鹽脅迫對黃瓜幼苗葉片、韌皮部滲出液和根系抗氧化酶同工酶表達的影響

孫張晗，樊懷福，2，杜長霞，2，黃玲英（.浙江農林大學 浙江省農產品品質改良技術研究重點實驗室，浙江 臨安 3300；2.浙江農林大學 農業與食品科學學院，浙江臨安3300）

鹽脅迫對黃瓜幼苗葉片、韌皮部滲出液和根系抗氧化酶同工酶表達的影響

孫張晗1，樊懷福1，2，杜長霞1，2，黃玲英1
（1.浙江農林大學 浙江省農產品品質改良技術研究重點實驗室，浙江 臨安 311300；2.浙江農林大學 農業與食品科學學院，浙江臨安311300）

黃瓜Cucumis sativus在設施生產中經常受到鹽害，嚴重影響了黃瓜的產量和品質。以鹽敏感黃瓜品種‘津優1號’Cucumis sativus‘Jinyou No.1’和相對較耐鹽品種‘新泰密刺’Cucumis sativus‘Xintai Mici’為試材，采用水培，研究了氯化鈉脅迫對幼苗葉片、根系和韌皮部滲出液超氧化物歧化酶（SOD），過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）同工酶表達影響。結果顯示：葉片中共檢測到9條超氧化物歧化酶，4條過氧化物酶和2條過氧化氫酶同工酶條帶，鹽脅迫抑制了‘新泰密刺’葉片超氧化物歧化酶、過氧化物酶和過氧化氫酶同工酶表達，而‘津優1號’葉片超氧化物歧化酶和過氧化氫酶同工酶表達增強。韌皮部滲出液有3條超氧化物歧化酶，2條過氧化物酶和1條過氧化氫酶同工酶條帶；鹽脅迫增強了‘新泰密刺’韌皮部滲出液中3種抗氧化酶同工酶表達，而抑制了‘津優1號’韌皮部滲出液中3種同工酶表達。在根系中共發現6條超氧化物歧化酶，7條過氧化物酶和1條過氧化氫酶同工酶條帶，鹽脅迫下2個品種根系過氧化氫酶同工酶的表達均增強，過氧化物酶同工酶在‘津優1號’中6條表達減弱，1條增強，在‘新泰密刺’中均增強，2個品種中3條相同超氧化物歧化酶同工酶在鹽脅迫下表達減弱，2條在 ‘津優1號’中表達增強而 ‘新泰密刺’中無變化，1條在 ‘津優1號’中表達無變化而‘新泰密刺’中表達減弱。綜上所述，3種抗氧化酶同工酶與其耐鹽性均有密切關系，并暗示抗氧化酶同工酶響應鹽脅迫的變化趨勢具有品種及組織特異性。韌皮部滲出液中3種同工酶變化趨勢在2個品種中完全相反，說明韌皮部是黃瓜幼苗響應鹽脅迫的重要組織。圖3參21

植物學；黃瓜；抗氧化酶同工酶；鹽脅迫

在溫室、大棚等設施栽培系統中，溫度、濕度、通氣狀況等均與露地栽培條件不同［1］，土壤缺少雨水淋洗，且設施栽培又具有高度集約化、高復種指數、高肥料施用量的特點，與之相適宜的水肥管理措施的缺乏和特殊的生態環境導致產生諸多土壤問題，其中土壤次生鹽漬化問題較為突出。土壤次生鹽漬化已經成為了設施栽培中普遍存在問題，導致蔬菜作物產量和品質下降，對設施蔬菜生產的可持續發展產生了嚴重不利的影響。黃瓜Cucumis sativus在中國蔬菜設施栽培中占有重要地位，是設施栽培的主要蔬菜之一，對土壤次生鹽漬化敏感［2］。土壤次生鹽漬化導致黃瓜植株生長受到抑制，鹽和鹽離子的大量積累誘導植物體發生生化反應，如活性氧（reactive oxygen species，ROS）積累等，造成脂質過氧化反應產生，使植物受到氧化脅迫傷害［3－4］。ROS最重要的形式是羥基自由基、單線態氧、超氧陰離子和過氧化氫。植物可產生一系列的內源機制，如低分子量的非酶抗氧化物質和酶的組分，來保護植物抵御ROS的毒害作用［5］。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是一種金屬蛋白，催化超氧化物自由基歧化形成過氧化氫和氧氣［6］，然后過氧化氫被過氧化氫酶（catalase，CAT）和多種過氧化物酶（peroxidases，POD）所清除，轉化成水和氧氣。SOD，POD，CAT是細胞膜系統免受ROS傷害的保護酶［7－8］，在植物體中廣泛存在，其活性的高低可在一定程度上反應植物抗逆性的強弱。鹽脅迫還導致黃瓜果實品質變差，如可溶性蛋白、總糖、抗壞血酸（Vc）等均受到顯著影響，產量下降［9］，因此，選育耐鹽黃瓜品種和研究其耐鹽機制是十分重要的。在前人研究基礎上，本研究以黃瓜為材料，采用營養液水培，研究了鹽（Na-Cl）脅迫對黃瓜幼苗葉片、根系和韌皮部滲出液SOD，POD和CAT同工酶活性表達的影響，以期為黃瓜設施栽培及耐鹽性強黃瓜品種的選育提供理論依據和支撐。

