黑曲霉內切菊粉酶基因在畢赤酵母中的表達及應用研究

王寧鶴，邢雪巖，封志媚，路福平，李 玉（工業微生物教育部重點實驗室，天津科技大學生物工程學院，天津300457）

黑曲霉內切菊粉酶基因在畢赤酵母中的表達及應用研究

王寧鶴，邢雪巖，封志媚，路福平，李 玉*
（工業微生物教育部重點實驗室，天津科技大學生物工程學院，天津300457）

利用PCR方法從黑曲霉（Aspergillus niger）基因組DNA中擴增內切菊粉酶（endo I）全長基因（1551 bp），經序列分析后將其連接到表達載體pPIC9K上，得到重組表達載體pPIC9K-endo I。重組質粒經Sac I線性化并電轉化到畢赤酵母GS115，陽性轉化子進行發酵產酶后考察其酶學性質。酶學性質研究表明，重組酶的最適pH和最適溫度分別為5和60℃，重組酶在55℃下保溫9 h后，重組菊粉內切酶仍殘余83.2%的活性，表現出極高的熱穩定性，Cu2+、Ag+對重組酶有明顯的抑制作用。對內切菊粉酶水解菊粉的過程研究表明，重組內切菊粉酶能在8 h內將4%（w/v）菊粉水解為3～6個聚合度的低聚果糖，水解11 h后，低聚果糖得率達到63.5%，本研究為進一步開發以菊粉為原料生產低聚果糖的應用奠定了基礎。

內切菊粉酶，畢赤酵母，酶學性質，轉化率

內切菊粉酶（endo-inulinase）能夠特異性的水解菊粉中β-2，1-果糖苷鍵［1］，最終生成聚合度為3～10的高純度低聚果糖（GFn，Fn），低聚果糖是一種聚合度為2～7的功能性果聚糖，具有熱值低、增殖人體內雙歧桿菌、抑制腸道沙門氏菌和腐敗菌的生長［2］的作用，能夠促進腸胃功能，防止便秘提高人體免疫力［3-4］，還能抑制血糖、降低血脂［5］，因而在食品、保健品等行業有著廣泛的應用。菊粉是一種廉價的糖源，廣泛存在于菊科植物的根莖和塊莖中，通常被作為食用或飼用原料，其真正的價值未得到發揮。應用內切型菊粉酶水解菊粉生產低聚果糖，不僅可以提高低聚果糖的純度，還能降低成本，從而提高農副產品附加值，具有廣闊的應用前景。

近年來國內外研究者已經分離出很多能夠水解菊粉的微生物，其中包括酵母、霉菌、細菌等，國內外已報道了來源于無花果曲霉（Aspergillus ficuum）［6］、節

桿菌（Arthrobacter sp.）［7］、克魯維酵母（Kluyveromyces）［8］、青霉（Penicillium）［9］、黑曲霉（Aspergillus niger）［10］等菊粉酶的基因的克隆及鑒定，但到目前為止，市售的菊粉酶仍為混合酶，即同時存在內切型菊粉酶和外切型菊粉酶，外切型菊粉酶會從菊粉非還原性末端水解菊粉生成果糖分子，這樣就無法以菊粉為底物生產高純度的低聚果糖，也就無法發揮菊粉作為功能糖原料的應有的價值。因此有必要利用基因工程的方法表達內切型菊粉酶蛋白，以滿足以菊粉為底物生產低聚果糖的要求，進而才能對內切菊粉酶水解菊粉生產低聚果糖的轉化過程進行深入的探討。

本研究根據Genbank所報道的內切菊粉酶生物信息，設計引物，通過PCR技術從本實驗室保藏的一株野生型黑曲霉（TCCC 41064）中克隆得到內切菊粉酶基因endo I，構建到表達載體pPIC9K上，得到pPIC9K-endo I重組質粒，并在畢赤酵母GS115中得到誘導表達，并進一步研究了內切菊粉酶的酶學性質及轉化過程，以期為內切菊粉酶的工業化生產及水解菊粉生產低聚果糖的應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

