CD8+T細胞在CA16感染手足口病中的表達變化及潛在作用*

李莉

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CD8+T細胞在CA16感染手足口病中的表達變化及潛在作用*

李莉①

【摘要】目的：對比分析15～24個月及2～5歲CA16感染的普通型與危重癥手足口?。╤and，footand mouthdisease，HFMD）患者外周血中CD8+T細胞的表達情況，尋找發現與CA16致病有關的免疫病理因素。方法：收集2014年5-8月間昆明市兒童醫院感染科確診的兒童HFMD病例外周血標本共72例，其中普通型32例，危重癥40例，采用流式細胞術對患者外周血CD8+T淋巴細胞亞群進行檢測分析。結果：15～24個月普通型HFMD患者外周血CD8+T淋巴細胞百分比略高于正常健康兒童參考值，而危重癥患者CD8+T細胞略低于正常參考值。此外，與正常參考值相比，2～5歲普通型及危重癥患者外周血中CD8+T淋巴細胞百分比均減低，其中危重癥患者略低于普通型患者。結論：CA16感染后，不同年齡、不同病情的HFMD患者外周血中CD8+T細胞的表達變化不太明顯，說明CA16感染后，患者體內的CD8+T細胞基本能夠發揮正常的抗病毒免疫效應。而在危重癥時，兩個年齡段患者CD8+T細胞百分比略低或減低，說明CA16的持續性感染可能對機體CD8+T細胞的表達產生了影響，使其殺傷病毒效應減低，這可能是CA16感染誘導神經系統并發癥發生的免疫病理因素之一。

【關鍵詞】CA16；CD8+T細胞；手足口??；作用

云南省衛生科技計劃項目（2014NS052）

①昆明市兒童醫院云南昆明650228

First-author’s address：Children’s Hospital of Kunming，Kunming 650228，China

病毒感染后機體內部的天然免疫系統雖然能夠快速激活并誘導、招募適應性免疫應答的抗病毒免疫效應，但機體內感染病毒的復制傳播能力仍在增加［1-3］。作為特異性殺傷病毒感染細胞的CD8+T細胞，能在病毒感染后快速激活并清除病毒，極大地抑制體內病毒的復制，但體內殘存的病毒依然能夠逃避機體的免疫自穩，造成體內中樞神經系統的慢性感染。這是由于CD8+T細胞在急性感染期快速清除病毒后，機體內病毒載量已經降低到機體無法識別的水平，此時中樞神經系統中的CD8+T細胞受刺激減少、數量減低，僅有少量存在于中樞神經系統中，而此時中樞神經系統中還可能殘存少量未清除的病毒RNA。當機體內環境紊亂，患者疾病惡化時，中樞神經系統中存在的病毒很可能會再次發生復制，感染神經系統，導致中樞神經系統中少量CD8+T細胞無法全部快速識別并殺傷病毒感染細胞，最終促使患者出現嚴重的神經系統并發癥，如無菌性腦膜炎、腦干腦炎等，甚至威脅生命［4-6］。

柯薩奇病毒是微小核糖核酸病毒家族中的成員之一，是感染人類的重要腸道病原體。雖然大多數感染呈現亞臨床或輕度癥狀，但一些急性新生兒感染也常會導致患者病情惡化甚至死亡［7］。近年來暴發的兒童手足口?。℉and，footandmouthdisease，HFMD）， 柯 薩 奇 病 毒A16（Coxsackievirus16，CA16）就是主要致病病原體之一，5歲以下兒童均極易感染。作為柯薩奇病毒成員之一，CA16感染人體后，患者表現的臨床癥狀大多數較輕，能夠自行消退，但少數重癥病例也會發生病情惡化并致死的情況［8-13］。目前對于CA16急性感染期，中樞神經系統中的CD8+T細胞能否抑制殘留病毒RNA的再次活化或是導致免疫病理反應的發生，或者還是同時參與保護機體及導致疾病還不明確。有研究顯示患者感染CA16，體內的抗病毒抗體陽性率增高，提示體液免疫參與了抗CA16的過程，對于細胞免疫在抗CA16中的作用研究還相對較少［14-15］。由于CA16引發的重癥病例多表現出嚴重的神經系統并發癥，而CD8+T細胞又是中樞神經系統中起主要殺傷病毒感染細胞的免疫細胞，因此，本研究主要通過比對分析不同年齡段CA16感染的普通型、危重型HFMD患者外周血中CD8+T細胞的表達差異，尋找發現與疾病負擔加重有關的免疫因素，進而為臨床準確判斷并分析疾病提供可參考的理論依據［16］。

1　資料與方法

1.1一般資料根據衛生部《手足口病診療指南》（2010年版）及《腸道病毒71型（EV71）感染重癥病例臨床救治專家共識》（2011年版）的診斷標準，選取2014年5-8月昆明市兒童醫院感染科確診的CA16感染的手足口病病例外周血標本共72例，其中普通病例共36例，15～24個月及2～5歲年齡段患者為16例及20例；危重癥病例共36例，15～24個月及2～5歲年齡段患者為16例及20例［17-18］。

