C配方飼料的染毒幼蟲，病毒產量最高，單頭死亡幼蟲蟲尸質量、單頭幼蟲產毒量及每克蟲尸產毒量分別可達30.57 mg、8.63×109和28.25×1010g-1；用玉米粉取代該配方中的小麥面粉時，染毒幼蟲的蟲尸質量明顯降低，病毒產量顯著下降?？梢?，以酵母和小麥面粉作為主要營養成分的C配方飼料，能顯著提高病毒的產量，最適于病毒增殖生產。

蘋果蠹蛾顆粒體病毒；人工飼料；病毒產量

蘋果蠹蛾(CydiapomonellaL.)屬鱗翅目(Lepidoptera)卷蛾科(Tortricidae)，是全球范圍內最具破壞性的果樹害蟲，主要為害蘋果樹和梨樹等[1-2]。幼蟲鉆蛀果實內部取食，排出果外的糞便帶來微生物污染，給蘋果產業造成嚴重的經濟損失。蘋果蠹蛾顆粒體病毒(Cydiapomonellagranulovirus，CypoGV)首次分離自墨西哥[3]。CypoGV對蘋果蠹蛾具有專一性和高致病性，已經大面積推廣應用于蘋果蠹蛾的生物防治[4-5]。由于長期單一使用墨西哥CypoGV分離株防治蘋果蠹蛾，2004年德國[6]和法國[7]的有機蘋果園中出現對CypoGV抗性的種群。目前，蘋果蠹蛾對CypoGV的抗性發展已經遍布歐洲[8]，為了克服抗性，需要病毒新分離株及新的變種[9]，包括俄羅斯、英國、格魯吉亞、伊朗、加拿大、新西蘭、意大利、瑞士都陸續報道分離出CypoGV毒株[10-13]。中國對CypoGV的研究雖然起步較晚，但也相繼分離獲得CypoGV-ZY、CypoGV-CJ01、CypoGV-KS1和CypoGV-KS2等毒株[14-15]。其中CypoGV-ZY(張掖株)病毒殺蟲制劑具有較好的殺蟲效果，已于2013年獲得國家發明專利(專利號201010013631.9)。在中國，隨著蘋果蠹蛾東移的威脅[16]，CypoGV制劑具有很大的應用潛力，大規模生產CypoGV制劑迫在眉睫。雖然，不同人工飼料對蘋果蠹蛾發育的影響已有報道[17]，但這些飼料成分對CypoGV-ZY產量的影響尚未見報道。為此，本試驗改進和優化已經報道的人工飼料配方，探討幾種營養成分的配比對CypoGV產量的影響，確定病毒增殖的最佳配方以實現高效生產CypoGV，為CypoGV本土株的大規模人工增殖提供依據。

1材料與方法

1.1試蟲及病毒來源

試驗用蟲采集于新疆喀什市和阿拉爾市蘋果園，在甘肅農業大學草業學院實驗室密閉飼養。幼蟲單獨放到無菌1.5 mL離心管內，用半人工飼料于人工氣候箱內飼養，作為供試蟲源。飼養條件為：溫度(25±0.5) ℃，光周期16L∶8D，光照度600 lx，相對濕度(60±7)%。

蘋果蠹蛾顆粒體病毒張掖株(CypoGV-ZY)于2005年由西北農林科技大學分子病毒學實驗室分離自甘肅張掖。CypoGV-ZY在甘肅蘭州擴繁并純化，將病毒顆粒(occlusion bodies,OBs)初純化后，配制成1×1012mL-1(每毫升液體所含病毒顆粒個數)的病毒懸液，儲存于4 ℃備用。

1.2飼料配方

5種人工飼料(表1)參考Hansen等[18]的飼料配方及配制方法。A、B、C飼料配方改進和優化自樊江斌等[17]的研究：C配方飼料中的酵母分別被蘋果粉半數或全部替換制成配方B、A。用玉米粉半數或全部替換C配方飼料中的小麥面粉制成配方D、E。

表1　5種蘋果蠹蛾人工飼料配方

1.3幼蟲飼養

幼蟲使用1.5 mL離心管單頭飼養，分別用5種人工飼料飼養初孵幼蟲至5齡初，每種飼料隨機挑選30管，統計幼蟲存活率并稱量，饑餓24 h，備用，每處理重復3次。

1.4病毒感染

將5種飼料均勻切成邊長2 mm的飼料塊，放置于無菌的1.5 mL離心管中，用移液器吸取1×106mL-1的病毒懸液，每塊飼料滴5 μL毒液，晾干。每種飼料塊接入與之對應饑餓后的5齡幼蟲，及時塞上已滅菌棉塞，讓其取食感染。1 d后，待有毒飼料塊取食完全，補充無毒新鮮飼料。喂毒后每隔12 h觀察各處理幼蟲感染和死亡情況，并記錄。每處理30頭5齡幼蟲，重復3次。飼養條件同“1.1”。