載體和質粒 黑曲霉TCCC41064、克隆宿主菌E.coli JM109、表達宿主GS115、表達載體pPIC9K均由本實驗室保藏；克隆載體pMD19-T simple vector 購自Takara公司；LB培養基 蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化鈉10 g/L，pH7.0；YPD固體培養基 蛋白胨20 g/L，酵母提取物10 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂2%（w/v）；MD篩選培養基、BMMY培養基、BMGY培養基 參考文獻［11］所述方法配制；工具酶和試劑 DNA限制性內切酶、T4DNA連接酶、LA Taq DNA聚合酶、DNA Marker均購自TaKaRa公司；蛋白胨、酵母粉、菊粉和瓊脂糖 購自上海生工；柱式DNA膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒、氨芐青霉素（Amp）、遺傳霉素（G418） 購自北京博大泰克公司。

TU-1810型紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；TC-512型PCR基因擴增儀 英國Techne公司；高速低溫離心機 德國Eppendorf公司；HW SY21-K型電熱恒溫水浴鍋 江蘇國華儀器廠；水浴恒溫振蕩器 北京市長風儀器儀表公司；DYY-6D型電泳儀 北京市六一儀器廠；HPLC分析色譜儀 安捷倫科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 黑曲霉基因組DNA的制備 參見文獻［12］所述方法。

1.2.2 引物設計與基因克隆 參考GenBank中已報道的黑曲霉（GenBank登錄號：CAA07345和DQ233221）內切菊粉酶基因的DNA序列，應用primer 5引物設計軟件設計1對引物，如表1所示，引物由奧科生物工程有限公司合成。

PCR擴增條件為：95℃5 min，94℃ 45 s，58℃40 s，72℃1.5 min，30個循環；72℃延伸10 min。

1.2.3 表達載體pPIC9K-endo I的構建 使用引物endo-F、endo-R和LA Taq DNA聚合酶擴增Endo I全長基因，擴增得到的序列連接到pMD19-T simple vector載體上，轉化至大腸桿菌JM109，獲得T-endo I重組質粒，然后將用EcoR I、Not I雙酶切的目的片段與同樣雙酶切的pPIC9K載體相連，獲得pPIC9K-endo I。重組載體構建示意圖如圖1所示。

圖1 重組表達質粒pPIC9K-endoⅠ的構建Fig.1 Construction of the recombinant plasmid carrying the endo-inulinase gene

1.2.4 畢赤酵母電轉化、高拷貝重組菌株以及搖瓶發酵 參見文獻［12］所述方法。

1.2.5 內切菊粉酶酶活力測定 將適當稀釋的200 μL酶液與800 μL底物（4%長鏈菊粉溶解在0.05 mol/L的HAC-NaAC的緩沖液中，pH4.6）混合，50℃下反應10 min后沸水浴滅酶。內切菊粉酶水解菊粉釋放出來的還原性末端用DNS［13］法測定。在100℃煮沸10 min的滅活發酵液上清液作為陰性對照。內切菊粉酶的酶活力單位定義為反應體系中每分鐘產生1 μmol還原糖所需的酶量為1個酶活力單位（U）。

1.2.6 重組酶的酶學性質研究

1.2.6.1 最適溫度測定 取適當稀釋的酶液200 μL，加入800 μL 4%菊粉（用0.05 mol/L的HAC-NaAC緩沖液配制），在不同溫度（40、45、50、55、60、65、70、75℃下）條件下考察內切菊粉酶的活力。

1.2.6.2 最適pH測定 利用0.05 mol/L的HAC-NaAC緩沖液（pH3.5～11）配制4%的菊粉，測定在不同的pH條件下的內切菊粉酶活力。

1.2.6.3 熱穩定性測定 將酶液在50、55、60、65℃下保存一定時間后然后快速冷卻，測定殘余酶活力。

1.2.6.4 酸堿穩定性的測定 將酶液置于不同pH的緩沖液中，于室溫下放置60 min，經0.1 mol/L pH4.6的醋酸緩沖液稀釋后，在50℃下測定剩余的酶活力。

