藏醫白脈療法對局灶性腦缺血再灌注大鼠腦損傷的保護作用及對海馬齒狀回Jagged1表達的影響

祝日榮　任小巧　毛　萌　王明強　郭慧娟　仁青加　葛東宇　李根茂　鄭麗娟

論 著

藏醫白脈療法對局灶性腦缺血再灌注大鼠腦損傷的保護作用及對海馬齒狀回Jagged1表達的影響

祝日榮任小巧毛萌王明強郭慧娟仁青加葛東宇李根茂鄭麗娟

目的 探討白脈療法對局灶性腦缺血再灌注大鼠腦損傷的保護作用及對海馬齒狀回Jagged1表達的影響。方法 線栓法制作局灶性腦缺血再灌注大鼠模型。隨機分為假手術組、模型組、白脈療法組，腦缺血1.5小時，分別再灌注7天、14天，通過氯化三苯基四氮唑（triphenyltetrazolium chloride，TTC）染色觀察腦梗死面積，蘇木精-伊紅染色法 （hematoxylin-eosin staining，HE）染色觀察皮層細胞形態變化，并應用免疫組化法檢測各組大鼠海馬齒狀回Jagged1陽性細胞數量。結果 （1）TTC染色觀察到正常腦組織呈鮮紅色，梗死區腦組織呈蒼白色，并且隨著再灌注時間的延長可見梗死區擴大，白脈療法組的腦梗死體積小于模型組，且14天時與模型組比較有顯著性差異（P<0.05）。（2）HE染色表明白脈療法組腦缺血大鼠皮層神經元的損傷程度低于模型組。（3）白脈療法可以上調腦缺血大鼠海馬齒狀回SGZ的Jagged1表達，術后7天、14天Jagged1陽性細胞數高于模型組、假手術組，且有顯著性差異（P<0.05）。結論 白脈療法對局灶性腦缺血再灌注大鼠腦損傷有一定的保護作用，且可促進大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷后海馬齒狀回區Jagged1的表達，Jagged1的表達增加可能是白脈療法通過Notch通路促進腦缺血損傷后內源性神經干細胞增殖分化的分子機制之一。

白脈療法； Jagged1； 海馬齒狀回； 局灶性腦缺血再灌注模型

藏醫白脈療法是指通過口服藏藥和外治的方法相結合，達到改善腦血管病所導致的不良后遺癥的綜合性治療方法［1-2］。本實驗選擇口服藥如意珍寶丸和外用藥白脈軟膏，二者皆為白脈病常用藏成藥［3］，且有臨床研究表明其療效顯著［4-5］。腦缺血后治療的主要關注點在腦內神經的再生，Notch信號通路具有調節神經再生的作用，Jagged1為Notch信號通路的配體［6］。白脈療法是否通過調控Jagged1的表達，并在內源性神經干細胞（neural stem cells，NSCs）增殖分化中發揮重要作用從而產生神經保護作用，但作用機制目前尚未明確。本實驗采用大腦中動脈阻塞線栓法建立局灶性腦缺血再灌注大鼠模型，動態觀察白脈療法對局灶性腦缺血再灌注模型大鼠缺血側海馬齒狀回Notch信號轉導通路Jagged1表達的影響，探討其促進腦缺血損傷后NSCs增殖分化的機制。

1　材料與方法

1.1實驗動物

健康雄性SPF級SD大鼠60只，體質量（250±10）g，購買于北京斯貝福實驗動物技術有限公司，許可證號為：SCXK（京）2011-0004。

1.2藥物、試劑及儀器

如意珍寶丸（生產批號：20150116），購自金科藏藥股份有限公司；白脈軟膏（生產批號：130826），購自西藏奇正藏藥股份有限公司；大鼠A級MCAO栓線，購自北京西濃生物技術有限公司；TTC（Genebio）、Rabbit Anti-Jagged1多克隆抗體（Santa Cruz Biotechnology）、濃縮型DAB試劑盒、抗兔超敏二步法免疫組化檢測試劑，均購自北京中杉金橋生物公司。

1516型切片機，購自德國Leitz公司；BX40型光學顯微鏡、E320型顯微照相機，購自日本Olympus公司；電熱恒溫培養箱（DH4000 AB型），購自天津市泰斯特儀器有限公司。

