外翻腸囊法研究奧硝唑對映體在大鼠不同腸段的吸收特性

王嫦鶴, 劉雪峰，王　莉, 耿慶光

(陜西省食品藥品檢驗所，西安　710061)

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·藥物分析·

外翻腸囊法研究奧硝唑對映體在大鼠不同腸段的吸收特性

王嫦鶴, 劉雪峰，王莉, 耿慶光

(陜西省食品藥品檢驗所，西安710061)

摘要：目的考察奧硝唑在大鼠各腸段的吸收特性及奧硝唑兩手性對映體在大鼠不同腸段吸收的差異性。方法采用大鼠外翻腸囊法，以HPLC手性色譜柱法測定奧硝唑在不同腸段的吸收量以及S-奧硝唑及R-奧硝唑的同一腸段腸吸收量，并分別計算吸收速率常數(Ka)和表觀滲透系數(Papp)，同法考察了P-蛋白抑制劑(維拉帕米和環孢素A)對奧硝唑腸吸收特性的影響。結果奧硝唑在不同腸段吸收均呈線性，符合零級藥物吸收速率，吸收趨勢為空腸>回腸>結腸。在空腸段兩對映體以近于1∶1的比例同時吸收，吸收速率不存在顯著差異，隨著供試液中奧硝唑質量濃度的上升，Ka呈線性增加(R2>0.99)，Paap基本保持不變，P-蛋白抑制劑對奧硝唑的腸吸收沒有顯著性影響(P>0.05)。結論奧硝唑在不同腸段的吸收有差異，空腸部位是吸收的最佳部位(P<0.05)，S-奧硝唑與R-奧硝唑在腸道中吸收速率不存在顯著差異，吸收以被動擴散機制為主，奧硝唑不是P-糖蛋白的底物。

關鍵詞：奧硝唑；腸外翻；對映體；P-糖蛋白

奧硝唑是硝基咪唑類藥物，結構中有一個手性中心，故有一對手性對映體。目前臨床上使用的大多是奧硝唑的消旋體，其抗厭氧菌的作用比甲硝唑更強[1]。研究報道[2]，左旋奧硝唑[S-(-)-1-(3-氯-2-羥丙基)-2-甲基-5-硝基咪唑]是奧硝唑的L-型對映體，其藥動學特性優于奧硝唑的消旋體，但毒性、中樞抑制作用均低于右旋體和消旋體。因此，左旋奧硝唑的研究和應用也越來越受到研究者的重視[3]。為深入探討奧硝唑的腸吸收特性，本文采用大鼠腸外翻模型，研究了奧硝唑在不同腸段的吸收及奧硝唑S-奧硝唑和R-奧硝唑在腸道中的吸收情況，為闡明奧硝唑對映體的腸吸收動力學機制、指導臨床用藥和提高臨床療效提供實驗依據。

1儀器與材料

1.1儀器島津Nexera UHPLC LC-30A高效液相色譜儀(含New LC-30AD泵系統、SIL-30AC自動進樣器、CTO-20AC柱溫箱、SPD-20A紫外檢測器、CBM-20A控制器、Empower色譜數據理系統)；Chiralcel OB-H手性色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，日本Daicel Chemical IND公司)；Allegra 64R低溫高速離心機(美國 Beckman Coulter 公司)；JXDC-20型氮吹儀(上海凈信科技有限公司)；Direct-Q3型超純水機(默克化工技術(上海)有限公司)；DK-98-IIA恒溫水浴鍋(天津泰斯特儀器有限公司)；AB135-S型電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司)； XH-C型渦旋振蕩器(南京東邁科技儀器有限公司)；混合氣體(95%O2，5%CO2)。

1.2試藥奧硝唑消旋體對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：100608-201102);左旋奧硝唑對照品(S-奧硝唑，中國食品藥品檢定研究院，批號：100874-200501);右旋奧硝唑對照品(R-奧硝唑，光學質量分數>99. 5%)由南京圣和藥業有限公司提供；鹽酸維拉帕米(verapamile，Ver，中國食品藥品檢定研究院，批號：100223-200102)；環孢素A(cycloporine，CsA，中國食品藥品檢定研究院，批號：30495-200202)；甲醇、正己烷和異丙醇均為德國 Merck公司色譜純試劑。