1.2試劑及主要儀器試劑：采用BD公司生產的檢測淋巴細胞亞群的試劑盒BDMultitest6-color TBNKReagent。該試劑盒中包括識別富集不同淋巴亞群（T細胞、B細胞以及NK細胞）的抗體，其中包括識別NK細胞的抗體（CD16和CD56PE）、識別T細胞的抗體（CD3FITC）、為淋巴細胞群設置的CD45PerCP-Cy?5.5、檢測CD4+T細胞的CD4 PE-Cy?7、識別B淋巴細胞的CD19APC以及識別CD8+T細胞的CD8APC-Cy7。主要檢測儀器：BD FACSCanto?，使用BDFACSCanto?軟件進行參數設置、質控監測以及數據分析。

1.3方法流式細胞儀檢測：采集靜脈血2～3mL，注于EDTA-Na抗凝管中。按照操作說明書，分別向已編好號的試管中加入20μL六色單克隆抗體和同型對照，分別向試管中加入混勻的100μL抗凝血；混勻，避光，室溫孵育15～20min；加入已稀釋好的溶血素600μL混勻避光室溫溶血8～10min，上機檢測。

1.4統計學處理采用PEMS3.1軟件對所得數據進行統計學分析，由于本研究中同一年齡段普通型、危重癥的病例數各不相同，因此采用中位數以及5%～95%置信區間進行統計學分析。

2　結果

2.115～24個月普通型與危重癥HFMD患者CD8+T細胞的表達情況比較根據中位數及95%置信區間結果顯示（圖1），普通型HFMD患者外周血CD8+T淋巴細胞亞群在外周血中所占百分比為20.365%，5%～95%置信區間為24.265%～37.4375%，略高于正常健康兒童參考值（20%，11%～32%），而危重癥患者CD8+T淋巴細胞亞群在外周血中所占百分比為19.29%，5%～95%置信區間為11.2985%～38.901%略低于正常參考值。說明此年齡段患者感染CA16初期癥狀較輕，其體內CD8+T細胞受病毒刺激后能夠擴增，但不明顯；當患者病情危重時，CD8+T細胞數量略微減低，說明病毒感染后期，其體內CD8+T細胞的免疫活性很可能受到病毒復制的影響，但影響不大?？偟膩碚f，該年齡段的普通及危重癥患者感染CA16后，其體內的CD8+T細胞均具有免疫活性，但活性不高，推測在抗CA16感染過程中，CD8+T細胞雖能發揮正常的抗病毒免疫反應，但抗病毒作用不強，這很可能是病毒能夠反復感染、無法從人體內完全清除的原因。

圖1　15~24個月普通型與危重癥HFMD患者CD8+T細胞的表達情況

2.22～5歲普通型與危重癥HFMD患者CD8+T細胞的表達情況比較根據中位數及95%置信區間結果顯示（圖2），普通型患者外周血中CD8+T淋巴細胞百分比為21.11%，5%～95%置信區間為20.09%～38.985%；危重癥患者外周血中CD8+T淋巴細胞百分比為20.86%，5%～95%置信區間為14.3185%～40.2085%，與正常健康兒童參考值（24%，14%～33%）相比，普通及危重癥患者外周血中CD8+T淋巴細胞百分比均減低，其中危重癥患者略低于普通型患者，說明該年齡段不同患者體內的CD8+T細胞的免疫活性均減低，尤其在危重癥時更低。另外，與上述15～24個月普通型患者CD8+T細胞略高于正常參考值相反的是，該結果中2～5歲普通型患者體內CD8+T細胞卻低于正常參考值。一般來說，兒童淋巴細胞亞群數量的變化與年齡密切相關。正常情況下，2～5歲正常兒童CD8+T細胞的參考值高于15～24個月兒童的參考值，即隨年齡增高，CD8+T細胞的表達是升高的。但該結果顯示2～5歲普通型HFMD患兒的CD8+T細胞減低，僅略高于15～24個月兒童的正常參考值，這說明年齡較大的HFMD兒童的CD8+T細胞略高于年齡較小的兒童，雖然升高幅度不高，但也可以說明CA16感染的普通型HFMD患者的CD8+T細胞表達基本正常，其免疫學活性受到較小的影響。除此之外，與上述15～24個月危重癥患者相似的是2～5歲危重癥患者體內的CD8+T細胞減低，且減低較明顯，提示這一年齡段患者病情危重時，其體內的CD8+T細胞介導的細胞毒性反應很可能受到病毒復制機制的干擾或抑制，這也很可能是這一年齡段患者急性感染期發生嚴重神經系統并發癥的原因，即體內清除病毒的主要免疫細胞CD8+T細胞的數量及活性減低。

