新生抗原在腫瘤治療中的研究進展

劉郅皓，倪仕鑫，何思遠，陳樞青

(浙江大學 藥學院，浙江 杭州 310000)

新生抗原在腫瘤治療中的研究進展

劉郅皓，倪仕鑫，何思遠，陳樞青Δ

(浙江大學 藥學院，浙江 杭州 310000)

隨著對腫瘤研究不斷深入，各種新式療法競相問世，然而，對抗原的何種性質使免疫系統得以區分癌細胞和正常細胞目前并不清楚。新生抗原(neoantigen)是一種位于腫瘤細胞表面的特異性抗原，它的存在使人類免疫療法進入到新的領域，使個性化治療成為可能。新興的數據表明，這樣的新抗原的識別是臨床免疫療法的一個主要因素。它們能在癌癥免疫治療中形成一個生物標志物，進而提供各種治療方法進攻的靶點，使得T細胞對抗這一類抗原的免疫應答有選擇性地增強。

新生抗原；精確細胞免疫治療；抗原表位；免疫功能

人類對抗腫瘤的歷史，從傳統的治療方法，到靶向藥物，表觀遺傳，再到現在熱門的免疫療法，每隔幾年就會有新的療法提出，研究人員不計其數，只是何時能完全攻克，至今未知。2016年3月3日Science發表了一篇關于腫瘤治療的論文，文章聲稱他們鑒定出的neoantigens攜帶了癌癥發展最早期的突變，且在所有腫瘤細胞中都有表達，為了解癌癥患者對癌癥免疫療法的應答情況，實現個體化癌癥治療鋪平道路[1]。本文即對新生抗原在腫瘤治療中的應用和價值進行綜述。

1 免疫療法新領域——新生抗原

2010年，一項里程碑式的隨機臨床試驗催生了免疫療法,該試驗使用易普利姆瑪的治療手法，演示了抗體能夠阻斷CTLA-4這一檢查點，隨后研究人員利用這種治療方式治療轉移性黑色素瘤患者，并取得了令人鼓舞的成果[2]。此后，以此為基礎開展的各種研究表明T細胞介導的免疫療法對其他一系列人類惡性腫瘤有效[3]。從最初發現免疫系統能抑制癌癥生長，到后來發現癌細胞中免疫機制的多重作用，再到目前的各項臨床實驗，癌癥免疫療法頗有爭議，同時也不斷有成果出現。在臨床上只有20%的患者會對這些治療方法產生應答，免疫療法的實際應用仍有很多局限和缺點，因此尋找成功誘發免疫應答的原因是目前亟待解決的問題。

2016年3月11日，van der Burg等[4]在Nature Reviews Cancer發表綜述，討論了如何克服由腫瘤細胞內在因子和腫瘤微環境控制的免疫逃逸相關的過程，總結了如何通過改善疫苗設計、聯合疫苗與標準化療等方式使免疫治療效益最大化。通過分析一些成功免疫療法的共性，得出了3個主要因素，其中之一即腫瘤相關抗原的選擇。文章還提到，對于那些非病毒誘導的癌癥類型，選擇何種neoantigens(源于腫瘤細胞的突變)是免疫治療的重中之重。

Neoantigen，即新生抗原，是一種位于惡性細胞表面主要組織相容性復合物的抗原表位肽。這些抗原不同于正常體細胞表面的人類主要組織相容性抗原HLA，是源自腫瘤特有的突變，具有腫瘤特異性，因而能夠被T細胞識別并引起免疫應答。

大量臨床數據及各種文獻表明對于絕大部分腫瘤患者，內源性T細胞能夠對惡性細胞表面特有的抗原肽進行識別[5]。從理論上講，這樣的腫瘤排斥抗原來源有2類。其一是由T細胞耐受不完全的非變異蛋白質組成，其二是由在正常人類基因組中不存在的多肽組成，它對于正常人類基因組來說是“新的存在”。對于沒有病毒性致病源的大部分人類腫瘤，這些新的抗原表位僅由腫瘤特異性DNA的改變導致，進而形成新的蛋白質序列。

