促性腺激素釋放激素激動劑對子宮內膜基質細胞蛻膜化的影響

焦婷婷,劉玉杰,高　原,李　星,惠　寧

(第二軍醫大學附屬長海醫院 婦產科,上海200433)

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促性腺激素釋放激素激動劑對子宮內膜基質細胞蛻膜化的影響

焦婷婷,劉玉杰,高原,李星,惠寧*

(第二軍醫大學附屬長海醫院 婦產科,上海200433)

摘要：目的研究促性腺激素釋放激素激動劑(GnRH-α)對子宮內膜基質細胞蛻膜化的影響。方法體外原代培養人子宮內膜細胞并構建蛻膜化模型，用不同濃度的GnRH-α處理細胞，Real-Time PCR方法檢測標志子宮內膜基質細胞蛻膜化程度的分子催乳素(prolactin,PRL)和胰島素樣生長因子結合蛋白-1(IGFBP-1) mRNA的表達，ELISA法檢測其在細胞上清液中的蛋白表達。結果10-8g/ml濃度，10-7g/ml濃度和10-6g/ml濃度的PRL mRNA表達均增加，10-7g/ml濃度和10-6g/ml IGFBP-1 mRNA的表達增加(P<0.05，P<0.01)；蛻膜化72 h 10-6g/ml濃度基質細胞上清液中PRL 蛋白增加，10-7g/ml濃度上清液中IGFBP-1蛋白增加(P<0.05)。結論GnRH-α促進了子宮內膜基質細胞蛻膜化PRL和IGFBP-1 mRNA的表達和上清液中PRL和IGFBP-1 蛋白的分泌。GnRH-α可以促進對人子宮內膜基質細胞的蛻膜化。

關鍵詞：促性腺激素釋放激素激動劑；子宮內膜基質細胞；蛻膜化；PRL；IGFBP-1

(ChinJLabDiagn,2016,20:0879)

子宮內膜蛻膜化是指子宮內膜在雌、孕激素的作用下由增殖期向分泌期轉變的過程。子宮內膜基質細胞(endometrial stromal cells,ESCs)增殖，形態發生變化，從成纖維細胞轉變為多核、胞質豐富的蛻膜化基質細胞(decidual stromal cells,DSCs)。孕激素是子宮內膜蛻膜化的始動因素，多種因素共同參與其中，包括細胞因子類、垂體激素、免疫細胞、信號轉導分子等。其中催乳素(prolactin,PRL)和胰島素樣生長因子結合蛋白-1(insulin-like growth factor binding protein1,IGFBP-1)可以作為衡量蛻膜化程度的標志分子[1-4]。蛻膜化是妊娠建立的重要步驟，對胚胎植入的過程起著關鍵作用。子宮內膜基質細胞如果不能形成有效的蛻膜化，會導致胚胎著床的失敗。

促性腺激素釋放激素激動劑(GnRH-α)是將天然的促性腺激素結構中某些氨基酸進行置換，因此形成的化合物比天然的促性腺激素與垂體上GnRH受體結合的親和力更強，半衰期延長，穩定性強。大劑量使用時可以對垂體分泌的FSH和LH起到降調節作用，因此廣泛應用于IVF-FT技術的控制性促排卵長方案中，有研究發現GnRH-α不僅可以影響性腺激素的分泌，還可以直接作用于子宮內膜，提高胚胎移植的成功率。但是GnRH-α對子宮內膜基質細胞的蛻膜化有怎樣的作用，國內外尚無報道，本實驗通過研究GnRH-α對人子宮內膜基質細胞的蛻膜化的影響，探討其在胚胎移植中的作用。

1材料與方法

1.1主要材料與試劑人子宮內膜組織由長海醫院生殖醫學中心提供，DNA酶Ⅰ型購于美國Sigma公司，Ⅱ型膠原酶購于WASHINGTON公司，胎牛血清、DMEM 培養基均購于美國Gibcol公司，醋酸甲羥孕酮(Medroxyprogesteroneacetate,MPA)和8-Br-Camp均購于美國Sigma公司,PCR試劑盒購于美國Bio-med公司，ELISA試劑盒購于北京碧云天生物科技公司，Triporelin(曲普瑞林)購于德國輝凌制藥公司。

