液相色譜-串聯質譜聯用法測定人血漿中頭孢地尼的濃度及生物等效性研究

汪難喜，翟學佳，朱超然，陳　芬，張新林，呂永寧

(華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院藥劑科，湖北 武漢　430022)

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·論著·

液相色譜-串聯質譜聯用法測定人血漿中頭孢地尼的濃度及生物等效性研究

汪難喜*，翟學佳，朱超然，陳芬，張新林，呂永寧#

(華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院藥劑科，湖北 武漢430022)

目的：建立液相色譜-串聯質譜聯用法(liquid chromatography-tandem mass spectrum，LC-MS/MS)測定人血漿中頭孢地尼的濃度，評價健康人餐后服用2種頭孢地尼顆粒的生物等效性。方法：24例男性健康志愿者餐后隨機交叉單劑量口服頭孢地尼顆粒受試制劑或參比制劑，LC-MS/MS法測定頭孢地尼體內血藥濃度。采用藥動學軟件DAS對其藥動學參數及等效性進行計算和評價。結果：頭孢地尼在10.14～1 267.50 ng/ml質量濃度范圍內線性良好(r>0.999)，最低下限為10.14 ng/ml；日內、日間精密度RSD分別≤1.78%、3.75%。受試制劑和參比制劑的主要藥動學參數包括: 藥-時曲線下面積(AUC)0～t分別為(4 284.81±1 150.02) 和(4 479.97±1 333.70) μg·h/L，AUC0～∞分別為(4 425.56±1 173.44) 和(4 632.83±1 369.83) μg·h/L，半衰期分別為(1.81±0.25)和(1.83±0.26) h，達峰時間分別為(3.70±0.71)和(3.73±0.51) h，峰濃度分別為(814.67±250.92)和(870.80±281.99) ng/ml。結論：該方法分析快速、靈敏、準確，適用于人血漿中頭孢地尼濃度的測定，可成功用于頭孢地尼顆粒生物等效性的評價。

頭孢地尼顆粒； 液相色譜-質譜/質譜聯用； 生物等效性； 藥動學

頭孢地尼具有抗菌譜廣、不良反應少的特點，臨床上廣泛用于上、下呼吸道感染和泌尿道感染的治療[1-3]。其對各種細菌產生的β-內酰胺酶穩定，對革蘭陽性菌中的葡萄球菌屬、鏈球菌屬等的抗菌活性比第1、2代口服頭孢菌素更強[4-5]。近年來，國內外對頭孢地尼血漿濃度的測量方法有高效液相色譜-紫外分光光度法和液相色譜-串聯質譜聯用法(liquid chromatography-tandem mass spectrum,LC-MS/MS)等[6-11]，但都存在一定的局限性，如樣本處理過程復雜[7]、采用比較昂貴的固相萃取法[8]或檢測時間長[9-10]等。本研究建立了快速、靈敏、準確的LC-MS/MS法測定頭孢地尼血漿濃度，并應用于受試和參比制劑頭孢地尼顆粒在健康人體餐后的藥動學和生物等效性研究，以期為臨床用藥提供參考。

1　材料

1.1儀器

Agilent 1200型高效液相色譜儀，含在線脫氣機(G1322A)、高壓四元泵(G1311A)、自動進樣器(G1329A)、柱溫箱(G1316A)；API 4000 型四級桿串聯質譜儀(美國ABI公司)，配備電噴霧離子化源(ESI)；色譜工作站: Analyst 1.6.1；AUW220D型天平(日本島津公司)。

1.2藥品與試劑

受試制劑：頭孢地尼顆粒(批號：311130108，規格：50 mg/袋) 由石家莊華新藥業有限責任公司提供；參比制劑：頭孢地尼顆粒(批號：025310；規格：100 mg/袋)購自日本藤澤公司；頭孢地尼標準對照品(批號：130502-201403，含量為98%)、頭孢克洛標準對照品(批號: 130481-200503，含量為93.2%) 由中國食品藥品檢定研究院提供。

2　方法與結果

2.1色譜條件

分析柱：Waters AtlantisTMdC18柱 (2.1 mm×150 mm，5 μm)，預柱:Phenomenex C18保護柱(4 mm×3.0 mm，5 μm)；流動相 ∶甲醇-0.3%甲酸水溶液(V∶V=38 ∶62)；洗脫方式：等度洗脫；流速: 0.3 ml/min；進樣量: 10 μl；柱溫：40 ℃；進樣器溫度：4 ℃。

