一種油茶葉脈臨時裝片制作與顯微觀察方法

廖 陽 殷小林 許路路 閆榮玲

(湖南科技學院化學與生物工程學院 永州 425199)

葉片作為光合作用的場所，對于植株的正常生長發育、新陳代謝等生命活動意義重大。葉脈是葉片中的維管組織，如同動物體內的“毛細血管”，為葉片輸送水分與無機離子。不同進化地位及不同種類植物的葉脈特征存在不同程度差異[1，2]。人們提出了一系列性狀指標來表征葉脈的結構特征及其對葉片功能的影響[3]。研究表明，葉脈的結構特征一方面會受到環境因子如水分、溫度、光照等因素的影響[3，4]；另一方面，葉脈的形態特征也是植株是否健康的重要表征[5～7]。因此，葉脈分析是植物學研究的一個重要要素。作為一種木本油料作物，油茶(Camelliaoleifera)的葉片除了常綠、光滑、邊緣鋸齒等特點外，還表現出葉厚、覆蠟、革質等特征，不利于其葉脈的觀察。本文通過對已有方法進行改進，摸索建立一種簡單易行的油茶葉脈顯微觀察的方法，可為開展相關研究提供參考。

1 實驗原理

油茶葉片分別置于一定濃度的乙醇和氫氧化鈉溶液進行煮沸處理。在煮沸過程中，葉肉細胞逐漸被破壞，同時乙醇和氫氧化鈉會使細胞中的蛋白質變性，破壞葉片中的色素并對組織產生腐蝕作用，從而加快了葉肉細胞的破損速度。前期摸索確定乙醇與氫氧化鈉的濃度分別均為80%與80%。但在此過程中，葉脈作為維管組織，較難破壞而得以保留其形態與分布特征。

2 實驗材料、器材與試劑

實驗材料：新鮮油茶葉片。

實驗器材：光學顯微鏡、恒溫水箱、鑷子、電子天平、容量瓶(500 mL)、燒杯、藥匙、稱量紙、剪刀、玻璃棒、量筒。

實驗試劑：75%乙醇溶液(現配)、80%NaOH溶液(現配)。

3 操作步驟

(1)取新鮮油茶葉片，清水洗凈備用。

(2)將配置好的75%乙醇與80%NaOH溶液，置于恒溫水箱中加熱至沸騰。

(3)將風干的新鮮油茶葉片置于煮沸的75%乙醇中，5min后用鑷子取出置干自來水下沖洗至無明顯變化。

(4)再將葉片置于煮沸的80% NaOH溶液中，15～20 min后用鑷子取出置干自來水下沖洗至葉肉全部脫落。若葉肉未能洗脫完全，可再次放入煮沸的NaOH中處理，并根據情況確定持續時間(5～10min)，直至呈現出完整、清晰的葉脈網絡。整個過程中不需要其他工具對被破壞的葉肉進行額外處理。

(5)將得到的葉脈用吸水紙輕輕吸干，置于載玻片上進行顯微觀察(與拍照)。

4 實驗結果

如圖1所示，經上述步驟處理后，在顯微鏡下可以清晰地觀察到油茶葉片的葉脈形態特征與網絡分布。從圖上可以看出，油茶葉片的葉脈密度較大，幾乎布滿整個葉片。根據葉脈直徑，可明顯分為三級，分別是Ⅰ級大葉脈(箭頭所示)，Ⅱ級：中葉脈(圓圈所示)，Ⅲ級：細葉脈(矩形所示)。

圖1 油茶葉片葉脈分布與形態特征(40倍)

顯示：Ⅰ級大葉脈(箭頭所示)，Ⅱ級：中葉脈(圓圈所示)，Ⅲ級：細葉脈(矩形所示)。

5 注意事項

(1)試驗中用到強堿溶液，在試劑配制以及煮沸過程中要注意安全，防止液體飛濺到皮膚或眼睛。

(2)實驗中若在NaOH溶液持續煮沸15～20 min后，存在部分葉肉不能直接沖掉的個別情況時，只需再次放入延長煮沸3～5 min即可。

(3)實驗所用試劑需現配現用。

(4)裝片置載玻片上時，需小心展平。

6 小結

油茶葉片的葉片表面覆蓋蠟質，且葉片較厚，顏色較深。因此，要獲得完整、清晰、無雜質的葉脈臨時裝片相對較難。因此，在實驗方案確定過程中，一方面把乳酸或碳酸氫鈉等試劑換成了強堿性的氫氧化鈉[8]。另一方面，加大乙醇與氫氧化鈉的濃度，均達到或超過75%。由圖可知，這種針對油茶葉片(以及具有類似特征的植物葉片)的葉脈顯微觀察方法有效可行，所獲裝片的葉肉清除徹底，葉脈完整無損，在顯微鏡下可清晰觀察到葉脈的整體分布，根據葉脈粗細可劃分其為不同等級。值得注意的是，在葉片經過上述實驗步驟的處理后，直接在自來水下進行沖洗即可去除全部葉肉組織，不需其他額外操作(如用牙刷輔助去除葉肉)，這樣可以最大限度地保護葉脈的完整性。