關于新生抗原的研究報道很多，2015年3月Science發文解釋了為何一種抗癌藥物只能幫助少數特定的患者，4月出現關于個體化癌癥疫苗的報道，5月又有針對突變腫瘤的癌癥免疫療法，2016年報道了針對新生抗原在癌癥免疫療法中的作用[1,6-8]。隨著研究的不斷深入，采用新生抗原治療癌癥的安全性和可靠性得到了認可，它不僅影響了現階段的免疫療法，而且直接導向了個性化醫療,因此對新生抗原的篩選鑒別及利用也逐步開展起來。

2 新生抗原的識別和篩選

新生抗原來自于腫瘤細胞的基因突變。由于突變的特異性，不同患者的腫瘤細胞突變不盡相同，由此產生的新生抗原也各不相同，這與患者DNA密切相關。為篩選需要的特定的突變產生的新抗原，需要了解單個腫瘤患者的基因組。在此基礎上，利用基因深度測序技術，通過對患者腫瘤基因組編碼的蛋白識別相應的突變，從而預測潛在的新抗原[9]。

這種通過癌細胞外顯子組測序技術的識別方式有非常高的識別率，已有實驗結果顯示，經由測序技術對新生抗原進行識別的結果假陰性的比例較低，且目前已知的絕大多數新抗原都是經由這種覆蓋足夠廣泛的外顯子組測序發現的[10]。對應抗原的基因表達水平也可被用來幫助預測抗原決定基豐度[11]。鑒別相應抗原，常用方法有重組表達cDNA克隆的血清學分析技術(serological analysis of recombinantly expressed cDNA clone)，蛋白質組學分析和抑制性消減雜交技術(suppression subtractive hybridization)。但這些實驗技術的實驗成本較高，周期較長，且受實驗材料的限制，即各種癌癥患者的血清或者腫瘤組織。

北京大學醫學部Xu等[12]與美國貝勒醫學院等單位合作，通過分析在臨床上廣泛認可和應用的經典腫瘤特異性抗原的表達譜特點，開發出一套獨特的被命名為HEPA(heterogeneous expression profile analysis)的算法。研究顯示，這種算法能有效從包含數以萬計基因的人類全基因組中篩選出與經典腫瘤特異性抗原具有相似表達譜特點的基因。且通過實驗驗證，初步得到19個新的腫瘤特異性抗原。隨后，該團隊檢測了癌癥患者血清中自發產生的對這些腫瘤抗原的特異性抗體。針對腫瘤自身特異性抗體豐度極低的特點，他們開發了一種新的血清學檢測方法PARSE (protein A/G based reverse serum ELISA) 。并發現，在約4%～11%的肺癌患者血清中，有4個新的腫瘤特異性抗原產生的自身抗體，而在健康志愿者血清中則少見。在2組獨立的肺癌患者血清中，這4種腫瘤特異性抗原聯合ROC曲線的曲線下面積均達到0.71以上，提示其可作為肺癌的聯合診斷標志物。

3 高效、活性的新生抗原選擇

新抗原是腫瘤中的突變多肽，在正常組織中是不存在的。對應于不同的突變，這些新抗原也會表現出腫瘤內異質性。其中一些屬于一級克隆(所有腫瘤細胞中都有)，還有一些是亞克隆(只存在于一部分細胞中)。即便是在所有腫瘤細胞中都表達的抗原，對免疫系統的免疫原性和抗原性也有著很大區別，有的刺激T細胞的效率很高，有的則很難以引發免疫反應，有的雖然擁有很高的活性，但卻不易與T細胞結合，比如那些沒有被有效呈遞的部分，T細胞就不能對它們進行有效識別。