質譜采用正離子電噴霧離子源，以多反應監測方式進行定量分析。離子噴射電壓：5 500 V；溫度：550 ℃；源內氣體1壓力：344.75 kPa；氣體2壓力：344.75 kPa；氣簾氣壓力：172.37 kPa；碰撞氣壓力：41.37 kPa；掃描方式為質譜多反應監測；頭孢地尼和內標頭孢克洛在正離子模式下定量分析離子對分別為：396.2→227.1和368.1→174.2，解簇電壓分別為60 和69 V，碰撞能量分別為19和18 V，離子掃描質譜圖見圖1。

圖1　頭孢地尼(A)與內標頭孢克洛(B)的二級全掃描質譜圖Fig 1　Representative product ion scan spectra of cefdinir (A) and cefaclor (B) in positive ionization mode

2.2對照品溶液的配制

2.2.1頭孢地尼儲備液:精密稱定頭孢地尼對照品9.75 mg，置于10 ml容量瓶中，用10 mmol/L的乙酸銨溶液溶解并定容，得到975 μg/ml頭孢地尼的儲備液，于4 ℃冰箱保存備用，使用時進一步稀釋至濃度適當的工作液。

2.2.2頭孢克洛(內標)儲備液：精密稱定頭孢克洛對照品，加10 mmol/L的乙酸銨溶液溶解并稀釋至刻度，制備成132 μg/ml的頭孢克洛儲備液，于4 ℃冰箱保存備用，使用時用10 mmol/L的乙酸銨溶液稀釋成5 280 ng/ml的內標工作液。

2.3血漿樣品的處理

精密吸取血漿200 μl，加入內標工作液20 μl(頭孢克洛，5 280 ng/ml)，加入10 mmol/L的乙酸銨溶液20 μl，渦旋30 s混勻，再加入500 μl甲醇沉淀蛋白，渦旋1 min，14 800 r/min轉速下離心15 min，取上清液用等量10 mmol/L的乙酸銨溶液溶稀釋，渦旋30 s混勻、14 800 r/min轉速下離心5 min，取上清進行分析，并記錄色譜圖。

2.4專屬性試驗

分別取6批空白血漿、血漿加對照品、服藥后的血漿樣品，按照“2.3項”下操作，在“2.1項”的條件下，頭孢地尼與內標的保留時間分別為2.6、2.8 min，見圖2。血漿中內源性物質均不干擾樣品峰，方法專屬性良好。

2.5基質效應與提取回收率

取空白血漿樣品200 μl，加入10 mmol/L的乙酸銨溶液20 μl，加入500 μl甲醇沉淀蛋白，渦旋1 min，14 800 r/min轉速下離心15 min，取上清加入頭孢地尼低、高質控溶液(濃度分別為：30、1 000 ng/ml)及內標溶液20 μl，渦旋30 s，取上清液用10 mmol/L的乙酸銨溶液等量稀釋，混勻、離心，取上清液進樣分析。所得的峰面積與以200 μl的10 mmol/L乙酸銨溶液代替空白血漿同法處理后的峰面積進行比較，以評價方法的基質效應。低、高2個濃度頭孢地尼血漿樣本中的基質效應為(67.20±5.82)%和(53.37±7.9)%，內標頭孢克洛的基質效應為(69.95±11.25)%。經內標歸一化后，低、高2個濃度基質效應因子RSD為6.88 %和5.27 % (n=6)，均不超過15%。配制成頭孢地尼濃度各為30、300、1 000 ng/ml低、中、高3個質量濃度的血漿樣品各6份。按照“2.3項”下操作，進樣測定，所得的峰面積與經過處理后血漿上清再加入同量的質控標準溶液比較，以評價方法的提取回收率。低、中、高3個質量濃度血漿樣本中頭孢地尼的提取回收率分別為(93.79±2.57)%，(77.38±4.91)% 和(81.46±4.82)%；RSD分別為2.17%、4.22%、3.22%。同法測得內標提取回收率為(80.86 ±1.63)%，RSD為3.24%。