1.2實驗方法

1.2.1子宮內膜基質細胞的原代培養和蛻膜化模型的構建按差時貼壁法原代培養人子宮內膜基質細胞，取宮腔鏡下刮取的少量人子宮內膜組織，沖洗標本，剪碎。將其置于F12 DMEM培養液配置的消化液中(DNA酶，終濃度為0.5 mg/ml；Ⅱ型膠原酶，終濃度為1.5 mg/ml；BSA，終濃度為1 mg/ml)，37℃，120-130轉/分，搖動水浴消化40-60 min。收集上層液體，終止消化，600 rpm×3 min離心沉淀未消化完全的組織。收集上清液，以1 100 rpm×10 min離心沉淀細胞。棄上清液，重懸細胞沉淀，經400目(孔徑38 μm)不銹鋼細胞濾網過濾。將濾液接種25 cm細胞培養瓶中，置于37℃，5 % CO2培養箱中培養。貼壁30-40 min后，更換培養液以去除不貼壁的腺上皮細胞和血細胞(基質細胞在40 min內貼壁，腺上皮細胞貼壁時間大于30 min)。48 h后全量更換培養液，當細胞貼壁生長達到瓶底的70%-80%時進行傳代。對P1代的子宮內膜基質細胞進行蛻膜化誘導，誘導方法為加入10-7M MPA和5×10-4M 8-Br-cAMP(M+A)，誘導72 h。

1.2.2Real-Time PCR方法檢測標志子宮內膜基質細胞蛻膜化程度的分子PRL和IGFBP-1 mRNA的表達 對P1代的子宮內膜基質細胞按M+A法進行蛻膜化誘導，培養72 h后，按Trizol說明書的步驟提取基質細胞的總RNA，反轉錄成cDNA，稀釋后按Real-Time PCR試劑盒方法進行PRL和IGFBP-1基因的擴增。跟據GeneBank檢索人PRL和IGFBP-1的mRNA序列，應用Primer Premier5.0軟件并參考相關文獻，選取引物。PRL引物序列：上游：5＇-CAC TAC ATC CAT AAC CTC TC-3＇下游：5＇-ATG CTG ACT ATC AAG CTC AG-3＇，IGFBP1引物序列:上游：5＇-TAT GAT GGC TCG AAG GCT CTC-3＇,下游：5＇-GTA GAC GCA CCA GCA GAG TC-3＇。將合成的cDNA產物加入體系中進行PCR反應，分別擴增樣本目的基因和管家基因β-actin，利用Ct值進行定量分析，檢測mRNA表達量的變化。

1.2.3ELISA方法檢測細胞上清液中PRL和IGFBP-1蛋白的分泌對P1代的子宮內膜基質細胞體外誘導蛻膜化培養，按(M+A)法。分別于24、48和72 h收集細胞上清液，按ELISA試劑盒稀釋標準品，留取的細胞上清液，4°C，1 000 r/min，離心20 min；依次加入樣品和標準品，再加入所需的一抗，經孵育，洗滌后加二抗，37℃孵育1 h，用PBS洗滌3次，每次間隔2 min，分別加入ABC工作液，37°C孵育30 min，用PBS洗滌5次，每次間隔2 min，加入TMB顯色，孵箱中孵育20-30 min，避光顯色，加入終止液終止顯色。用酶標儀檢測450 nm測各孔OD值。

2結果

2.1原代子宮內膜基質細胞的培養及蛻膜化模型的構建對原代培養的人子宮內膜基質細胞P1代進行蛻膜化誘導，加入10-7M MPA和5×10-4M 8-Br-cAMP(M+A)。如圖1所示：A圖為原代培養的人子宮內膜基質細胞，細胞呈梭狀，為分散型生長。B圖為蛻膜化誘導72 h后的人子宮內膜基質細胞，細胞增大圓潤，增殖明顯，排列緊密。均在普通光學顯微鏡下100×下觀察。