1　材料與方法

1.1材料培養及處理

試驗研究于2013年9月至2014年12月在浙江農林大學官塘玻璃溫室內進行。供試黃瓜品種為鹽敏感的 ‘津優1號'Cucumis sativus‘Jinyou No.1'，天津科潤農業科技股份有限公司黃瓜研究所研制；較耐鹽的 ‘新泰密刺'Cucumis sativus‘Xintai Mici'，山東新泰市黃瓜研究所選育。種子在28℃恒溫培養箱中催芽，露白后播于裝有m（草炭）∶m（蛭石）∶m（珍珠巖）＝2∶1∶1的育苗盤中育苗。待幼苗3葉1心時，挑選生長一致的幼苗定植于水培槽內。采用Hoagland營養液培養，氣泵通氣（40 min·h－1），預培養3 d后開始處理。共設4個處理，分別為：① ‘津優1號'-正常營養液栽培（J）；② ‘新泰密刺'-正常營養液栽培（X）；③ ‘津優1號'-營養液添加75.0 mmol·L－1鹽栽培（salt-J）；④ ‘新泰密刺'-營養液添加75.0 mmol·L－1鹽栽培（salt-X）。為了保證處理濃度的穩定性，處理期間2 d更換1次營養液。試驗設3次重復。處理后第3天取樣（葉片、韌皮部滲出液和根系）測定相關指標。使用消毒后的鋒利刀片切割黃瓜植株的莖，收集莖中韌皮部滲出液，具體收集步驟參考MITCHELL等［10］方法。

1.2同工酶PAGE電泳

活性聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）參數：100 V，4℃運行60 min；200 V，4℃運行180 min。除在整個電泳過程中不使用SDS，其他電泳緩沖液和凝膠配置參考LAEMMLI［11］的方法。

1.3染色方法

使用質量分數為7.5%聚丙烯酰胺凝膠分離POD，活性染色采用FIELDING等［12］方法。凝膠首先孵育在25.0 mmol·L－1磷酸鉀緩沖液（pH 7.0）中反應15 min，然后逐漸降低pH值，隨后凝膠浸沒在新鮮配制的25.0 mmol·L－1磷酸鉀緩沖液中，輕搖，直到POD同工酶條帶清晰可見。使用質量分數為10.0%聚丙烯酰胺凝膠分離SOD?；钚匀旧捎肂EAUCHAMP等［13］方法。凝膠在36.0 mmol·L－1磷酸鉀緩沖液中平衡30 min；在蒸餾水中漂洗1 min；然后浸沒在36.0 mmol·L－1磷酸鉀緩沖液（pH 7.8）（2.5 mmol·L－1氯化硝基四氮唑藍NBT）中，輕搖10～20 min，紫色背景下表現出無色條帶即為SOD酶帶。使用質量分數為7.5%聚丙烯酰胺凝膠分離CAT?；钚匀旧捎肳OODBURY等［14］方法。凝膠在0.003%過氧化氫中孵育10～15 min，蒸餾水漂洗2次，然后在質量分數為1%氯化鐵和1%鐵氰化鉀中孵育10～15 min，藍色背景下出現無色條帶即為CAT酶帶，凝膠用自來水漂洗干凈。