2.6線性范圍和定量限

取空白血漿200 μl，依次加入頭孢地尼系列標準溶液20 μl，配制成相當于頭孢地尼質量濃度為10.14、50.70、126.75、253.50、430.95、887.25、1 267.50 ng/ml的血漿樣品。按照“2.3項”下操作，處理血漿樣品，記錄色譜圖；以待測物與內標物的峰面積比值(f)為縱坐標，待測物濃度(C)為橫坐標，用加權(W=1/x2) 最小二乘法進行回歸運算，得到標準曲線方程為:Y=0.004 84X+0.029 6(r=0.999 2)，線性范圍為10.14～1 267.50 ng/ml，以信噪比為10 確定定量限，該方法的定量限為10.14 ng/ml。

A.空白血漿；B.空白血漿+頭孢地尼及內標；C.受試者口服頭孢地尼顆粒100 mg 后3.5 h 的血漿樣本 Ⅰ.頭孢地尼；Ⅱ.頭孢克洛A. Blank plasma sample; B. Blank plasma sample+cefdinir; C. Plasma sample from the volunteer 3.5 h after administration of 200 mg of cefdinir; Ⅰ.Cefdinir; Ⅱ. Cefaclor圖2　頭孢地尼與內標頭孢克洛的典型色譜圖Fig 2　Typical chromatograms of cefdinir and cefaclor

2.7精密度和準確度試驗

按照“2.3項”下操作，處理定量下限、低、中、高4個質量濃度的血漿模擬樣本，每一濃度平行測定6份，連續測定6 d。根據同一分析批的標準曲線，計算質控樣本的測定濃度，分析日內、日間精密度和準確度，見表1。批內、批間RSD均<15%，RE均在(±15%)的范圍內。

2.8殘留效應

測定定量上限樣本之后, 隨后測定1個空白血漿樣本和1個定量下限樣本，平行3次，來考察方法的殘留效應。頭孢地尼和內標的殘留效應因子分別為10.7%和0%，滿足分析要求。

2.9穩定性試驗

分別考察低、高2個質量濃度的質控樣品在不同條件下血漿樣本的穩定性。結果表明含頭孢地尼的血漿樣品在上述條件穩定性良好，見表2。

表1　血漿中頭孢地尼的精密度和準確度試驗結果(n=6)

表2　各種條件下低、高濃度頭孢地尼穩定性試驗結果(n=6)

3　生物等效性研究

3.1受試者的選擇

24名中國健康男性受試者，平均年齡(23.54±2.26)歲，平均身高(173.00±6.06)cm，平均體質量(67.00±4.78)kg，平均體質量指數(22.39±1.17)kg/m2。試驗前進行病史詢問和體格檢查，血常規、尿常規、肝腎功能及心電圖檢查等結果均正常。試驗前2周及試驗期間未服用任何藥物，試驗期間禁煙酒或含咖啡因的飲料。試驗前皆在了解本研究的目的、意義、步驟、利益和可能發生的損害后簽署知情同意書。本試驗方案通過華中科技大學同濟醫學院醫學倫理委員會審查。

3.2血藥濃度測定和等效性評價

本試驗采用雙周期自身交叉對照試驗設計，24名受試者隨機分為2組，每組每次試驗餐后單次口服受試制劑或參比制劑，2次試驗間的清洗期為1周。受試者于前1 d入住，晚餐統一清淡飲食，禁食10 h、不禁水過夜。次日早晨攝入標準早餐(饅頭約100 g、稀飯約150 ml、菜籽油約20 ml、烹飪的豬肉75 g、煎蛋1枚及蔬菜100 g)；餐后30 min，用250 ml溫開水送服口服受試制劑或參比制劑(100 mg)。于服藥后1.0、2.0、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、7.0、8.0、10.0和12.0 h各取血1次，每次約4 ml，置于含乙二胺四醋酸的抗凝管中，30 min內14 800 r/min轉速下離心10 min，分離血漿，置于-80 ℃冰箱備用。