1.3局灶性腦缺血再灌注模型制備

參照Belayev［7］報道的線栓法加以改良后建立左側大腦中動脈栓塞缺血模型（middle cerebral artery occlusion，MCAO）。手術前1天禁食，自由飲水。將SD大鼠腹腔注射10%水合氯醛溶液（3.5 mL/kg）麻醉后，于頸正中線處縱向切開皮膚，分離右側頸總動脈（common carotid artery，CCA），向近心端分離出頸外動脈（external carotid artery，ECA）和頸內動脈（internal carotid artery，ICA）。結扎CCA近心端及ECA，同時在CCA遠心端下置線備用。用動脈夾暫時夾閉ICA，在CCA結扎線遠心端插入準備好的栓線，待栓線進入至ECA和ICA分叉口處，將CCA遠心端的結扎線打一活結固定栓線，打開ICA處動脈夾，將栓線經ICA插入，使其到達大腦前動脈（anterior cerebral artery，ACA），進入深度約18～20 mm，阻斷MCA血流。將CCA上遠心端處固定栓線的結扎線打一死結，并將栓線尾端用黑色記號筆涂黑后留于皮膚外1 cm，消毒并逐層縫合。缺血1.5小時后將漏在皮膚外的線栓拔出1 cm 并剪斷，使大腦動脈Willis環和MCA恢復血供，造成缺血再灌注模型，保持體溫至清醒。造模后將動物置于放有清潔墊料的鼠籠內，自由飲水、進食。假手術組只進行術前麻醉和血管分離術，不結扎及導入線栓。手術過程中室溫保持在24～25℃。

1.4實驗分組與給藥

動物于麻醉清醒后6小時進行神經行為學評分。參照Zea Longa［8］評分法進行神經行為學評分，Zea Longa評分法把神經學檢查分5個等級：0分：不能自發行走，意識喪失；1分：行走時，大鼠向左側（癱瘓側）轉圈；2分：將大鼠放在地上活動拉住鼠尾時大鼠向左側（癱瘓側）轉圈；3分：輕提鼠尾將其懸空，足距地面1 m，觀察前肢彎曲情況，左前肢持續彎曲；4分：正常，大鼠兩側前肢伸向地面且無其他神經行為學特征。評分為1～3分的納入本研究。采用隨機表將每個分值的大鼠平均分配到各組，以此保證每組大鼠神經行為學評分沒有顯著性差異。

大鼠分為3組：假手術組、模型組、白脈療法組。每組根據缺血再灌注時間分為缺血再灌注7天、再灌注14天兩個亞組。

白脈療法組大鼠給予如意珍寶丸灌胃，每天1次，從造模后開始給藥至處死，給藥量依據成人給藥量的6.3倍計算［9］，如意珍寶丸成人每天用量4～5片，每天2次，每片重0.5 g，折合計算后給藥量約為0.052 g/100 g，用生理鹽水配成0.052 g/mL的藥液，即每100 g體重灌胃1 mL藥液。假手術組和模型組按照同樣方法予以等量的生理鹽水，每天1次至處死；白脈療法組在如意珍寶丸灌胃基礎上再給予白脈軟膏外用，每天2次，每次1g并按摩5分鐘；假手術組和模型組均于大鼠患肢涂凡士林，其余同白脈療法組。

1.5取材

造模成功后于第7天、第14天取材，經水合氯醛麻醉后斷頭取腦，每組5只全腦取出后放在凍存管置于-20℃冰箱中速凍20分鐘后TTC染色；每組另取5只大鼠心臟灌注，沿胸骨左側剪開胸腔，從左心室進針，插入到主動脈，固定針頭，剪開右心耳，快速滴入預冷生理鹽水（10 mL/min），無血污后改滴入4%多聚甲醛（5～10 mL/min），先快后慢，約250 mL，開顱取腦，去額極、小腦，4%多聚甲醛固定2天，石蠟包埋。在海馬齒狀互包平面連續冠狀切片，片厚7 μm，備用。

1.6觀察指標

1.6.1腦梗率觀測 -20℃冰箱中速凍20分鐘后切片，一般切成5片（厚1.8 mm）。第一刀在腦前極與視交叉連線中點處；第二刀在視交叉部位；第三刀在漏斗柄部位；第四刀在漏斗柄與后葉尾極之間。將切片置于濃度為1%TTC染液中，將腦組織放入避光的容器內，放入37℃溫箱20～30分鐘，不時翻動腦片，使均勻接觸到染色液，配置過程和使用過程均需避光。染色完成后用4%的多聚甲醛固定，24小時后照相，用Image-Pro Plus 6計算機圖像分析系統計算腦梗率。

1.6.2病理形態觀察 將各組組織切片于46℃烤箱烘烤24小時后，二甲苯Ⅰ、Ⅱ脫蠟，遞減的濃度梯度酒精脫水，蘇木精染色，1%鹽酸酒精分化，流水沖洗返藍，0.5%伊紅復染，80%、95%、100%酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。200倍光鏡隨機觀察右側腦組織皮層區不重疊的5個視野，并攝片。