1.5死蟲收集及病毒懸液制備

感病幼蟲死亡當日用適量蒸餾水清洗，稱量其體質量。病死蟲用研磨器研成勻漿，稀釋后，用3層紗布過濾，濾液150 g離心3 min，收集上清，再10 000 g離心30 min富集病毒顆粒，用1 mL無菌水重懸浮，重離心懸浮1次，得到病毒懸液，4 ℃保存。

1.6病毒產量測定

將“1.5”制備的病毒懸液定容稀釋，血球計數板計數測得病毒數量。根據稀釋倍數、定容體積和死蟲質量計算單頭幼蟲及每克蟲尸病毒產量。

1.7數據統計與分析

采用SPSS 18.0統計軟件對數據進行統計分析，應用GraphPad Prism 5軟件作圖。

2結果與分析

2.1不同飼料對幼蟲生長的影響

圖1、2表明，不同配方飼料對幼蟲生長影響顯著(P<0.05)。幼蟲取食B、C、D配方飼料時幼蟲存活率，顯著高于E、A配方飼料；幼蟲取食C、D配方飼料時幼蟲平均體質量顯著高于其他飼料。雖然幼蟲取食B、C、D、E 4種配方飼料，在幼蟲存活率和平均體質量方面有差異，但均在較高水平，大部分個體可正?；?；而幼蟲取食A飼料，幼蟲生長不良，存活率和幼蟲體質量顯著降低，僅有少數個體化蛹，不適于蘋果蠹蛾飼養。

2.2不同飼料對病毒產量的影響

測定取食A、B、C、D、E 5種不同的人工飼料時蘋果蠹蛾單頭幼蟲及每克蟲尸的病毒產量。由表2可知，不同飼料對單頭幼蟲病毒產量及每克蟲尸病毒產量的影響有顯著差異(P<0.05)。對于單頭幼蟲病毒產量，C配方顯著高于另外4種配方；B、E之間沒有顯著差異，但顯著高于A、D；A配方對應的病毒產量最低。計算每克蟲尸病毒產量表明： C>B>E>D>A，除了B、C在0.01水平差異不顯著外，其他配方之間均差異顯著。

柱狀圖上標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。

Different lowercase letters above the bars represent significant difference (P<0.05),the same hereinafter.

圖1取食5種配方飼料的蘋果蠹蛾從初孵到5齡累計存活率

Fig.1Cumulative survival rate ofC.pomonellafrom hatching to fifth-instar for five artificial diets

圖2　取食5種配方飼料的蘋果蠹蛾5齡幼蟲體質量

飼料種類Foragespecies顆粒體產量 Yieldofviruses單頭幼蟲產量(×109)Averageperlarva每克蟲尸產量(×1010)/g-1AveragedeadlarvaA0.82±0.01dD4.53±0.23eDB6.85±0.20bB27.85±0.11bAC8.63±0.15aA28.25±0.12aAD5.86±0.10cC20.71±0.07dCE6.55±0.18bB24.41±0.12cB

注：數據為“平均數±標準差”。同列數據后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

Note: Data are “mean±standard deviation”.Data followed by different lowercase letters within same column are significant difference (P<0.05),different capital letters are extremely significant difference(P<0.01).

2.3不同飼料對蟲尸質量的影響

取食5種配方飼料的蘋果蠹蛾分別于5齡時喂食5 μL 1×106mL-1CypoGV-ZY的病毒懸液，收集病死蟲尸并稱量。方差分析表明，不同配方飼料對單頭蟲尸體質量的影響顯著(P<0.05)(圖3)。從圖中可以看出，以C配方飼料為食的染毒幼蟲病死后蟲尸體質量最高，可達30.57 mg，其次是D、E，之后依次為B、A。

圖3　 取食5種配方飼料的蘋果蠹蛾染毒

3結論與討論

病毒的大量繁殖是病毒微生物殺蟲劑生產和應用的前提，雖然CypoGV可用昆蟲細胞繁殖[19]，但病毒產量低、成本昂貴，因此CypoGV生產仍使用活體幼蟲增殖，但由于不同的人工飼料直接影響蘋果蠹蛾的生長發育，從而影響病毒產量。本研究在前人對蘋果蠹蛾人工飼料研究的基礎上，探討幾種人工飼料對CypoGV-ZY產量的影響。應用以小麥面粉和酵母為主要營養成分的C配方飼料，單頭幼蟲病毒產量和每克蟲尸產毒量都顯著高于其他4種配方飼料。據此認為，幼蟲取食C配方飼料最適宜CypoGV增殖。不同的營養組合對昆蟲病毒的產量有明顯影響，用酵母替代蘋果粉能夠促進幼蟲生長發育，顯著提高幼蟲體質量，增加營養，利于CypoGV增殖。Witzgall等[20]發現浸過酵母發酵液的蘋果飼喂蘋果蠹蛾幼蟲能夠促進其生長發育；樊江斌等[17]研究認為添加酵母的飼料可以增加蟲質量。酵母是重要的氮源，Shapiro[21]報道大蠟螟(Galleriamellonella)取食含氮豐富的飼料易感染核多角體病毒；呂鴻聲[22]也報道取食氮物質較多的嫩桑葉的家蠶(Bombyxmori)感染NPV的百分率比取食適熟桑葉的高一倍。本研究也有類似結論，在飼料中添加酵母，可以提高幼蟲體質量、顯著提高病毒產量。