表1 PCR反應引物Table1 PCR primers

1.2.6.5 金屬離子對內切菊粉酶酶活的影響 pH4.6、50℃下，在4%菊粉（0.05 mol/L的HAC-NaAC緩沖液配制）800 μL與200 μL酶液反應體系中添加5 mmol/L的金屬離子，考察金屬離子對內切菊粉酶的影響。

1.2.7 內切菊粉酶水解菊粉產物的分析檢測

1.2.7.1 酶解產物的TLC定性分析 4%菊粉（0.05 mol/L 的HAC-NaAC緩沖液配制）800 μL加入200 μL酶液，pH4.6、50℃下反應，定時取樣，將反應后的產物在薄層層析板上進行定性分析，上樣2 μL，然后進行展層，每次展開時間為20 min，展開劑為正丁醇-異丙醇-水-乙酸（體積比為7∶5∶4∶2）。每次展層結束后用電吹風吹干，展層2次。展層后，在薄層層析板上加入顯色液（水235 mL，鉬酸氨12 g，鉬酸鈰氨0.5 g，濃硫酸15 mL），于95℃烘干顯色10 min，觀察結果。

1.2.7.2 酶解產物的HPLC定量分析 4%菊粉（0.05 mol/L的HAC-NaAC緩沖液配制）800 μL加入200 μL酶液，pH4.6、50℃下反應8 h，并定時取樣，而后將樣品置于1.5 mL離心12000 r/min離心10 min，上清稀釋后經0.45 μm超濾膜后進行分析。HPLC色譜條件：安捷倫高效液相色譜儀，自動進樣器，TSK-GEL Amide-80 Series色譜柱（4.6 mm×100 mm，5.0 μm）蒸發光檢測器；流動相為60%（v/v）乙腈水溶液，流速1 mL/min；進樣量5 μL。利用低聚果糖標準樣品，繪制質量與峰面積的標準曲線，將樣品中各糖組分峰面積分別帶入相應的標準曲線求出相應濃度，從而確定聚合度DP3～5的低聚果糖的含量。

2 結果和分析

2.1 表達載體pPIC9K-endo I的構建及鑒定

以黑曲霉TCCC 41064菌株DNA作為基因擴增模板，按照方法1.2.2用引物P1、P2進行PCR擴增。0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測發現，在1.5 kb附近有特異性的單一DNA條帶與目的基因片段大小一致。將PCR產物與pMD19-T Simple Vector連接后委托北京華大基因有限公司進行測序，經過比對，PCR產物與GenBank上報道的endo-inulinase基因序列相似度為99.67%。

圖2 endoⅠ基因PCR及重組質粒pPIC9K-endoⅠ酶切驗證電泳圖Fig.2 The electrophoresis of endoⅠgene and digesting recombinant vector with restriction enzymes

將擴增出的內切菊粉酶基因片段插入到表達載體pPIC9K上，構成重組質粒pPIC9K-endo I，重組質粒pPIC9K-endo I經EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切鑒定，小片段為1500 bp左右目的基因，大片段為9000 bp左右的pPIC9K載體，驗證正確，表明目的基因已插入到pPIC9K載體上。

2.2 重組畢赤酵母的發酵

電轉化得到的轉化子經驗證后，按照1.2.4方法對該重組子進行搖瓶發酵，按照方法1.2.5對發酵上清進行了酶活檢測，發酵液上清酶活達到13.5 U。

2.3 內切菊粉酶性質的研究

2.3.1 重組內切菊粉酶的純化 發酵液上清SDSPAGE結果如圖3（A）所示，由圖可知，在66 ku處，重組菌株比對照組多出一條特征條帶，重組酶純化方法參考文獻［13-14］，經純化去除雜蛋白后得到單一的具有內切菊粉酶活性的蛋白（圖3B），表明純化效果良好，純化出的活性蛋白表觀分子量約為70 ku，略高于根據內切菊粉酶氨基酸序列計算得出的55 ku，這可能是由于蛋白折疊過程中的糖基化。

圖3 SDS-PAGE分析蛋白純化結果Fig.3 SDS-PAGE analysis of the purified protease

2.3.2 最適溫度測定 為確定溫度對酶活性的影響，測定了從40～75℃下的酶活性，結果如圖4所示。結果顯示，在40～60℃之間酶活隨溫度升高而增加，60℃時酶活達到最大，比從黑曲霉野生菌株［10］分離出的內切菊粉酶最適溫度略高，超過65℃酶活下降較快，在溫度低于45℃或者高于65℃的范圍內均不好。