2　結果與分析

2.1鹽（NaCl）脅迫對超氧化物歧化酶（SOD）同工酶表達的影響

從圖1A可知：在葉片中檢測到了9條SOD同工酶條帶，即Sl-1，Sl-2，Sl-3，Sl-4，Sl-5，Sl-6，Sl-7，Sl-8，Sl-9（遷移率分別為 32.08%，33.02%，38.68%，43.40%，47.17%，57.55%，60.38%，67.92%和71.70%）。與對照相比，鹽脅迫下，除Sl-7外，其他8條SOD同工酶在‘津優1號'中的表達均有所增強；葉片中檢測到的9條SOD同工酶在 ‘新泰密刺'中表達均被抑制。正常栽培條件下，‘津優1號'中SOD同工酶表達量顯著弱于‘新泰密刺'。由圖1B可以看出：在韌皮部滲出液中檢測到了3條SOD同工酶條帶，分別為Sp-1，Sp-2，Sp-3，遷移率分別為45.28%，60.38%和62.66%。與對照相比，鹽脅迫條件下，3條SOD同工酶在 ‘津優1號'中表達均明顯受到抑制，而在 ‘新泰密刺'中表達則均有增強。正常栽培下，‘津優1號'和 ‘新泰密刺'中SOD同工酶表達無顯著差異。如圖1C所示：在根系中檢測到6條SOD同工酶條帶，即Sr-1，Sr-2，Sr-3，Sr-4，Sr-5，Sr-6。與對照相比，在脅迫條件下，Sr-1，Sr-2和Sr-3在 ‘津優1號'中的表達受到抑制，Sr-4和Sr-5表達明顯增強，而Sr-6表達無變化；Sr-1，Sr-2，Sr-3和Sr-6在 ‘新泰密刺'中的表達受到抑制，Sr-4和Sr-5表達無明顯變化。正常栽培條件下，與 ‘新泰密刺'相比，‘津優1號'中的SOD同工酶表達相對較弱。

2.2鹽脅迫對過氧化物酶（POD）同工酶表達的影響

圖1　鹽脅迫對黃瓜幼苗葉片、韌皮部滲出液和根系SOD同工酶表達的影響Figure 1　Effect of NaCl stress on the expression of SOD isozymes in cucumber seedlings leaf，phloem exudates and root

從圖2A可以看出：在葉片中檢測到了4條POD同工酶條帶，即Pl-1，Pl-2，Pl-3，Pl-4（遷移率分別為8.42%，38.95%，41.05%和46.32%）。與對照相比，在鹽脅迫條件下，4條POD同工酶條帶在 ‘津優1號'和 ‘新泰密刺'中的表達均受到抑制。正常營養液栽培條件下，POD同工酶表達在兩品種間無明顯差異。如圖2B所示：在韌皮部滲出液中檢測到了2條POD同工酶條帶，即Pp-1和Pp-2（遷移率分別為7.37%和11.58%）。與對照相比，在鹽脅迫下，‘津優1號'中的2條POD同工酶表達均受到了明顯抑制，而在 ‘新泰密刺'中表達則明顯的加強。正常營養液栽培條件下，‘津優1號'韌皮部滲出液中的POD同工酶表達強于 ‘新泰密刺'。

在根系中檢測到了7條POD同工酶條帶（圖2C），即Pr-1，Pr-2，Pr-3，Pr-4，Pr-5，Pr-6，Pr-7（遷移率分別為8.42%，11.58%，21.05%，31.58%，35.79%，41.05%和44.21%）。與對照比較，除了Pr-2外，‘津優1號'品種中檢測到的其他6條POD同工酶條帶的表達在鹽脅迫條件下均受到了明顯抑制，而Pr-2在鹽脅迫下表達顯著增強；在 ‘新泰密刺'中，鹽脅迫下，Pr-1，Pr-2，Pr-3，Pr-4，Pr-5和Pr-6的表達均顯著增強，Pr-7條帶在正常栽培和鹽處理中幾乎不可見。正常栽培條件下，‘津優1號'韌皮部滲出液中的POD同工酶表達強于 ‘新泰密刺'。

圖2　鹽脅迫對黃瓜幼苗葉片、韌皮部滲出液和根系POD同工酶表達的影響Figure 2　Effect of NaCl stress on the expression of POD isozymes in cucumber seedling leaf，phloem exudates and root