玉米作為人工飼料的營養物質已應用于多種昆蟲的飼養[23-24]，但作為蘋果蠹蛾飼料成分，研究的卻很少。本試驗發現含玉米的飼料也可以用于蘋果蠹蛾飼養和CypoGV-ZY的增殖，但病毒產量不如C(純小麥面粉)配方飼料。相對于小麥面粉，玉米粉不適于蘋果蠹蛾幼蟲的生長發育，幼蟲體質量降低，但能在一定程度上提高蘋果蠹蛾對病毒的敏感性，當小麥面粉完全被玉米粉取代，單位質量蟲體病毒產量比D配方飼料(玉米粉與小麥面粉質量比為1∶1)明顯回升，這可能是由于添加玉米在營養成分方面的變化，降低幼蟲對病毒的抵抗力，利于病毒的侵染、繁殖。

影響病毒產量的因素有許多，蟲體質量是重要因素，不同飼料可以通過影響幼蟲發育影響病毒產量。幼蟲取食A飼料，影響生長發育，顯著降低病毒產量。這與Howell[25]使用蘋果粉的飼料，幼蟲生長發育良好的結果有差異，其原因有待進一步研究。環境對病毒產量也有很大的影響，但這仍需進一步研究。中國蘋果蠹蛾人工飼料配方雖然已經有一些報道，但與國外產業化大量飼養蘋果蠹蛾相比差距很大，仍在優化改進階段，本試驗也只分析了幾種主要營養成分對CypoGV-ZY產量的影響，要獲得可以產業化生產病毒的飼養配方和技術，尚需對其他因子做進一步系統研究。

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Effects of Artificial Diet on the Yield ofCydiapomonellaGranulovirus

LIU Guofeng,FAN Jiangbin,WU Zhengwei,LIANG Zhaojun and WANG Dun

(Ministry Education Key Laboratory of Plant Protection Resources & Pest Management,Northwest A&F University, Yangling Shaanxi712100, China)

Studies were designed to find the optimal diet for the proliferation ofCydiapomonellagranulovirus Zhangye strain (CypoGV-ZY), which can lay the foundation for virus production. Four main nutrients, including apple powder, yeast, wheat flour and corn flour, were used to determine the effect of different artificial diet on the development ofC.pomonellaand the yield of CypoGV by stomach toxicity. The result showed that the CypoGV-ZY infected larvae mass and yield of virus were significantly improved with the yeast adding in diet. The formula C diets fed virus infected larvae would gain the highest CypoGV-ZY yield, and the dead larvae mass, the virus yield of average per larva and the virus yield of average per gram dead larva were 30.57 mg, 8.63×109and 28.25×1010g-1, respectively. Compared to C formula diets, the replacement of wheat flour by corn flour would lead to lower CypoGV production and dead larvae mass. In conclusion, the artificial diet formula C containing yeast and wheat flour, which significantly improved the yield of CypoGV-ZY, could be a suitable diet for virus propagation.

Cydiapomonellagranulovirus; Artificial diet; CypoGV-ZY yield

2015-04-05

2015-05-13

National Natural Science Foundation of China (No.31170609,31270691);Provincial Grant of Scientific Innovation(2014KTCL02-14).

LIU Guofeng,male,master.Research area:integrated pest management.E-mail:mail369feng@163.com

WANG Dun,male,professor,Ph.D,doctoral supervisor.Research area:insect molecular biology and resource entomology.E-mail: dunwang@foxmail.com

(責任編輯：成敏Responsible editor:CHENG Min)

2015-04-05修回日期：2015-05-13

國家自然科學基金(31170609，31270691)；陜西省科技統籌創新工程計劃項目(2014KTCL02-14)。

劉國鋒，男，碩士研究生，研究方向為有害生物綜合治理。E-mail：mail369feng@163.com

王敦，男，教授，博士，博士生導師，主要從事昆蟲分子生物學及昆蟲資源利用研究。E-mail：dunwang@foxmail.com

Q786；S436.611. 2+9文獻標志碼A文章編號1004-1389(2016)07-1092-05

網絡出版日期：2016-06-30

網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20160630.1635.042.html