1.3實驗動物雄性SD大鼠，體質量250±20 g，西安交通大學醫學實驗動物中心提供(SCXK(陜)2012-003)。

2實驗方法

2.1色譜條件色譜柱：Daicel Chiralcel OB-H手性柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：正己烷-異丙醇-甲醇(95∶1∶4)；進樣體積：5 μL；柱溫：30 ℃；流速：0.5 mL·min-1；檢測波長：318 nm。

2.2溶液的配制臺氏液(Tyrode液)：稱取氯化鈉8.0 g，氯化鉀0.2 g，碳酸氫鈉1.0 g，磷酸二氫鈉0.05 g，氯化鎂0.1 g，加蒸餾水溶解；稱取氯化鈣0.2 g，加蒸餾水溶解；稱取葡萄糖1.0 g，加蒸餾水溶解；混勻，用蒸餾水定容至1 L即得。

混合對照品儲備溶液：分別精密稱取S-奧硝唑和R-奧硝唑對照品適量，用流動相配制成質量濃度均為100 μg·mL-1的溶液作為混合對照品儲備溶液。

奧硝唑供試液：精密稱取奧硝唑對照品適量，加臺氏液超聲溶解并定容，分別制備成質量濃度約為5，10，25，50和100 mg·L-1的等系列溶液作為奧硝唑供試液。

含Ver的奧硝唑供試液：精密稱取奧硝唑對照品適量，加適量臺氏液超聲溶解，向其中分別加入Ver適量，用臺氏液定容，制備成含100 μg·mL-1的Ver及5，25和50 μg·mL-1奧硝唑的供試液。

含CsA的奧硝唑供試液：精密稱取奧硝唑對照品適量，加適量臺氏液超聲溶解，向其中分別加入CsA適量，用臺氏液定容，制備成含100 μg·mL-1的CsA及5，25 和50 μg·mL-1奧硝唑的供試液。

2.3大鼠翻轉腸囊實驗大鼠隨機分組，每組5只，實驗前禁食12 h，自由飲水。采用文獻報道[4]的翻轉腸囊法實驗。在給藥后 30，45，60，90，120和180 min從腸囊內取樣1 mL，同時補充相同體積的空白臺氏液。樣品置于5 mL帶蓋離心試管中，加入乙酸乙酯200 μL，漩渦振蕩3 min，以13 000 r·min-1離心5 min;分取上層有機層，用乙酸乙酯重復萃取2次，合并有機層，氮吹儀吹干除去乙酸乙酯；加流動相200 μL溶解，以0.45 μm微孔濾膜過濾，取續濾液5 μL進樣分析，測定樣品中S-奧硝唑及R-奧硝唑含量。實驗結束后將腸管縱向剖開，自然攤于濾紙上，測量長度和寬度，記錄腸段吸收面積A。

2.4線性實驗取混合對照品儲備液，用流動相逐級稀釋，配制成質量濃度分別為0.5～150 μg·mL-1的系列溶液作為線性溶液。分別精密量取該系列溶液5 μL，按照2.1項下的色譜條件進樣分析。以對照品溶液質量濃度X為橫坐標、峰面積Y為縱坐標，繪制標準曲線，進行線性回歸。R-奧硝唑回歸方程：Y=34 716X-6.4×105(r=0.999 5)，線性范圍：0.5～150 μg·mL-1；S-奧硝唑回歸方程：Y=34 598X-6.4×105(r=0.999 2)，線性范圍：0.5～150 μg·mL-1。

2.5數據處理

2.5.1藥物累積吸收量按照下式計算。

Q為藥物各時間的累積吸收量，Cn為n時間點的實際檢測質量濃度，Vs為取樣體積，Ci為樣品質量濃度。

3結果

3.1高效液相測定方法Chiralcel OB-H手性柱可用于分離含有酰胺基、芳香基團、羰基、硝基、磺?；?、氰基和羥基類化合物。流動相中甲醇和異丙醇的變化對分離度影響較大，且異丙醇的比例過小會出現溶液分層現象。臺氏液對奧硝唑的測定無干擾，專屬性較好，見圖1。