1.6.3大鼠海馬齒狀回SGZ Jagged1的表達 采用免疫組化SP法，切片脫蠟，0.01 mol/L PBS清洗2 min×3，置于枸櫞酸鹽微波修復，冷卻后0.01 mol/L PBS洗2 min×3，滴加3%過氧化氫溶液10分鐘，滅活內源性過氧化物酶；0.01 mol/L PBS洗2 min×3次；滴加一抗Jagged1抗體（1∶50），4℃過夜，PBS沖洗2 min×3；滴加超敏二步法免疫組化檢測試劑盒中的試劑1（聚合物輔助劑），37℃孵育10分鐘，PBS沖洗2 min×3；滴加試劑2（辣根酶標記抗兔IgG聚合物），37℃孵育10分鐘，PBS沖洗2 min×3；DAB顯色劑10分鐘，水洗終止，透明、封片。從標本中隨機取部分切片，用0.01 mol/L PBS代替一抗，其余步驟相同，作為陰性對照。每只動物隨機取免疫組化切片5張，在高倍鏡下（200倍）計數海馬齒狀回顆粒細胞區內1/3、顆粒下區Jagged1陽性細胞，取其均值作為海馬SGZ Jagged1陽性細胞數。

拍照定位參考《大鼠腦立體定位圖譜》［10］，具體取像位置在海馬齒狀回。

1.7統計學處理

數據資料使用SPSS 21.0統計軟件進行分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，若數據符合正態分布且方差齊，則采用單因素方差分析（one-way ANOVA），兩組間的比較采用 LSD檢驗；若不符合正態分布或方差不齊，則采用秩和檢驗，以P<0.05或P<0.01為差異有統計學意義。

2　結果

2.1腦梗率觀測

再灌注7天、14天后各組隨機取5只動物進行TTC染色。染色結果表明：假手術組腦片均紅染，未見白色梗死灶形成；模型組7天出現白色梗死灶，位于顳頂葉皮質和尾殼核；模型組于14天后梗死灶范圍逐漸擴大；白脈療法組7天可見白色梗死灶位于尾殼核和額顳頂葉皮質，白脈療法組14天腦梗死面積小于7天，14天時白脈療法組腦梗死率小于模型組，且有顯著性差異（P<0.05）。見圖1、表1。

圖1　各組大鼠給藥7天、14天后腦組織TTC染色圖

表1　各組大鼠TTC染色腦梗率改變（x±s）

2.2病理學觀察

假手術組7天皮層神經元結構完整，數量多，核圓、大，偶見核固縮，14天同7天無顯著性差異；模型組7天神經元排列紊亂，部分細胞排列疏松，細胞核固縮，深染，周圍出現空泡，正常神經元數量減少，14天可見大量細胞溶解后殘留的痕跡，細胞稀疏，排列紊亂；白脈療法組7天神經元排列疏松，部分細胞核皺縮，深染，周圍出現空泡，14天正常神經元數量有所增加，核固縮細胞減少，細胞間的空泡區域減少。7天白脈療法組有少量核固縮細胞，與模型組相比明顯少，與假手術組相比沒有顯著差別；14天白脈療法組核固縮細胞比7天多，但與模型組相比明顯少許多，與假手術組相比核固縮細胞明顯多。見圖2。

2.3大鼠海馬齒狀回SGZ Jagged1的表達

Jagged1在正常腦組織亦有一定量的表達，陽性細胞主要分布于大鼠海馬齒狀回顆粒細胞層、齒狀回顆粒細胞下層（subgranular zone，SGZ）、門區等，本實驗主要分析海馬齒狀回Jagged1陽性細胞，陽性神經細胞多呈顆粒狀，Jagged1蛋白分布于細胞膜和細胞外基質，呈深棕色或淺棕色。腦缺血損傷后7天，白脈療法組Jagged1陽性細胞數與正常組及模型組比較均有顯著性差異（P<0.05）；14天各組Jagged1陽性細胞數較7天均有所下降，且白脈療法組與正常組及模型組比較均有顯著性差異（P<0.05）。模型組Jagged1陽性細胞數和假手術組在7天、14天兩個時間點均無顯著性差異。見圖3、表2。

圖2　再灌注7天、14天后各組大鼠神經細胞病理學改變（×200）

表2　不同時間點大鼠海馬齒狀回SGZ Jagged1陽性細胞數（x±s）

3　討論

缺血性卒中是臨床常見疾病，且致死致殘率高，幸存的病人預后多不同程度地患有偏癱等后遺癥，但目前還沒有好的治療方法。神經再生是腦損傷后運動功能恢復的基礎，探尋有效增加神經再生是其重要的康復手段［11］。很長一段時間以來成年哺乳動物中樞神經系統被認為不具有再生能力，但在1992年NSCs的發現打破了這一觀念，這一發現為腦損傷后神經再生提供了希望。