圖1　子宮內膜基質細胞

2.2Real-Time PCR方法檢測GnRH-α對子宮內膜基質細胞蛻膜化中PRL和IGFBP-1 mRNA的表達的影響原代培養的人子宮內膜基質細胞P1代進行蛻膜化誘導72 h，誘導同時加入不同濃度的GnRH-α(曲普瑞林)處理細胞。實驗分為4組，①空白對照組；②10-8g/ml濃度組；③10-7g/ml濃度組；④10-6g/ml濃度組；用Real-time PCR方法檢測蛻膜化中PRL和IGFBP1 mRNA的表達，結果如圖2和圖3所示:PRL mRNA隨著GnRH-α濃度的升高而表達增加，在10-8g/ml濃度組和10-7g/ml濃度組差異具有統計學意義(*P<0.05 vs空白對照組)；在10-6g/ml濃度組差異顯著(**P<0.01 vs 空白對照組)。IGFBP-1 mRNA在10-8g/ml濃度組表達降低，差異無統計學意義；在10-7g/ml濃度組表達增加，差異具有統計學意義(*P<0.05 vs 空白對照組)；在10-6g/ml濃度組差異顯著(**P<0.01 vs 空白對照組)。

圖2　　　　GnRH-α對子宮內膜基質細胞蛻膜化中PRL mRNA的表達的影響

圖3　　　　GnRH-α對子宮內膜基質細胞蛻膜化中IGFBP-1mRNA的表達的影響

2.3ELISA方法檢測GnRH-α對子宮內膜基質細胞蛻膜化上清液中PRL和IGFBP-1蛋白分泌的影響原代培養的人子宮內膜基質細胞P1代進行蛻膜化誘導，加入不同濃度的GnRH-α(曲普瑞林)處理細胞，分別在蛻膜化24、48和72 h收集細胞上清液，用ELISA方法檢測上清液中PRL和IGFBP-1蛋白的分泌。實驗分為3組，①空白對照組； ②10-7g/ml濃度組；③10-6g/ml濃度組；結果如圖4和圖5所示:10-6g/ml濃度組上清液中的PRL蛋白量在蛻膜化72 h較空白對照組增加(*P<0.05 vs 空白對照組)； 10-7g/ml濃度組上清液中的IGFBP-1蛋白量在蛻膜化72 h較空白對照組增加(*P<0.05 vs 空白對照組)。

圖4　GnRH-α對子宮內膜基質細胞蛻膜化上清液中PRL蛋白表達的影響

圖5　GnRH-α對子宮內膜基質細胞蛻膜化上清液中IGFBP-1蛋白表達的影響

3討論

胚胎的種植通常發生在受精后的3-5天，進入宮腔的胚胎和子宮內膜按照一定的時間和空間順序分泌相關蛋白和局部因子，達到相互識別，相互融合進而完成著床的過程。這其中包括子宮內膜蛻膜化，囊胚孵出后的定位、黏附和滋養層細胞的侵入，直至整個胚胎包埋在子宮內膜基質細胞中，臨床上稱這一時期的子宮內膜為“種植窗”期。胚胎這種嚴格的時空定位現象提示胚胎激活和子宮內膜對其接受性同步與否是其著床成功的關鍵因素，對于胚胎來說，種植的第一道關口就是子宮內膜的容受性，因此研究著床過程中子宮內膜的蛻膜化對于臨床上輔助生殖技術中胚胎移植的成功具有重大的意義[5,6]。

目前的研究表明子宮內膜基質細胞的蛻膜化過程有多種細胞因子，多種因素共同參與。其中胞內信號轉導第二信使的cAMP在蛻膜化中起著關鍵作用。cAMP可以與子宮內膜基質細胞表面相關受體結合,激活G蛋白信號通路，調節子宮內膜的蛻膜化。在人體外子宮內膜基質細胞的誘導中,cAMP能顯著促進子宮內膜基質細胞合成分泌泌乳素(PRL),因此目前蛻膜化模型的建立多采用cAMP與醋酸甲羥孕酮的聯合誘導[7]。本實驗也是采用這一經典方法構建了人體外子宮內膜基質細胞蛻膜化模型。