圖1奧硝唑手性分離HPLC圖

A.奧硝唑對照品; B.腸吸收液樣品; C.臺氏液空白; 1.R-奧硝唑; 2.S-奧硝唑

Fig.1 HPLC chromatograms of ornidazole analyzed by chiral chromatographic column

A.reference substance of ornidazole；B.sample of intestinal absorption; C.blank sample; 1.R-ornidazole; 2.S-ornidazole

3.2奧硝唑在不同腸段的吸收情況取同一大鼠的不同腸段置于2.2項下25 μg·mL-1的奧硝唑供試液中進行實驗，結果表明，奧硝唑在空腸、回腸和結腸均有不同程度的吸收，并且在同一腸段累計吸收量隨時間延長呈線性增加，兩對映體在180 min內均未呈現飽和?；貧w分析結果表明，兩對映體在不同腸段的吸收與時間呈線性關系，相關系數(R2) 均大于 0.9，符合零級藥物吸收速率。

奧硝唑在空腸段的Ka和Papp分別為0.039±0.012 μg·cm-2·min-1和0.001 3±0.000 4 cm·min-1，均高于回腸段0.020±0.008 μg·cm-2·min-1和0.000 75±0.000 16 cm·min-1(P<0.05)以及結腸段0.009 8±0.002 6 μg·cm-2·min-1和0.000 39±0.000 09 cm·min-1(P<0.05)。結果表明，奧硝唑在不同腸段吸收趨勢為：空腸>回腸>結腸。3.3S-奧硝唑和R-奧硝唑在腸道中的吸收差異取大鼠的空腸部位置于2.2項下不同質量濃度的奧硝唑供試液中進行實驗，結果表明，S-奧硝唑或R-奧硝唑在空腸中的累積吸收量(Q)隨時間延長均呈線性增加。隨著時間的增長，S-奧硝唑與R-奧硝唑在腸道中吸收速率不存在顯著差異，而是以接近于1∶1的比例同時吸收；隨著供試液中奧硝唑質量濃度的上升，Ka呈線性增加(R2>0.99)，Paap基本保持不變，表明奧硝唑的吸收以被動擴散機制為主。結果見表1。

3.4P-gp抑制劑對奧硝唑腸吸收的影響取大鼠的空腸部位置于2.2項下含Ver和CsA的奧硝唑供試液中進行實驗，結果表明，相對于空白組，含Ver的奧硝唑供試液在空腸中的Ka和Papp分別為0.059±0.016 μg·cm-2·min-1和0.001 8±0.000 9 cm·min-1，稍高于空白組的0.049±0.012μg·cm-2·min-1和0.001 3±0.000 4 cm·min-1，但差異無統計學意義(P>0.05)。含CsA的奧硝唑供試液在空腸中的Ka和Papp分別為0.048±0.015 μg·cm-2·min-1和0.000 9±0.000 6 cm·min-1，與空白組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。表1空腸中S-奧硝唑與R-奧硝唑的吸收特性比較

Tab.1 Comparison of the absorption characteristics of S-ornidazole and R-ornidazole at jejunum

±s，n=3)

4討論

文獻報道[5-6]，由于離體腸囊體外時間過長可能會失去生理活性，導致腸囊的通透性發生變化，因此目前離體組織實驗多在60～90 min內。研究結果表明，奧硝唑在空腸、回腸和結腸均有吸收，各個腸段Papp均大于1×10-4cm·min-1，空腸是奧硝唑腸吸收的最佳部位。隨著供試液中奧硝唑質量濃度增加，藥物吸收速率常數Ka呈線性增加(R2>0.94)，其表觀滲透系數Paap不變，表明奧硝唑的吸收以被動擴散吸收機制為主。

大鼠翻轉腸囊吸收實驗結果顯示，S-奧硝唑與R-奧硝唑在腸道中的吸收速率基本一致，不存在顯著性差異。有研究報道[7]，S-奧硝唑和R-奧硝唑在大鼠體內的藥代動力學特性存在一定的差異，奧硝唑口服給藥后，S-奧硝唑和R-奧硝唑的t1/2分別為2.49和3.42 h，AUC分別為168.21和207.19 μg·min·mL-1，這些差異可能與S-奧硝唑與R-奧硝唑在大鼠體內的代謝速度不同有關。