圖3　不同時間點各組大鼠海馬齒狀回SGZ Jagged1的表達（×400）

本實驗中TTC結果顯示，白脈療法可以減少腦缺血再灌注大鼠右側大腦梗死面積。HE染色結果顯示白脈療法可以減輕腦缺血再灌注大鼠皮層神經元核固縮現象。由以上兩項提示白脈療法可以降低缺血再灌注造成的神經損傷。SGZ是目前已確認的 NSCs的主要聚集區之一［12］，研究表明Jagged1-Notch信號通路能促進 NSCs增殖［13-15］，白脈療法組SGZ區的Jagged1陽性細胞數比模型組、假手術組均高，差異具有統計學意義（P<0.05），提示白脈療法可能通過Notch信號通路來調節腦缺血后SGZ區的神經再生過程；也有研究表明活化的Jagged1能促進NSCs向星形膠質細胞分化［16］，星形膠質細胞能夠分泌多種神經營養因子，有利于軸突的再生和修復，有促進神經元存活的作用［16-17］。由此猜測腦缺血前期白脈療法通過調節Jagged1促進NSCs向星形膠質細胞分化，并為后期分化出的神經元提供營養支持。

本實驗從多角度觀察了白脈療法對于缺血再灌注大鼠腦損傷的保護作用，從TTC染色和HE結果均可看出白脈療法能起到一定的神經保護作用，從Jagged1的表達情況來看白脈療法在腦缺血后通過Notch信號通路發揮調節作用，對于缺血再灌注大鼠腦損傷的保護作用機制白脈療法是否有其他通路參與調節，以及是否是Notch信號通路起到主導作用還有待大量實驗驗證。

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（本文編輯：韓虹娟）

Protective effects of the Tibetan Baimai（BM）therapy on focal cerebral ischemia-reperfusion injuryin rats and the influence of BM therapy on Jagged1 expression of hippocampal dentate gyrus

ZHU Ri-rong，REN Xiao-qiao，MAO Meng，et al.Basic Medical College，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China

REN Xiao-qiao，E-mail：rxq23111111@126.com

Objective To explore the protective effects of the Baimai（BM）therapy on focal cerebral ischemia-reperfusion injury in rats and the influence of BM therapy on Jagged1 expression of hippocampal dentate gyrus.Methods The focal cerebral ischemia-reperfusion injury models were induced by suture method，inserting thread 1.5 h and reperfusion 7 d and 14 d respectively.The rats were randomly divided into sham-operation group，model group，Baimai therapy group（BMT group）.The area of cerebral infarction was observed by TTC staining，the morphological changes of cortex cell was observed by HE staining，and immunohistochemistry method was used to detect hippocampal dentate gyrus Jagged1 positivecell number of each group rats.Results （1）the TTC staining result showed that normal brain tissue was bright red，infarction area of the brain was pale，and with the prolongation of reperfusion time，the infarct area was enlarged.The areas of cerebral infarction of BMT group were less than model group，and there was a significant difference compared with model group on 14 days（P<0.05）.（2）HE staining showed that degree of injury of cortical neurons in the cerebral ischemia group was lower than that in the model group.（3）BM therapy can increase hippocampal dentate gyrus Jagged1 expression of cerebral ischemia rats，Jagged1 positive cells was higher than model group and control group，the result had significant difference（P<0.05），after having operation 7 days and 14 days.Conclusions BM therapy has certain protective effect on focal cerebral ischemia-reperfusion injury，and can promote Jagged1 expression in hippocampal dentate gyrus after rats having focal cerebral ischemia-reperfusion injury，the increase of Jagged1 expression may be one of the molecular mechanisms of the proliferation and differentiation of endogenous neural stem cells after cerebral ischemia injury via the Notch pathway.

Baimai therapy； Jagged1； Hippocampal dentate gyrus； Focal cerebral ischemiareperfusion model

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2016.06.001

國家自然科學基金（81360575）

100029 北京中醫藥大學基礎醫學院［祝日榮（碩士研究生）、王明強（碩士研究生）、郭慧娟（碩士研究生）、葛東宇、李根茂、鄭麗娟（碩士研究生）］；北京中醫藥大學民族醫藥學研究所（任小巧、毛萌）；西藏自治區西藏藏醫學院（仁青加）

祝日榮（1989-），女，2013級在讀碩士研究生。研究方向：中醫診斷學。E-mail：zhurirong1@ 163.com

任小巧（1965-），女，博士，教授。研究方向：民族醫藥與現代疾病的證治規律研究。E-mail：rxq23111111@126.com

2016-01-19）