2.3鹽脅迫對過氧化氫酶（CAT）同工酶表達的影響

從圖3A可以看出：在4個處理中葉片均檢測到2條CAT同工酶條帶，即Cl-1，Cl-2（遷移率分別為6.68%和2.75%）。與對照相比，在脅迫條件下，‘津優1號'中Cl-1表達明顯增強，‘新泰密刺' 中Cl-1表達顯著減弱，而Cl-2在2個品種中均無明顯變化。正常栽培條件下，‘津優1號'葉片中的CAT同工酶表達相對 ‘新泰密刺'明顯較弱。如圖3B所示：在幼苗韌皮部滲出液4個處理中只檢測到1條CAT同工酶條帶，即Cp-1。與對照相比，脅迫條件下 ‘津優1號'CAT同工酶表達明顯受到了抑制，‘新泰密刺'則略有增強。正常栽培條件下，‘津優1號'韌皮部滲出液中的CAT同工酶表達相對 ‘新泰密刺'略弱。由圖3C可知：根系4個處理中只檢測到1條CAT同工酶條帶，即Cr-1。與對照相比，脅迫條件下2個黃瓜品種CAT同工酶均明顯增強。正常栽培條件下，‘津優1號'根系中的CAT同工酶表達比 ‘新泰密刺'強。

圖3　鹽脅迫對黃瓜幼苗葉片、韌皮部滲出液和根系CAT同工酶表達的影響Figure 3　Effect of NaCl stress on the expression of CAT isozymes on cucumber seedlings leaf，phloem exudates and root

3　討論

過量鹽分對植物造成滲透脅迫和干擾營養離子平衡，鹽分通過抑制和誘導多種酶系統表達和活力等，從而影響植物的生長。植物對逆境脅迫的響應之一就是通過抗氧化酶表達和活性進行調節，抗氧化酶調節在一定程度上可以緩解植物的過量鹽分積累對植物造成的毒害［15］。在正常生長的植物體內，活性氧（ROS）的形成和淬滅之間是保持動態平衡的，而當植物遭受鹽分等環境脅迫時，其動態平衡被打破，ROS積累導致細胞膜質氧化，引起植物的氧化損傷［16］。植物體內ROS的清除主要依靠以SOD，POD，CAT等抗氧化酶系統［17］，在保護機體免受ROS侵害方面發揮重要作用。

葉片和根系分別是植物進行光合作用、水分和營養吸收的重要器官，韌皮部是維管系統的重要組成部分，是輸導養分，并有支持、儲藏等功能的復合組織，三者在植物的生命活動和對外界的響應過程中起著至關重要的作用。因而，本研究對氯化鈉脅迫下黃瓜幼苗葉片、韌皮部滲出液及根系3個部位的抗氧化酶同工酶的表達情況進行了研究，從而更全面地反映不同耐鹽性的黃瓜品種在抗氧化酶同工酶表達上的差異和特點。植物遭受逆境引發ROS水平升高的同時，植物體內的抗氧化酶發生變化。SOD活性增加，將超氧陰離子自由基快速歧化為過氧化氫和分子氧，減少膜脂過氧化對植物造成的傷害［18］。POD 和CAT是植物體內擔負清除過氧化氫的主要酶類，廣泛存在于植物，雖然這2種酶的底物都是過氧化氫，但是CAT催化過氧化氫生成水和氧氣，POD催化過氧化氫氧化其他底物后生成水［19］。本研究中，在75.0 mmol·L－1的鹽脅迫下，‘津優1號'SOD同工酶在葉片中表達增強，韌皮部滲出液中下降，根系中無明顯規律。周珩等［20］研究表明：在鹽敏感的黃瓜品種 ‘津春2號'葉片SOD活性在鹽脅迫下上升，與本研究中SOD同工酶表達變化相一致。而在耐鹽性較強的 ‘新泰密刺'葉片和韌皮部中SOD同工酶表達與 ‘津優1號'完全相反，在根系6條SOD同工酶條帶中有2條相同條帶與 ‘津優1號'表達一致，均受到抑制。對于POD同工酶，2個品種在葉片中的表達趨勢一致，均下降，在韌皮部滲出液和根系（除1條條帶外）中相反。對于CAT同工酶，2個品種在葉片和韌皮部滲出液中表達變化趨勢相反，而在根系中均表現出上升的趨勢。DUAN等［21］研究發現：鹽脅迫下3 d后兩耐鹽性不同的黃瓜品種‘津春2號'和 ‘長春密刺'根系CAT活性均升高，與本試驗中根系CAT同工酶鹽脅迫下的表達趨勢一致。