本實驗中，空腸段是奧硝唑吸收的最佳部位，選取空腸進一步探究了P-蛋白抑制劑對奧硝唑吸收的影響。從數據結果可知，P-蛋白抑制劑對奧硝唑的吸收沒有明顯影響，結果說明奧硝唑不是P-糖蛋白的底物。參考文獻：

[1]田懷平, 馬小亞, 王美納.奧硝唑在兔體內的藥動學和生物利用度研究[J].西北藥學雜志，2005，20(3)：104-106.

[2]孫繼紅，王志強，顧興麗，等.左旋和右旋奧硝唑對小鼠中樞神經系統毒副作用的比較研究[J].中國藥科大學學報，2008,39(4)：343-347.

[3]陳憶冰，李健和，黎銀波，等.左旋奧硝唑氯化鈉注射液細菌內毒素檢查[J].西北藥學雜志，2006,22(3)：141-142.

[4]董宇，張英豐，楊慶，等.戊己丸提取物不同配伍的腸外翻吸收研究[J].中國藥理學通報,2010,26(10)：1377-1382．

[5]郭竹君，崔志清，段宏泉.縛管翻轉腸囊法研究委陵菜黃酮在大鼠小腸內的吸收行為[J].天津醫科大學學報，2009,15(3)：348-350．

[6]何卉，陳西敬，王廣基.藥物轉運體在反式白藜蘆醇腸道吸收中的作用[J].中國藥科大學學報,2008,39(4)：324-328．

[7]陳燕，石濤，柳曉泉，等.左旋和右旋奧硝唑在大鼠體內的藥代動力學[J].中國藥科大學學報，2006,37(1)：41-44.

基金項目：陜西省社會科學基金項目(編號：13G020)

作者簡介：王嫦鶴，女，博士，副主任藥師

*通信作者：耿慶光，女，副主任藥師

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2016.04.013

中圖分類號：R945

文獻標志碼：A

文章編號：1004-2407(2016)04-0371-04

(收稿日期：2015-09-22)

Study on the absorption characteristics of ornidazole enantiomers at different intestine segments by isolated in vitro-everted intestine model

WANG Changhe, LIU Xuefeng, WANG Li, GENG Qingguang*

(Shaanxi Institute for Food and Drug Control, Xi′an 710061, China)

Abstract:Objective To study the absorption characteristics of ornidazole and the absorption difference of ornidazole enantiomers at different intestine segments by isolated in vitro-everted sac intestine model, and to investigate the effect of P-inhibitors to ornidazole intestinal absorption.Methods Rat in vitro-everted intestine sac was used to determine the characteristics of ornidazole.The concentration of ornidazole and its enantiomers at different intestine segments were determined by HPLC equipped with chiral chromatographic column.Then the constant of absorption rate(Ka) and the apparent permeability coefficient(Papp) were calculated.Same method was applied in investigating the impact of the P-glycoprotein inhibitors(verapamil and cyclosporin A) on the absorption of ornidazole in intestinal segments.Results The absorption of ornidazole in different intestinal segments showed a linear absorption and complied with the zero order kinetics.The descending order of ornidazole absorption was jejunum, ileum and colon.There was no significant difference among the absorption rate of the two enantiomers.Ka increased linearly(R2>0.99) and Paapremained unchanged with the rise of concentration for ornidazole in solution at jejunum.P-protein inhibitors had no significant effect on the intestinal absorption(P>0.05).Conclusion The absorption of ornidazole in different intestinal segments was different and the Ka and Paapat jejunum were significantly higher than that at the other segments of intestine (P<0.05).There was no significant difference between S-ornidazole and R-ornidazole in the intestinal absorption rate and met the passive transport mechanism.Ornidazole would not be the substrate of P-protein inhibitor.

Key words：ornidazole; intestinal eversion; enantiomer; P-protein inhibitor