免疫療法是一種通過促進內源性T細胞的能力以破壞癌細胞的治療手法，已經證明其在多種人類惡性腫瘤中的治療效果，而T細胞對腫瘤抗原的識別過程是其中重要的一環?？乖瓕細胞的免疫原性，引起免疫反應的活性強弱，是否普遍存在于所有的腫瘤細胞對最后臨床治療的效果至關重要。因此需對患者所有的腫瘤特異性抗原進行區分和篩選，選出其中最適合的一個抗原。有研究通過對免疫系統識別的那些新生抗原的效率進行分析,得到了2個結論，其一就是在大部分黑色素瘤患者中，T細胞介導的免疫系統會同時對MHC I類和MHC II類復合體上的新抗原進行反應；其二在這些癌細胞已表達的基因中，只有非常小一部分的非同義突變才能指導合成那些具有CD4+和CD8+的T細胞活性在腫瘤浸潤淋巴細胞反應能被探測到的新抗原[6，13]。最近的一項通過分析成千上萬的癌癥基因組圖譜固體腫瘤樣本的研究結果表明，結合自體MHC I類分子的突變肽比預期更少見，這一觀察結果與基于免疫的T細胞選擇一致[14]。因此，腫瘤的抗原異質性可能解釋不同患者個體對檢查點封鎖療法反應的不同。那些對檢查點封鎖療法有著持續反應的患者可能就是因為他們體內的腫瘤保留有足夠的抗原性，使得他們對伴隨癌癥免疫療法增強的免疫功能更敏感，盡管這不是由自然產生的抗腫瘤免疫反應所控制[15]。

新生抗原是源自腫瘤細胞的表達，是突變的結果，因為突變過程是不定向的，所以新抗原的形成是一個概率性的過程，那些成功表達MHCI型或II型的新抗原終究只有少數突變。再加上對于呈遞出來抗原的效果的考慮，以及腫瘤成分的微環境對新抗原誘導T細胞的影響，因此每一個新抗原都來之不易。且雖然被識別的抗原很多，但是真正能夠投入研究的新抗原依舊是屈指可數[1]。如2012年Castle 等[15]就黑色素瘤細胞系B16F10的DNA和RNA利用下一代測序技術尋找發生突變的氨基酸位點，563個突變位點選50個進行驗證，其中只有16個可以引起免疫反應，8個能引起比較強烈的特異原肽的免疫反應。

4 新生抗原在腫瘤治療之中的應用和價值

腫瘤治療如此艱難，是因為在腫瘤細胞和免疫系統之間存在著一種特殊的關系，使得腫瘤細胞可以從免疫系統的監視之中逃脫。

2002年，美國腫瘤生物學家希雷伯(R.D Schreiber)提出了一個稱之為“腫瘤免疫編輯”(cancer immunoediting)的假說。根據這一理論，免疫系統不但具有排除腫瘤細胞的能力，而且還具有促進腫瘤生長的作用。癌細胞在機體內發生、發展是一個免疫系統與癌細胞相互作用的動態過程。在這個過程中，免疫系統在清除一些腫瘤細胞的同時，也產生了一個選擇的作用，這使得了存活下來的一些腫瘤細胞的生物學特性(如腫瘤的抗原性)進行重塑(reshape)，也即所謂的“免疫編輯”。被免疫編輯過的腫瘤細胞惡性程度越來越高，對免疫攻擊的抵抗力越來越強，直至最終摧毀機體的免疫系統，造成腫瘤細胞的惡性生長并擴散[17-18]。

癌癥的免疫編輯可能發生在3個階段。首先是消除(elimination)階段，在這一階段中腫瘤細胞抗原性明顯，先天免疫系統以及適應性免疫系統共同識別發展中的腫瘤并在它臨床表現明顯之前就將其消滅。如果清除過程徹底，腫瘤細胞被完全排除，免疫編輯過程就此結束。如果一些變異的腫瘤細胞逃過了免疫編輯的“清除”作用而存活下來，它們與免疫系統的關系就進入了第二種狀態，即平衡(equilibration)階段。在平衡這一階段中剩余掩藏的沒有在消除階段被摧毀的腫瘤細胞由于免疫系統的活躍處于腫瘤休眠狀態，腫瘤細胞在免疫系統的壓力下，其基因有可能會發生變化，我們稱其為“編輯”，這種基因突變產生的“積累效應”達到一定程度時，就可能打破平穩，使之進入到下一階段——逃脫(escape)階段。這一階段受到編輯的腫瘤細胞不再被識別或是被免疫系統控制，它們開始逐步增長，誘導具有免疫抑制力的腫瘤微環境，這樣之后就呈現為臨床上明顯的癌癥。