采用DAS 3.2.7軟件處理數據，計算餐后單次口服頭孢地尼受試制劑和參比制劑的主要藥動學參數(見表3、圖3)。對受試制劑和參比制劑的平均藥動學參數峰濃度(Cmax)、藥-時曲線下面積(AUC)0～t、AUC0～∞經對數轉換后進行方差分析，并采用雙向單側t檢驗及[1-2α]%置信區間法進行生物等效性評價，其中達峰時間(Tmax)采用非參數法(Wilcoxon符號秩檢驗)檢驗法。結果表明：Cmax、AUC0～t、AUC0-∞均拒絕生物不等效假設；對受試制劑，經對數轉換后的Cmax、AUC0～t、AUC0～∞的90%置信區間分別為79.8%～110.4%、85.1%～109.8%、85.3%～109.4%，受試制劑與參比制劑的Tmax經非參數法檢驗，差異無統計學意義(P>0.05)，表明餐后口服受試制劑和參比制劑具有生物等效性。

參數測試值參考值半衰期(t1/2)/h1.81±0.251.83±0.26tmax/h3.70±0.713.73±0.51Cmax/(μg/L)814.67±250.92870.80±281.99AUC0～t/(μg·h/L)4284.81±1150.024479.97±1333.70AUC0～∞/(μg·h/L)4425.56±1173.444632.83±1369.83

圖3　24例健康受試者口服參比制劑和受試制劑后血漿頭孢地尼平均血藥濃度-時間曲線Fig 3　Mean plasma concentration-time profiles of oral test or reference preparation in 24 male volunteers

4　討論

本研究根據等效性研究與生物樣品處理的指導原則[12]，建立了測定人血漿頭孢地尼濃頭度的LC-MS/MS法。該法分析時間短(<3.5 min)，靈敏度高，定量下限達到10 ng/ml，且專屬性強，適合于頭孢地尼人體藥動學與生物等效性等研究中生物樣品的分析測定。在血漿樣本的處理方面，比較了液-液萃取法與蛋白沉淀法，發現蛋白沉淀法處理血漿樣品，方法簡單、快速、成本低，且回收率更好。同時，乙酸銨溶液能提高頭孢地尼的檢測靈敏度，將用甲醇沉淀后上清液與10 mmol/L的乙酸銨溶液等體積稀釋進樣時，靈敏度大大提高。試驗過程中發現，流動相中加入適量的甲酸有助于改善色譜峰的脫尾現象。

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LC-MS/MS Method for Determination of Cefdinir in Human Plasma and the Bioequivalence Study

WANG Nanxi, ZHAI Xuejia, ZHU Chaoran, CHEN Fen, ZHANG Xinlin, Lü Yongning

(Dept.of Pharmacy, Union Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology, Hubei Wuhan 430022, China)

OBJECTIVE：To establish a liquid chromatography-tandem mass spectrum(LC-MS/MS) method for deter-mination of cefdinir in human plasma, and to evaluate the bioequivalence after taking cefdinir granules in healthy volunteers. METHODS: A single dose of cefdinir granules of test or reference preparation were administered orally in 24 healthy male volunteers according to the randomized, two-way cross-over study. LC-MS/MS was adopted to determine the cefdinir concentration in human plasma. And the pharmacokinetic parameters and bioequivalence were calculated and evaluated with use of DAS software. RESULTS: The calibration curve was linear over the concentration ranges of 10.14-1 267.50 ng/ml(r>0.999), with the lower limit of quantitation (LLOQ) 10.14 ng/mL.RSDof within-day and between-day were lower than 1.78% and 3.75%. The main pharmacokinetic parameters of test and reference preparations were as follows:AUC0-t(4 284.81±1 150.02) μg·h/L and (4 479.97±1 333.70) μg·h/L,AUC0-∞(4 425.56±1 173.44) μg·h/L and (4 632.83±1 369.83) μg·h/L,t1/2(1.81±0.25) h and (1.83±0.26) h,tmax(3.70±0.71) h and (3.73±0.51) h,Cmax(814.67±250.92) ng/ml and (870.80±281.99) ng/ml.CONCLUSIONS: The method is rapid, sensitive and accurate for the determination of cefdinir in human plasma, which had been successfully applied in the bioequivalence study of cefdinir granules in healthy volunteers.

Cefdinir granules; LC-MS/MS; Bioequivalence; Pharmacokinetics

國家自然科學基金項目(No.81473287)

主任藥師。研究方向：藥動學及藥物相互作用研究。E-mail：luyn_union@163.com

R978.1；R969.1

A

1672-2124(2016)08-1014-04

10.14009/j.issn.1672-2124.2016.08.002

2016-07-12)

*碩士研究生。研究方向：藥動學及藥物相互作用研究。E-mail：wangnx_union@163.com