圖4 酶的最適溫度Fig.4 The optimum temperature of the recombinant enzymes

2.3.3 最適pH測定 為確定pH對酶活性的影響，測定不同pH下的酶活性，結果如圖5所示，結果顯示，在pH3.5～5.0范圍內，酶活性隨pH增加而升高，在pH5.0，酶活達到最大，pH超過6.0，酶活下降很快。

圖5 酶的最適pHFig.5 The optimum pH and pH stability of recombinant enzymes

2.3.4 熱穩定性分析 經過在50、55、60、65℃下條件下恒溫水浴處理9 h后，酶的活性隨時間變化過程如圖6。

圖6 酶的溫度穩定性Fig.6 The thermostability of the recombinant enzymes

由結果可知，在60℃以下，內切菊粉酶有很好的穩定性。在55℃下保溫9 h后，內切菊粉酶仍殘余83.2%的活性，但當溫度高于60℃時，酶的活性下降很快，在65℃保溫9 h后酶幾乎完全失活。

2.3.5 pH穩定性分析 為了確定pH對酶穩定性的影響，分別測定在內切菊粉酶在pH3.0～10.0下酶的活性，并與在標準條件下測定的酶活相比較，實驗結果見圖7。

圖7 酶的pH穩定性Fig.7 The pH stability of recombinant enzymes

由結果可看出，在pH3.0～7.0，酶活性在原來的90%以上，在pH10.0仍有原來酶活的81.1%，由此可見，內切菊粉酶在pH3.0～10.0較為穩定，在偏酸性條件穩定性要高于堿性環境，并且隨著pH升高，酶的穩定性下降加快。

2.3.6 金屬離子對內切菊粉酶酶活的影響 為了測定金屬離子對酶活的影響，在反應體系中添加了不同的金屬離子，結果如表2所示，由表2可知，金屬Mg2+、Ni2+、Li+、Na+對酶沒有明顯的激活或抑制作用，酶活性能保持原來的90%左右；而Cu2+、Ag+對酶有明顯的抑制作用，酶活性在原來的50%以下。

表2 金屬離子對內切菊粉酶活力的影響Table2 Effect of different cations on recombinant endo-inulinase activity

2.4 內切菊粉酶水解菊粉產物的分析檢測

2.4.1 TLC分析內切菊粉酶水解菊粉產物 薄層層析（TLC）法檢測反應產物，結果如圖8所示，隨著反應時間的延長，長鏈菊粉逐漸被水解為短鏈糖，反應8 h后，菊粉基本被完全水解為短鏈的低聚糖。

圖8 薄層層析法檢測菊粉水解產物Fig.8 The hydrolyzed products in different periods by TLC analyze

2.4.2 HPLC分析內切菊粉酶水解菊粉產物 不同來源的內切菊粉酶與菊粉的結合及作用方式有差別，從而生成產物的聚合度的分布也不同，而聚合度3～5的低聚果糖的營養價值要高于其他聚合度的低聚果糖。為考察產物聚合度的分布，對反應產物進行

HPLC分析，不同時期產物成分液相圖顯示，在最初120 min內，內切菊粉酶將菊粉水解為3～6糖，從圖9中可以看出，三糖增加速率要遠高于其他幾種糖，隨著時間的延長，5糖、6糖逐漸開始水解，最終將菊粉水解成以3～5糖為主的低聚糖，并伴隨有少量的2糖生成。

圖9 以菊粉為底物時水解產物液相分析Fig.9 The hydrolyzed products in different periods using inulin as the substrate by HPLC analyze

2.4.3 低聚果糖得率隨水解時間的變化 在加酶量為20 U/g下，利用內切菊粉酶水解4%（w/v）的菊粉，結果如圖10所示，從圖中可以看出，菊粉水解速率由快變慢，5 h后水解反應趨于平緩，可能是由于隨著反應的進行，反應體系粘度過高，不利于傳質，從而抑制了酶的催化活性，導致水解反應減慢。圖中表明在反應11 h后低聚果糖得率達到63.5%。