圖2　2~5歲普通型與危重癥HFMD患者CD8+T細胞的表達情況

3　討論

大多數研究表明，CD8+T細胞在應對不同病毒感染時其免疫效應是多樣化的。急性感染時，對病毒具有特異性殺傷作用的CD8+T細胞會被迅速激活并大量擴增，同時，體內其他免疫調節因素也會同時發揮抗病毒免疫效應。當T細胞免疫反應達到頂峰時，90%的急性效應CD8+T細胞會死亡，其余的CD8+T細胞會分化為記憶性T細胞，存在于人體內。此時，人體內的病毒感染細胞大量被殺死，但病毒RNA還殘留于人體內，對機體造成持續性的慢性感染［19-22］。

本研究對比了不同年齡段普通型和危重癥患者外周血CD8+T細胞的表達差異，結果發現不論年齡大小，危重癥患者的CD8+T細胞都低于普通型患者，這很可能與病毒感染的急性和持續性有關。CD8+T細胞一般會在急性感染期迅速擴增，清除體內不斷復制的病毒，而當病毒持續感染時，體內抗病毒的關鍵免疫細胞很可能會是其他免疫細胞，如B細胞或CD4+T細胞。對于危重癥患者來說，病毒的持續性感染是疾病負擔加重的主要原因，此時，CD8+T細胞減低很可能與感染的病毒類型以及機體免疫系統調節機制有關。

此外，本研究不僅反映了HFMD患者體內CD8+T細胞的表達水平，也可反映出CA16對機體內CD8+T細胞的免疫刺激活性較低，在15～24個月普通型患者中，CD8+T細胞略高，而在2～5歲普通型患者中略低。一般來說，患者在感染初期癥狀較輕，但屬于急性感染，此時CD8+T細胞應該處于迅速擴增清除病毒的狀態，但本結果中未觀察到CD8+T細胞的大量擴增。這一方面說明，CA16感染初期，由于其致病性低及對患者造成的疾病負擔較輕，因此機體特異性的CD8+T細胞的擴增不明顯。另一方面，CD8+T細胞在2～5歲普通型患者中減低，很可能是該年齡段患者容易感染并發生嚴重神經系統并發癥的原因，具體致病機制可能與感染后期中樞神經系統中CD8+T細胞數量減少以及病毒在中樞神經系統中潛在復制、持續性感染有關。

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The Potential Function of Varied Expression of CD8+T Cells Against CA16

LI Li.
Medical Innovationof China，2016，13（13）：006-009

【Abstract】Objective：TocompareandanalyzetheexpressionofCD8+Tlymphocytessubsetinperipheral bloodindifferentchildrenwithhand，footandmouthdisease（HFMD）infectedbyCA16betweentheagegroups of15to24monthsand2to5years，whichmightdisclosetheimmunopathologicfactorsrelatedtothepathogenicity ofCA16.Method：72caseswithHFMDofperipheralbloodsampleswerecollectedinthedepartmentofinfectious diseaseinKunmingChildren’sHospitalfromMaytoAugust2015，whichincluded32mildcasesand40critical cases.TheexpressionofCD8+Tlymphocytesubsetsinpatients’peripheralbloodsampleweredetectedbytheflow cytometry.Result：ThepercentageofCD8+Tlymphocyteinmildpatientsfrom15to24monthswasslightlyhigher thanthereferencevalueofCD8+Tcellsinnormalhealthychildren，whilethepercentageofCD8+Tlymphocytein criticalcaseswasslightlylowerthanthenormalreferencevalue.Inaddition，comparedwiththereferencevalue ofCD8+Tcellsinnormalhealthychildrenwithin2to5yearsold，theexpressionofCD8+Tcellswasdecreasedin bothofmildandcriticalpatientswithin2to5yearsold，andthedecreaserelativelyobviousincriticalpatients. Conclusion：Inthesetwoagegroupsbetween15to24monthsand2to5years，theexpressionofCD8+Tcellsin differentpatientsinfectedbyCA16variedlessobviously，whichmightcanbeexplainedthattheenoughquantity ofCD8+Tcellsshouldplayitsimmuneeffectonkillinginfectedcellsasnormal.Forthereasonoftheexpressionof CD8+Tcellsisslightlylowerordecreasedincriticalcasesofthesetwoagegroups，itmaybeassociatedwiththe persistenceinfectionofCA16affectedtheexpressionofCD8+Tcells，whichattributetothelowerkillingeffectof CD8+Tcells.Itmightbeoneoftheimmunopathologicfactorsresultedintheoccurrenceofneurologicalcomplication inducedbyCA16.

【Key words】Coxsackievirus16；CD8+Tcells；Hand，footandmouthdisease（HFMD）；Function

*基金項目：云南省科技計劃青年項目（2012FD100）；

通信作者：李莉

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.13.002

收稿日期：（2015-12-30）（本文編輯：周亞杰）