GnRH-α的降調節作用目前廣泛應用于子宮內膜異位癥患者的治療和IVF-ET技術控制性促排卵的長方案中。研究表明子宮內膜異位癥患者的在位子宮內膜蛻膜化程度降低，是導致不孕的因素之一[8-10]。臨床上異位癥患者在接受GnRH-α治療后自然妊娠率增加，對于因不孕接受IVF-ET治療的異位癥患者選擇長方案GnRH-α降調節后妊娠率較別的方案增加。這說明GnRH-α可能對異位癥患者子宮內膜的蛻膜化具有一定的作用。另外多項研究表明在IVF-ET術中接受凍融胚胎移植的患者，人工周期使用GnRH-α進行預處理后，其臨床妊娠率較對照組提高，胚胎停育和異位妊娠的發生率降低[11,12]。這提示我們GnRH-α有助于改善子宮內膜的容受性，提高妊娠率，利于胚胎的早期發育。那么GnRH-α是怎樣作用于子宮內膜，有學者研究發現使用 GnRH-a預處理后影響了子宮內膜上胞飲突 的形成時間，與自然周期相比，胞飲突的形成時間平均提前 1 到2 天[13,14]，因此影響了子宮內膜種植窗的發生時間。

在本研究中，我們探討了GnRH-a對子宮內膜基質細胞蛻膜化的影響，發現GnRH-a可以促進子宮內膜基質細胞的蛻膜化，和上述結果都表明了GnRH-a能夠直接作用于子宮內膜，影響其容受性。為GnRH-α用于治療子宮內膜異位癥引起的不孕癥提供了的新理論支持，也為臨床上研究GnRH-α在IVF-ET術胚胎移植中的作用提供了新的研究方向。GnRH-α通過怎樣的機制調節子宮內膜基質細胞的蛻膜化仍需要我們進一步的研究。

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基金項目：上海市科委基金項目(09411966600)

*通訊作者

文章編號：1007-4287(2016)06-0879-04

中圖分類號：R392

文獻標識碼：A

(收稿日期：2015-12-17)

The roles of gonadotropin-releasing hormone agonist (GnRH-α) in the decidualization of endometrial stromal cells(ESCs)

JIAOTing-ting,LIUYu-jie,GAOYuan,etal.

(DepartmentofObstetricsandGynecology,ChanghaiHospitalofSecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China)

Abstract:ObjectiveTo study the roles of gonadotropin-releasing hormone agonist (GnRH-α) in the decidualization of endometrial stromal cells(ESCs).MethodsCulture primary human endometrial stromal cells,and build the decidualed human endometrial stromal cells model in vitro，treated with different concentrations of GnRH-α,Using Real-Time PCR to detect the the expression PRL(prolactin) and IGFBP-1 (insulin-like growth factor binding protein1) mRNA,which is the marker of decidualization,ELISA was also used to detect its expression in the cell supernatant ResultsIn 10-8g / ml concentration,10-7g / ml concentration and 10-6g /ml PRL mRNA expression increased,in 10-7g / ml concentration and 10-6g / ml IGFBP-1 mRNA expression increased(*P<0.05,**P<0.01);after decidualized for 72 hours，in 10-6g / ml concentration PRL protein increased in the cell supernatant，in 10-7g / ml concentration IGFBP-1 protein increased (*P<0.05).ConclusionGnRH-α increase the expression of PRL and IGFBP-1 mRNA in the the decidualization of ESCs.and also increase the PRL and IGFBP-1 protein expression in the cell supernatant.GnRH-α can promot the the decidualization of ESCs.

Key words:gonadotropin releasing hormone agonist;endometrial stromal cells;decidual;PRL;IGFBP-1