綜上可知：在2個耐鹽性不同的黃瓜品種中，SOD同工酶在韌皮部、POD同工酶在韌皮部和根系及CAT同工酶在葉片和韌皮部中表達趨勢相反，在一定程度上說明3種同工酶分別在黃瓜幼苗的這些部分與其耐鹽性有密切關系。韌皮部滲出液中3種同工酶變化趨勢在2個品種中均完全相反，說明韌皮部在黃瓜幼苗耐鹽性的響應中具有重要意義，為通過韌皮部鑒定不同黃瓜品種的鹽耐性提供了借鑒，以及為黃瓜的耐鹽性研究提供了新的思路。同時我們還得出，品種耐鹽性不同，抗氧化酶同工酶變化趨勢相反有一定的組織或器官特異性，如POD同工酶僅在韌皮部滲出液和根系中變化趨勢相反，為我們通過研究特定組織或器官的抗氧化酶同工酶變化判斷植物耐鹽性提供了重要依據和參考，但植物的耐鹽性是一個復雜的數量性狀，其精確的機制尚需進一步研究。

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NaCl stress on antioxidant enzyme isozymes expressed in cucumber seedling leaves，phloem exudates，and roots

SUN Zhanghan1，FAN Huaifu1，2，DU Changxia1，2，HUANG Lingying1
（1.The Key Laboratory for Quality Improvement of Agricultural Products of Zhejiang Province，Zhejiang A&F University，Lin'an 311300，Zhejiang，China；2.School of Agriculture and Food Science，Zhejiang A&F University，Lin'an 311300，Zhejiang，China）

Cucumis sativus（cucumber）is frequently subjected to salinity in facility production，which seriously affects cucumber yield and quality.To determine the effect of NaCl stress on cucumber，the salt-sensitive cultivar Cucumis sativus‘Jinyou No.1'and relative salt-tolerant cultivar Cucumis sativus‘Xintai Mici'were used as experimental materials in this experiment.Seedlings were cultivated hydroponically with superoxide dismutase（SOD），peroxidase（POD），and catalase（CAT）isozyme expression being tested in cucumber seedling leaves，phloem exudates，and roots.Results for the leaves showed nine SOD isozyme bands，four POD isozymebands，and two CAT isozyme bands being detected.With NaCl stress in‘Xintai Mici'leaves，SOD，POD，and CAT isozymes were inhibited，but in‘Jinyou No.1'leaves they were enhanced.In phloem exudates，isozyme bands of three SOD，two POD，and one CAT were detected with NaCl stress enhanced in exudates of‘Xintai Mici'，but inhibited in‘Jinyou No.1'.In roots，isozyme bands from six SOD，seven POD，and one CAT were detected.The CAT isozyme expression in the roots of the two cultivars were enhanced；the six POD isozyme bands in‘Jinyou No.1'were enhanced，and one POD isozyme band was inhibited，but in‘Xintai Mici'the expression of all POD isozyme bands was enhanced.With NaCl stress three SOD isozymes were inhibited in both varieties，two SOD isozyme bands were enhanced in the‘Jinyou No.1'and they had no change in‘Xintai Mici'，and one SOD isozyme band had no change in‘Jinyou No.1'and its expression in the‘Xintai Mici' was inhibited.Thus，the three antioxidant enzymes were related to salt tolerance to some extent implying that the antioxidant enzyme response to salt stress possessed variety and tissue specificity；whereas，changes in the three isozymes for phloem exudates were completely opposite in two cultivars suggesting that the phloem was an important tissue in response to salt stress of cucumber seedlings.［Ch，3 fig.21 ref.］

botany；Cucumis sativus（cucumber）；antioxidant enzyme isozyme；salt stress

S642.2

A

2095-0756（2016）04-0652-06

10.11833/j.issn.2095-0756.2016.04.014

2015-07-03；

2015-12-25

國家自然科學基金資助項目（31201658，31101539）；浙江省自然科學基金資助項目（LY15C150006，Y3110308）；浙江農林大學科研發展基金人才啟動項目（2011FR018）

孫張晗，從事園藝植物生理生化等研究。E-mail：2863594991@qq.com。通信作者：杜長霞，副教授，博士，從事園藝植物生理生化等研究。E-mail：changxiadu@zafu.edu.cn