處于逃逸階段的腫瘤細胞在這個階段的腫瘤細胞可以產生一系列惡性表型，如不能表達MHC分子，或不能產生腫瘤肽。失去相應的靶標，腫瘤細胞就使T細胞失去了對它的識別能力，使它逃脫了免疫殺傷。此外，腫瘤細胞會使自已的細胞凋亡信號通路發生變化，使免疫細胞誘導的腫瘤細胞凋亡機制失效。同時，腫瘤細胞快速生長形成的腫瘤會產生一個抑制免疫細胞的微環境，在這個微環境中，腫瘤細胞會釋放一些具有免疫抑制功能的分子，如轉化生長因子β，IL-10，等，并能誘導產生表達CTLA-4的調節T細胞，對其他免疫細胞產生抑制作用，導致免疫系統產生對腫瘤的免疫耐受。到這個階段，免疫系統的抗腫瘤機制已全面崩潰，腫瘤生長完全失控并廣泛轉移。免疫編輯的終點也就是機體的死亡。因而所謂的免疫治療就是要打破這一現狀[19]。

早期的抗腫瘤藥物，如烷化劑，金屬鉑配合物等在殺傷腫瘤細胞的同時也會大量殺傷正常細胞。隨著技術的發展，各種新型的治療方法被提出，通過針對癌癥免疫逃逸的機制，阻止其免疫編輯的過程，如抗PD-1和抗CTLA-4的藥物即通過阻斷免疫檢查點來提高免疫系統活性，而CAR-T療法和過繼細胞療法等免疫療法則是通過增強T細胞對腫瘤細胞的免疫反應，這些治療方法均在癌癥治療中取得了突出的進展。如果將這些藥物比作瞄準了腫瘤細胞的子彈，而新生抗原則是控制發射的開關。如何更有效地殺傷腫瘤細胞，避免對正常細胞的傷害，提高免疫系統對抗原的免疫原性，這一切都取決于抗原的優劣。

任何治療方法的第一步都是尋找相應的靶點，一個高活性的靶點在癌癥治療中尤為關鍵。Neoantigen則是在其中起到了一個提供免疫系統攻擊腫瘤細胞的一個重要的火力輸出點。以腫瘤睪丸癌的特異性抗原NY-ESO-1為例。今年2月，Adaptimmune 旗下用于滑膜肉瘤的靶向 NY-ESO 親和力增強型 T 細胞療法被美國 FDA 授予突破性療法資格。在主要的療效分析中，10名接受目標劑量細胞治療的患者中，有 60% 的患者產生響應，在 12 名接受任何劑量細胞治療的患者中，總有效率為 50%～90% ，接受目標劑量細胞治療的患者及 75% 的所有患者仍然存活。由此，新生抗原對于腫瘤治療的作用由此可見。和其他的療法相比，這種運用到neoantigen的免疫療法在針對腫瘤細胞的特異性以及安全性上有著巨大的優勢，治療更精準。利用抗原抗體結合的機制，能克服腫瘤細胞通過下調MHC分子表達以及降低抗原遞呈等免疫逃逸，讓腫瘤細胞無所逃遁，多靶向更精準。鑒于很多腫瘤細胞表達相同的腫瘤抗原，一旦成功找到這一系列的腫瘤抗原，便可以被廣泛利用，這大大增加了滅殺腫瘤的效果，同樣意味著對癌癥治療效率上的飛躍以及副作用的減少。另外，在臨床案例中這里同樣有足夠的證據表明腫瘤抗原的免疫優勢，免疫系統會專注于特定的抗原以至于忽略了其他的腫瘤中存在并可檢測到的抗原[20]。如果僅僅只有小部分可用新抗原就能正常地引起T細胞的反應性，那目前為止的研究分析可能低估了新抗原。