圖10 低聚果糖得率隨水解時間的變化Fig.1 0 The conversion rate of fructooligosaccharides with the change of hydrolysis time

3 結論與討論

從黑曲霉中克隆得到的內切菊粉酶基因在畢赤酵母中過表達，得到了高純度的內切菊粉酶酶液，研究表明Cu2+、Ag+對酶有明顯的抑制作用；酶的最適pH和最適溫度分別為5和60℃，而且該酶在55℃以下具有很高的熱穩定性；對內切菊粉酶水解菊粉過程研究表明，內切菊粉酶在8 h內能將4%（w/v）菊粉水解為3～6個聚合度的低聚果糖，最終能將菊粉水解成以3～5糖為主的低聚糖，在轉化11 h后，低聚果糖得率達到63.5%。

菊粉酶因微生物來源不同，其酶學性質也會存在一定的差異，如霉菌來源的菊粉酶的最適pH在4.5～7.0之間，酵母菌來源的菊粉酶在4.4～6.5之間，細菌來源的菊粉酶在4.8～7.0之間。通常，細菌和酵母菌來源的菊粉酶的最適溫度比霉菌的高，黑曲霉作為重要的糖苷酶類來源的微生物具有重要的研究意義，黑曲霉（A.niger strain 12）［15］內切菊粉酶最適pH 為5.3，穩定區在4.0～7.5；最適溫度為45℃，穩定區在40℃以下，均沒有本實驗所構建菌株酶學特性優良，王靜［16］在水解菊粉反應過程中添加10 U/g Aspergillus ficuum產生的內切菊粉酶，在pH6.0、45℃條件下反應72 h后，低聚果糖產量超過50%，主產物是DP2到DP4的低聚果糖。而本實驗采用的重組內切菊粉酶能夠在8 h內將菊粉水解為3～6個聚合度的低聚果糖，11 h后低聚果糖得率達到63.5%，水解時間短，低聚果糖得率高，符合水解菊粉生產低聚果糖的

基本要求，以上表明本研究構建的黑曲霉來源的內切菊粉酶具有很高的實用性，為利用菊粉生產低聚果糖的工業化提供了重要指導意義。

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Overexpression of the endo-inulinase gene from Aspergillus niger in Pichia pastoris and its application research

WANG Ning-he，XING Xue-yan，FENG Zhi-mei，LU Fu-ping，LI Yu*
（Key Laboratory of Industrial Microbiology，Ministry of Education，College of Biotechnology，Tianjin University of Science＆Technology，Tianjin 300457，China）

The endo-inulinase gene（1551 bp）was amplified from the total DNA of A.niger by PCR and subsequently cloned into pPIC9K.The recombinant plasmid was linearized by Sac I and transformed into P.pastoris GS115 by electroporation，yielding the recombinant strain P.pastoris GS115/pPIC9K-endo I.Then right transformants were isolated and the recombinant enzyme derived from fermentation was characterized.Its optimal pH and optimum temperature of the recombinant enzyme was 5 and 60℃，respectively，moreover 83.2%of the original enzymatic activity remained after the incubation of recombinant enzyme at 55℃ for 9 hours.It was shown that Cu2+，Ag+strongly inhibited the recombinant enzyme activity.The hydrolytic process analyses showed that the recombinant endo-inulinase could hydrolyze 4%（w/v）inulin into DP3-6 of fructooligosaccharides in 8 h.The conversion rate reached 63.5%in 11 h.The research laid a foundation for the produce of fructooligosaccharides.

endo-inulinase；Pichia pastoris；enzyme characterization；conversion rate

TS201.3

A

1002-0306（2016）08-0219-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.08.037

2015－09－10

王寧鶴（1990-），男，碩士研究生，研究方向：酶工程，E-mail：wnh1991@sina.com。

*通訊作者：李玉（1976-），女，博士，教授，研究方向：應用微生物與酶工程，E-mail：liyu@tust.edu.cn。

食品新酶創制與應用關鍵技術研究（2013AA102106-07）；天津科技大學青年教師創新基金（2014CHG08）。