5 新生抗原與個性化治療

2015年1月20日美國總統奧巴馬宣布啟動“精準醫療計劃”(Precision Medicine Initiative)，隨后全球范圍內掀起一股精準醫療熱潮。經過了第一代的非特異性免疫治療，第二代的特異性免疫治療，人們終于邁進第三代的精準細胞免疫治療[21]。

精準醫療，其本質是一種更為精確的個性化醫療，非常適用于惡性腫瘤的臨床治療，具有巨大的應用前景，有望成為我國惡性腫瘤治療的突破口。通過高通量基因測序及大數據分析，從中篩選出能高效激活免疫反應的腫瘤特異性新抗原，根據患者的主要組織相容性復合體分型，尋找能引發強烈免疫應答的新表位(neoepitopes)，獲得針對癌細胞特異性新抗原(neoantigens)和針對新抗原表位具有高效應的精準T細胞，再通過擴增和過繼回輸治療，誘導富集 PNA-T細胞實現對腫瘤患者進行精準免疫治療[22]。

腫瘤，其本質上是一種由一系列基因變異的積累導致的復雜遺傳疾病，這意味著腫瘤的基因組是動態變化的，且存在著高度異質性。不同的疾病進展階段以及不同的腫瘤細胞可能攜帶不同的變異信息，從而對以大規模人群為基礎開發和測試藥物的治療模式形成了顛覆性挑戰。據一項覆蓋9個國家和地區的1217例患者的結果顯示：如果沒有基因檢測鑒定相關的靶標卻接受了靶向治療，死亡風險將增加185%。由此可以想象，為進一步提高癌癥的治療率，個性化治療是惡性腫瘤治療的大勢所趨。

6 展望

基于近幾年內研究獲得的數據，新生抗原在相關療法當中的作用已經被充分證明，從中可以預見到其巨大的發展前景。作為腫瘤細胞基因突變的產物，新生抗原在免疫系統攻擊腫瘤細胞時將起到重要的靶向作用，進而為個性化的癌癥免疫療法提供了高度特異性和安全性。與普通的靶向療法相比，這種借助自身免疫系統對腫瘤細胞進行攻擊的方法無疑更為安全可靠。而如何篩選更為高效的新抗原，有選擇性地提高這一免疫應答，對未來治療干預方案的設計，是未來研究工作的重點。

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(編校：吳茜)

Recent advances of neoantigen in tumor therapy

LIU Zhi-hao, NI Shi-xin, HE Si-yuan, CHEN Shu-qingΔ

(College of Pharmaceutical Science, Zhejiang University, Hangzhou 310000, China)

As the research work went further and more detailed, a variety of new treatments compete to come out.However, it remains unclear that how the antigen works to distinguish cancer cells and normal cells. Neoantigen, which is located in the tumor cell surface of a specific antigen, its presence makes human immunotherapy into new areas which may make personalized treatment possible in the near future. Emerging data suggest that the identification of such newantigens is a major factor in clinical immunotherapy. They can form a biomarker in cancer immunotherapy to provide targets for a variety of therapeutic approaches to attack, which allows T cells to selectively enhance the immune response against this class of antigens.

neoantigen; accurate cellular immunotherapy; antigenic epitope; immune function

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.12.003

劉郅皓，男，本科，研究方向：新生抗原的腫瘤精準醫療技術，E-mail：1164728596@qq.com；陳樞青，通信作者，男，博士，教授，博士生導師，研究方向：基于基因多態性、體細胞突變和新生抗原的腫瘤精準醫療新技術研究，新型抗體藥物和抗體偶聯藥物的設計及研究，E-mail：Chenshuqing@zju.edu.cn。

R730.51

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